與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因、其Indel標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及與小麥葉片葉綠素含量 和粒重相關(guān)的基因、其Indel標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，隨著人口的增長(zhǎng)，耕地面積的減少以及糧 食生廣成本的不斷提尚，尚廣、超尚廣育種成為我國(guó)小麥育種中亟待解決的問題。小麥生 長(zhǎng)過程是不斷通過光合作用進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的過程，而綠色葉片是物質(zhì)生產(chǎn)的主要來源。在 適宜的條件下，小麥灌漿期間籽粒產(chǎn)量的大約70-90 %來源于花后旗葉制造的光合產(chǎn)物 (Austin等，1997 ;Bidinger等，1997)。因而，延長(zhǎng)小麥旗葉功能期，促進(jìn)葉片制造更多的 光合產(chǎn)物，從而提高產(chǎn)量是小麥高產(chǎn)的基礎(chǔ)。
[0003] 在高等植物中，葉綠素是葉綠體中重要的光合色素，在吸收和光能的使用中起著 重要的作用。有研究表明，灌漿期葉片葉綠素含量的下降顯著影響著植物的光合速率，從而 直接導(dǎo)致光合效率的下降（Araus等，1997)。Wang等（2008)在其研究中指出，增加葉綠素 含量是提高植物生物產(chǎn)量和粒重的一個(gè)有效途徑。
[0004] 在受到生物和非生物脅迫后，植物體內(nèi)的活性氧（reactiveoxygenspecies， R0S)含量將會(huì)增加，對(duì)細(xì)胞造成毒害，導(dǎo)致葉綠體損傷，從而造成光合速率的下降，最終影 響到粒重和產(chǎn)量。植物在進(jìn)化過程中形成了較完善的R0S清除酶系統(tǒng)，其中過氧化物還原 酶（peroxiredoxin，Prx)在保護(hù)葉綠體及其它細(xì)胞器免受氧化傷害中起到重要作用。植物 過氧化物還原蛋白BAS1是一個(gè)由核基因編碼的葉綠體蛋白，屬于AhpC家族。該蛋白是巰 基依賴的過氧化物酶，通過催化的Cys殘基還原過氧化氫，依賴NADPH的葉綠體硫氧還蛋白 還原酶保持BAS1的還原態(tài)。Ruiz等（2006)在水稻中證實(shí)了NTRC-BAS1通路是一種高效的 用于葉綠體免受氧化損傷的氧化還原系統(tǒng)。
[0005] 盡管目前在植物中對(duì)于過氧化物還原蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究較多，但其在植物 體內(nèi)的具體作用機(jī)制仍不完全清楚。小麥中關(guān)于Prx的研究報(bào)道較為少見，目前尚未發(fā)現(xiàn) 小麥BAS1基因的相關(guān)研究報(bào)道。關(guān)于BAS1基因的表達(dá)是否會(huì)影響葉片葉綠素的含量，以 及與粒重是否相關(guān)尚不明晰。因而，研究過氧化物還原酶基因BAS1為進(jìn)一步了解R0S清除 酶系統(tǒng)的作用機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)對(duì)于研究其在提高小麥產(chǎn)量和粒重中發(fā)揮的作用也具 有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因TaBASl_2B。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供與小麥基因TaBASl_2B共分離的Indel標(biāo)記及應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因 TaBASl-2B是通過電子克隆結(jié)合常規(guī)PCR方法獲得的。根據(jù)NCBI上公布的小麥硫氧還蛋白 過氧化物酶（Thiol-specificantioxidantprotein)的CDS序列（GenBank:AB000405. 1) 搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將篩選到的EST序列（CA484935. 1，CK214438. 1，CK217637. 1)進(jìn)行電 子拼接，以拼接序列為模板，利用PrimerPremier5. 0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)引物B1、B2和B3用于 小麥BAS1基因cDNA的獲得，另外兩對(duì)引物G1和G2用于小麥BAS1基因的獲得（引物信息 見表1)。
[0009] 表1用于擴(kuò)增小麥TaBASl-2B基因及其cDNA序列的引物
[0010]
