版納甜龍竹NiR基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體涉及版納甜龍竹NiR基因及其應用。
【背景技術】
[0002]硝態(tài)氮(NO3)是旱田作物可利用氮素的主要形式。亞硝酸還原酶{nitritereductase, NiR)是氮素同化途徑的關鍵控制酶，與硝酸還原酶(Λ??)偶聯完成NO3的無機同化。前人研究表明，細胞色素C亞硝酸還原酶在氮代謝循環(huán)中起著關鍵的作用。而通過對水稻的研究表明，水稻的再生能力中硝酸鹽代謝途徑是一個非常重要的過程。Ozawa和Kawahigashi等(2006)克隆了水稻Konansou的AM基因，并將該基因在一個商業(yè)水稻品種Koshihikari中過表達。結果表明與野生型相比，導入的外源基因使植物生長情況良好，愈傷組織再生能力明顯提高。除水稻外，目前已在煙草、玉米、水稻、小麥、甜菜、大麥等重要作物中克隆到基因編碼序列，但未見對相關基因功能的深入研究。
[0003]竹子開花周期長、難以預測，且開花后通常死亡，給雜交育種工作帶來了困難。轉基因是有效的育種手段，高效再生體系的建立是轉基因的前提和基礎。由于竹子高效再生體系很難建立，竹子轉基因研究剛剛起步。提高竹子的再生能力，對竹子轉基因育種工作具有重要作用。版納甜龍竹hamiltonii )屬于禾本科竹亞科牡竹屬，是世界三大甜龍竹之一，為優(yōu)良的筍材兩用竹種。本課題組建立了版納甜龍竹的高效再生體系，并發(fā)現該竹種再生能力較強(Zhang et al.，2010)。本發(fā)明從再生能力較強的版納甜龍竹中克隆出伺源基因，研究其功能，發(fā)現在水稻遺傳轉化過程中包含該基因的基因克隆載體較作為對照的空載體具有更高的愈傷組織分化率和更快的分化成苗能力。因此，
基因可以應用于水稻的遺傳轉化，并有可能應用于再生比較困難的竹子以及其它禾谷類作物的遺傳改良。

【發(fā)明內容】

[0004]針對現有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供涉及版納甜龍竹基因及其應用的技術方案。
[0005]所述的版納甜龍竹Λ?感因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不O
[0006]所述的版納甜龍竹基因的編碼蛋白質，其特征在于該蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0007]所述的版納甜龍竹AM基因的擴增引物，其特征在于包括引物DhNiR-F和引物DhNiR-R，所述的引物DhNiR-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的引物DhNiR-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]所述的包含權利要求1所述的版納甜龍竹AMg因的植物表達載體。
[0009]所述的版納甜龍竹AM基因在提高植物再生能力的應用。
[0010]所述的版納甜龍竹基因在提高水稻再生能力的應用。
[0011]本發(fā)明的有益效果:轉化的水稻經篩選得到含有基因的轉基因水稻，實驗證明該基因能夠提高植物的再生能力，轉重組質粒pCambial301-DhNi麻pCambial301空兔質粒水稻在綠點愈傷率和分化苗時間上都表現出差異。本發(fā)明提供的版納甜龍竹基因為基因工程改良植物的再生能力提供了一種技術手段，具有廣泛的應用價值。
【附圖說明】
[0012]圖1為表達載體pCemb i a 1301-DhNi囀后M分轉基因水稻PCR鑒定圖。
[0013]圖2轉DhN麻空載水稻轉化率圖。
[0014]圖3轉財P空載水稻綠點愈傷率圖。
[0015]圖4轉基因和空載的日本晴和中花11的分化情況圖；
圖4中:a空載(中花11); b轉DhNiR (中花11) ;c空載(日本晴)；d轉DhNiR (日本晴)。
【具體實施方式】
[0016]以下結合實施例來進一步說明本發(fā)明。
[0017]實施例1:版納甜龍竹AM基因(DhNiR)的克隆及分析
(I)以版納甜龍竹新葉為材料，提取其總RNA，采用M-MLV反轉錄酶(TaKaRa公司)逆轉錄合成cDNA第一鏈。
