菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因及編碼的抗菌多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素 CvT-Def基因及其所編碼的抗菌多肽，尤其涉及所述基因在制備具有抗菌活性的人工合成 多肽中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用，致使許多病原菌對(duì)它們產(chǎn)生了耐藥性，開發(fā)新型 綠色抗生素也變得日益重要。由于抗菌肽具有抗菌能力強(qiáng)，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性等特 點(diǎn)，在醫(yī)藥、天然食品防腐劑等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，因此成為研究抗菌藥物的研究熱 點(diǎn)。天然抗菌肽的含量極微、分離難度大，化學(xué)合成和基因工程便成為獲取抗菌肽的主要手 段。
[0003] 抗菌肽種類多，防衛(wèi)素（Defensin)是其中一類，是一種陽離子的多肽。由29~54 個(gè)氨基酸殘基組成，含有6~8個(gè)保守的半胱氨酸（通常是6個(gè)），分子量小于5KDa。N端 有3個(gè)0轉(zhuǎn)角和1個(gè)y轉(zhuǎn)角，中間有1個(gè)兩親性的a螺旋，C端有1個(gè)反向平行的0折 疊，由3~4個(gè)二硫鍵連接a螺旋和0轉(zhuǎn)角，形成特定的CSa0結(jié)構(gòu)防衛(wèi)素可在特定的 細(xì)胞中合成并貯存于細(xì)胞質(zhì)的顆粒中，或被病原微生物誘導(dǎo)合成，對(duì)多種微生物均具有較 強(qiáng)的防御能力，主要作用于病原微生物的細(xì)胞膜，使病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性，防衛(wèi)素 是目前頗具吸引力的一類新型候選抗菌藥物。
[0004] 菜蛾盤絨繭蜂是防治小菜蛾的主要優(yōu)勢(shì)寄生性天敵，該蜂擁有目前國際上研究所 揭示的幾乎所有的寄生蜂因子（多分DNA病毒、畸形細(xì)胞、毒液），畸形細(xì)胞（Teratocytes) 是菜蛾盤絨繭蜂卵在寄主體內(nèi)發(fā)育過程中由蜂卵的漿膜層解離下來的一種特殊細(xì)胞。這類 細(xì)胞能夠向胞外分泌功能蛋白，對(duì)寄主的生理起調(diào)控作用，其中也包括一些抗菌多肽。目 前，對(duì)菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌肽的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)目前菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌肽研究狀況及 其不足，提供一種菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因及編碼的抗菌多肽。
[0006] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0007] 提供一種菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因，該基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了由權(quán)利要求1所述菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def?基 因編碼的抗菌多肽，該抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種人工合成的抗菌多肽，是將前述菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi) 素CvT-Def?基因編碼的抗菌多肽去除信號(hào)肽前體后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3 所示。
[0010] 本發(fā)明中，該人工合成的抗菌多肽是采用固相化學(xué)法合成的。
[0011] 本發(fā)明還提供了前述抗菌多肽在制備用于治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感 染的食品防腐或抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明原理描述：
[0013] 本發(fā)明中，菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素基因cDNA的克隆方法是以菜蛾盤絨繭 蜂畸形細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫。構(gòu)建抗菌肽數(shù)據(jù)庫，與菜蛾盤 絨繭蜂畸形細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組本地Blast篩選得到Defensin部分cDNA序列，然后經(jīng)RACE方法擴(kuò) 增得到末端序列，最后經(jīng)序列拼接獲得菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素Defensin基因cDNA 全長序列。
[0014] 合成抗菌肽是根據(jù)天然抗菌肽序列結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成的，序列來源為SEQ ID NO. 2去除信號(hào)肽前體，其制備方法可以是固相化學(xué)法。
[0015] 作為本發(fā)明菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def的改進(jìn)包括：菜蛾盤絨繭蜂畸 形細(xì)胞抗菌多肽CvT-Def為多肽，其保守性變異多肽、其活性片段或活性衍生物。利用瓊脂 擴(kuò)散法檢測(cè)多肽的抗菌活性，氨芐青霉素為對(duì)照，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明本發(fā)明合成 的抗菌肽具有抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的活性。
[0016] 在本發(fā)明中菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防衛(wèi)素CvT-Def基因或多肽指：具有該菜蛾盤絨 繭蜂抗菌肽防衛(wèi)素CvT-Def活性的SEQ ID N0. 3序列多肽。該術(shù)語還包括具有與天然該菜 蛾盤絨繭蜂抗菌肽防衛(wèi)素CvT-Def相同功能的SEQ ID N0. 3序列的變異形式。這些變異形 式包括：若干個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨 基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的 功能。