[0012] PCR反應(yīng)分別以小麥品種'京411'的cDNA和基因組DNA為模板，然后將利用引物 Bl、B2和B3擴(kuò)增得到的產(chǎn)物依次經(jīng)過酶切連接，最終得到小麥BAS1基因的cDNA序列，大 小為846bp，將利用引物G1和G2擴(kuò)增得到的產(chǎn)物依次經(jīng)過酶切連接，最終得到小麥BAS1基 因全序列，大小為2856bp。利用小麥'中國(guó)春'缺體四體材料對(duì)該基因進(jìn)行定位，結(jié)果該基 因被定位于小麥2B染色體上，將該基因命名為TaBASl-2B。
[0013] 具體地，本發(fā)明提供的與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因TaBASl_2B，其核 苷酸序列為：
[0014]i)SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；或
[0015] ii) Seq IDNo.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列；或
[0016] iii)在嚴(yán)格條件下與Seq IDNo.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0017] 所述嚴(yán)格條件為在含0.1%SDS的0.1XSSPE或含0.1%SDS的0.1XSSC溶液中， 在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0018] 所述基因TaBASl_2B的cDNA序列如Seq ID No. 2所示。
[0019] 本發(fā)明還提供含有所述基因TaBASl-2B的載體、工程菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0020] 根據(jù)克隆獲得的基因TaBASl_2B序列，在'京411'和'紅芒春21'兩個(gè)品種間開 發(fā)出具有多態(tài)性的Indel標(biāo)記，利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)用于擴(kuò)增所述 Indel標(biāo)記的引物，并在194份小麥自然品種中分析其對(duì)表型的作用，最終開發(fā)出與所述基 因TaBASl-2B共分離的，且與小麥葉片葉綠素含量和粒重緊密相關(guān)的功能標(biāo)記。
[0021] 用于擴(kuò)增所述Indel標(biāo)記的引物對(duì)為：
[0022] 上游引物F:5' -CGCAGTGCCTGTCGTTTC-3'（SeqIDNo. 5)
[0023]下游引物R:5' -TCACATACTTCTTCCCAAT-3'（SeqIDNo. 6)
[0024] 所述引物對(duì)擴(kuò)增的與小麥葉片較高葉綠素含量和較高粒重相關(guān)的Indel標(biāo)記特 征條帶為494bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 3所示；所述引物對(duì)擴(kuò)增的與小麥葉片較低葉 綠素含量和較低粒重相關(guān)的Indel標(biāo)記特征條帶為493bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 4所 不。
[0025] 本發(fā)明的基因TaBASl_2B克隆及其Indel標(biāo)記開發(fā)的具體技術(shù)路線如圖1所示。
[0026] 本發(fā)明還提供所述Indel標(biāo)記在篩選葉片具有較高葉綠素含量和較高粒重的小 麥種質(zhì)資源中的應(yīng)用。包括如下步驟：
[0027] 1)提取待測(cè)植株的基因組DNA ;
[0028]2)以待測(cè)植株的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R(SeqIDNo. 5和6)，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0029] 3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能夠擴(kuò)增出如SeqIDNo.3所示核苷酸序列的特征條 帶，則待測(cè)植株為葉片具有較高葉綠素含量和較高粒重的小麥資源。
[0030] 其中，PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以10y1計(jì)為：模板DNA100ng，10yM引物F和R 各0.2 4 1，2.5禮（1犯130.8 4 1，51]/^1丁&9〇嫩聚合酶0.12 4 1，含2511111%2+的10\?0? 反應(yīng)緩沖液1. 0y1，ddH20補(bǔ)足至10y1。
[0031]PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C5分鐘；94°C50秒，58°C50秒，72°C3分鐘，36個(gè)循 環(huán)；72°C10分鐘。
[0032] 優(yōu)選地，步驟3)中采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后銀染 顯色。