[0018](2)以水稻基因序列為參照序列，在毛竹轉錄組數據庫中進行篩選，得到了一個毛竹AMS因序列，再根據毛竹AM序列，設計DhNiR-F和DhNiR-R引物；以版納甜龍竹逆轉錄合成的cDNA為模板進行擴增，將擴增的PCR產物進行膠回收并與PMD-18T載體16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌后挑選單克隆送往生物公司測序。
[0019]引物DhNiR-F:ATGACATCCTCAGCCTCCCTGC (如 SEQ ID N0.3 所示)；
DhNiR-R:CTATTCCTCATCCTCCTCCCTCTCC (如 SEQ ID N0.4 所示)
(3)將測序結果用生物軟件DNAMAN分析可得，ZiWiW基因ORF全長1779bp (如SEQ IDN0.1所示)，編碼593個氨基酸(如SEQ ID N0.2所示)。
[0020]實施例2:農桿菌介導的水稻轉化
(I)將DhNiR基因的ORF區(qū)通過同源重組技術連入植物表達載體pCAMBIA1301々，取建重組質粒pCamb i a 1301 -DhNiR-M覓電轉化法將重組質粒和pCamb i al 301空兔質MM K農桿菌H1105。
[0021](2)水稻愈傷組織的誘導:取水稻成熟種子脫殼，挑選飽滿干凈無斑的種子，用70%酒精先給種子表面消毒Imin左右；然后倒去酒精，加入3% NaClO溶液，再加吐溫-20(每50 mL加I滴)后真空抽濾30 min ;倒去NaClO溶液，用無菌蒸餾水清洗種子5次。
[0022]誘導與繼代培養(yǎng)(需要無菌操作條件):種子放在滅過菌的濾紙上在超凈工作臺上吹干，將成熟胚放在誘導培養(yǎng)基中(胚緊貼培養(yǎng)基)，每皿20顆左右；操作完畢用封口膜封好，在30°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)15天；在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然散落的淡黃色的且致密的呈球狀的胚性愈傷組織，在26°C條件下暗培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)2周，繼代2次。
[0023](3)預培養(yǎng):將繼代2次的狀態(tài)較好的愈傷顆粒，接種到預培養(yǎng)基26°C暗培養(yǎng)4天。
[0024](4)農桿菌的培養(yǎng):把_70°C保存的菌種首先在含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的YEP固體培養(yǎng)基上活化，在28°C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2天。在愈傷預培養(yǎng)的第2天，用含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基劃線接種活化后的農桿菌菌株(I個菌落劃一環(huán)，共3環(huán))，28 °(:靜止培養(yǎng)2天。用鑰匙將農桿菌(I環(huán)-1環(huán)半)刮入30 ml含100-200 MmoI/L As的AAM培養(yǎng)基(提前配置，滅菌)，使菌液0D600的終濃度為0.01。
[0025](5)感菌與共同培養(yǎng):將預培養(yǎng)后的良好的水稻愈傷組織接入100 mL錐形瓶中，加入重懸好的農桿菌懸浮液侵染30分鐘左右，期間不停搖動菌液；倒去菌液，將愈傷組織取出后置于滅過菌的濾紙上吸干表面菌液；然后將愈傷組織放置在共培養(yǎng)基上，且共培養(yǎng)基上表面墊上一層滅過菌濾紙上，26°C條件下暗培養(yǎng)3天。
[0026](6)愈傷組織的抗生素篩選:共培養(yǎng)后的愈傷組織開蓋無菌風吹1min左右，然后直接轉入第一輪篩選培養(yǎng)基。一皿30顆愈傷，無菌風吹20 min左右，封蓋暗培。第一輪篩選:將愈傷轉入含500 mg/L羧芐青霉素(Cn)和40 mg/L潮霉素選擇培養(yǎng)基上，26°C條件下暗培養(yǎng)14天；然后將愈傷組織轉到含有500 mg/L羧芐青霉素(Cn)和50 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上進行選擇，26°C條件下暗培養(yǎng)，2周篩選一次，共篩選培養(yǎng)2次。