[0033] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述Indel標(biāo)記在小麥分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明首次從小麥中分離克隆到與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因 TaBASl-2B，并根據(jù)所克隆的TaBASl-2B基因序列，在'京411'和'紅芒春21'兩個(gè)品種間開 發(fā)出具有多態(tài)性的Indel標(biāo)記，并在194份小麥自然品種中分析其對(duì)表型的作用，最終開發(fā) 出與基因TaBASl-2B共分離的，且與小麥葉片葉綠素含量和粒重緊密相關(guān)的功能標(biāo)記。該 Indel標(biāo)記能夠分別解釋小麥花后旗葉葉綠素含量及千粒重表型變異的8. 2%和4. 4%，其 中，分子量大小為494bp(SeqIDNo. 3)的條帶對(duì)粒重的增加具有增效作用，分子量大小為 493bp(SeqIDNo. 4)的條帶對(duì)粒重的降低具有增效作用。該分子標(biāo)記的開發(fā)為高產(chǎn)小麥分 子輔助育種提供了一條可行的途徑。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明的基因TaBASl_2B克隆及其Indel標(biāo)記開發(fā)的具體技術(shù)路線圖。
[0036] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中Indel標(biāo)記在不同小麥品種中的等位類型分析；其中，泳 道1為河農(nóng)972,泳道2為周麥16,泳道3為寶麥8,泳道4為渦麥8號(hào)，泳道5為安農(nóng)9267， 泳道6為魯麥23,泳道7為晉麥31，泳道8為周麥18,泳道9為安農(nóng)1014,泳道10為矮抗 58,泳道11為川麥42,泳道12為濟(jì)麥20,泳道13為泛麥5號(hào)，M為DNAMarker。
[0037] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中利用小麥'中國(guó)春'缺體四體材料對(duì)基因TaBASl_2B進(jìn)行 定位的結(jié)果；其中，泳道1為小麥'中國(guó)春'（CS)，泳道2-7分別為CSN2AT2B、CSN2AT2D、CSN2BT2A、CSN2BT2D、CSN2DT2A、CSN2DT2B。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0039] 以下實(shí)施例中測(cè)序由生工生物工程上海（股份）有限公司完成。
[0040] 實(shí)施例1小麥TaBASl-2B基因的獲得
[0041] 與小麥葉片葉綠素含量和粒重相關(guān)的基因TaBASl_2B是通過電子克隆結(jié)合常 規(guī)PCR方法獲得的。根據(jù)NCBI上公布的小麥硫氧還蛋白過氧化物酶（Thiol-specific antioxidantprotein)的CDS序列（GenBank:AB000405. 1)搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將篩選到 的EST序列（CA484935. 1，CK214438. 1，CK217637. 1)進(jìn)行電子拼接，以拼接序列為模板，利 用PrimerPremier5. 0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)引物Bl、B2和B3用于小麥BAS1基因cDNA的獲得， 另外兩對(duì)引物G1和G2用于小麥BAS1基因的獲得，引物信息見表1。
[0042] 表1用于擴(kuò)增小麥TaBASl_2B基因及其cDNA序列的引物
[0043]
[0044]PCR反應(yīng)分別以小麥品種'京411'的cDNA和基因組DNA為模板，在BIO-RADMy Cycler1. 0PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外燈下切 膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆測(cè)序，然后將引物Bl、B2和B3的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行拼接，最終得 到小麥BAS1基因的cDNA序列（SeqIDNo. 2)，大小為846bp，將引物G1和G2擴(kuò)增的產(chǎn)物 進(jìn)行拼接，最終得到小麥BAS1基因全序列（SeqIDNo. 1)，大小為2856bp。
[0045] 其中，PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以10y1計(jì)為：模板DNA100ng，10yM引物