[0027](7)水稻的抗性愈傷組織誘導分化和生根:將通過篩選培養(yǎng)后的抗性愈傷組織轉入預分化培養(yǎng)基中，26°C條件下暗培養(yǎng)6天。然后將預分化培養(yǎng)后的抗性愈傷轉到分化培養(yǎng)基中，26°C條件下，光照強度2400Lx培養(yǎng)，分化出轉基因植株。待小苗長到5cm高左右，直接轉入生根培養(yǎng)基上生根。將根系健壯的植株經煉苗移栽后，然后移到自然條件下生長，直至成熟。
[0028]實施例3:轉基因植株的分子鑒定
取轉化分化成苗的水稻植株的葉片，采取改良的CTAB法提取基因組DNA。采用TaKaRa的rTaq酶，利用DhNiR-F和DhNiR-R引物參照試劑說明書進行PCR擴增。反應體系如下:F 引物 IuUR 引物 lul、DNA 模板 IulUOxbuffer 2ul、dNTPl.6ul、酶 0.4ul，加水至20ul。擴增程序如下:94°C預變性3min、94°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸2min、30個循環(huán)、72 °C最終延伸7min、4°C保存。
[0029]如圖1所示，成功轉入水稻植株中。
[0030]實施例4: 轉基因水稻再生能力分析
通過農桿菌介導法將帶有ΡΜ?Α基因的載體和空載轉入水稻(日本晴和中花11)愈傷組織中。將轉化基因和轉化空載的愈傷組織在光下進行分化，對愈傷組織綠點率和轉化率進行統(tǒng)計。利用excel進行數據分析，以此來分析其對水稻再生能力的影響，如圖2和3所示。
[0031]愈傷組織綠點率=變綠的愈傷組織數/實驗的愈傷組織數X 100%
轉化率=轉化成功的水稻植株數/轉化的總植株數X 100%
表達載體和空載分別轉入水稻愈傷組織(日本晴和中花11 )，轉入分化培養(yǎng)基30d后，對結果進行統(tǒng)計表明，轉財P空載的日本晴綠點愈傷率分別為27%和17%，轉財P空載的中花11綠點愈傷率分別為37%和30% ;轉基因的日本晴和中花11植株轉化成功率分別為60%和48%，轉空載的日本晴和中花11植株轉化成功率分別為20%和25%。轉的日本晴和中花11的愈傷比空載提前I周左右分化出苗，如圖4所示。說明在水稻的再生能力提高方面發(fā)揮積極作用。
【主權項】
1.版納甜龍竹AM基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示。2.如權利要求1所述的版納甜龍竹基因的編碼蛋白質，其特征在于該蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.版納甜龍竹AMg因的擴增引物，其特征在于包括引物DhNiR-F和引物DhNiR-R，所述的引物DhNiR-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的引物DhNiR-R的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。4.包含權利要求1所述的版納甜龍竹基因的植物表達載體。5.如權利要求1所述的版納甜龍竹基因在提高植物再生能力的應用。6.如權利要求1所述的版納甜龍竹基因在提高水稻再生能力的應用。
【專利摘要】版納甜龍竹NiR基因及其應用，屬于分子生物學技術領域。本發(fā)明一方面提供了版納甜龍竹NiR基因序列以及該基因序列編碼的蛋白質氨基酸序列，另一方面提供了該版納甜龍竹NiR基因的應用。本發(fā)明的有益效果：轉化的水稻經篩選得到含有<i>NiR</i>基因的轉基因水稻，實驗證明該基因能夠提高植物的再生能力，轉重組質粒<i>pCambia1301-DhNiR</i>和<i>pCambia1301</i>空載質粒水稻在綠點愈傷率和分化苗時間上都表現出差異。本發(fā)明提供的版納甜龍竹<i>NiR</i>基因為基因工程改良植物的再生能力提供了一種技術手段，具有廣泛的應用價值。
【IPC分類】C12N15/53, A01H5/00, C12N15/11, C12N15/82, C12N9/06
【公開號】CN105132441
【申請?zhí)枴緾N201510630594
【發(fā)明人】林新春, 朱龍飛, 姬麗粉, 臧巧路, 王曉芹
【申請人】浙江農林大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月29日