[0017] 在本發(fā)明中菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因保守性變異多肽指：與 SEQ ID N0. 3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似 或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
[0018] 本發(fā)明還包括菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌肽防衛(wèi)素CvT-Def基因或多肽的類似 物。這些類似物與天然抗菌多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列 的修飾形式上的差異，或者兼而有之。其中修飾形式包括：在不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下，體 內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；?、羥基化或糖基化。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0020] 本發(fā)明通過基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，以菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料， 通過基因注釋和與已有抗菌肽序列進(jìn)行比對(duì)，篩選其表達(dá)的抗菌肽核苷酸序列片段，并通 過RACE方法得到抗菌肽cDNA核苷酸序列全長。得到全長抗菌肽cDNA核苷酸序列后，根據(jù) 其編碼的氨基酸序列，利用固相化學(xué)快速合成多肽，并應(yīng)用于抗菌檢測(cè)。
[0021] 本發(fā)明所提供的菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因及其編碼的氨基酸 序列，是一種膜翅目昆蟲源的新的抗菌蛋白，能被開發(fā)為具有應(yīng)用價(jià)值的食品添加劑和物 并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品衛(wèi)生和工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0022] 圖1:菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌肽基因篩選策略。
[0023] 圖2:菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞防衛(wèi)素CvT-Def基因驗(yàn)證。
[0024] 圖3:瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)試合成菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌多肽防衛(wèi)素CvT-Def對(duì) 大腸桿菌的抑制效果圖，其中A:氨芐青霉素；C:陰性對(duì)照：0. 01%醋酸溶液；1 :1.Omg/ml 樣品；2 :0? 5mg/ml樣品；3 :0? 25mg/ml樣品；4 :0? 125mg/ml樣品；5 :0? 063mg/ml樣品。
[0025] 圖4:瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)試合成菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌多肽防衛(wèi)素CvT-Def 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果圖，其中A:氨芐青霉素；C:陰性對(duì)照：0. 01 %醋酸溶液；1 : 1.Omg/ml樣品；2 :0? 5mg/ml樣品；3 :0? 25mg/ml樣品；4 :0? 125mg/ml樣品；5 :0? 063mg/ml 樣品。
[0026] 圖5:瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)試合成菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌多肽防衛(wèi)素CvT-Def 對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果圖，其中A:氨芐青霉素；C:陰性對(duì)照：0. 01 %醋酸溶液；1 : 1.Omg/ml樣品；2 :0? 5mg/ml樣品；3 :0? 25mg/ml樣品；4 :0? 125mg/ml樣品；5 :0? 063mg/ml 樣品。
[0027] 圖6:瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)試合成菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌多肽防衛(wèi)素CvT-Def對(duì) 白色念珠菌的抑制效果圖，其中A:氨芐青霉素；2 :陰性對(duì)照：0. 01 %醋酸溶液；3 :1.Omg/ ml樣品；4 :0? 5mg/ml樣品；5 :0? 25mg/ml樣品；6 :0? 125mg/ml樣品；1 :0? 063mg/ml樣品。 具體實(shí)施方案
[0028] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但實(shí)施例實(shí)并不對(duì)本發(fā) 明做任何形式的限定。
[0029] 下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方案，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHaeborLaboratoryPress, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。
[0030] 實(shí)施案例1 :菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選
[0031]首先從各網(wǎng)站（APD:http://www. bicnirrh. res. in/antimicrobial/ ; CAMP:http://aps. unmc. edu/AP/main. php ；NCBI :http://www. ncbi. nlm. nih. gov)收集盡 量已知所有的抗菌肽序列建立抗菌肽數(shù)據(jù)庫，然后與菜蛾盤絨繭蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行本 地BlastX，得到與已知抗菌肽序列相似或同源的部分抗菌肽序列。然后利用RACE技術(shù)，得 到該片段的全長，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，提交NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，并根據(jù)該序列6個(gè)半胱氨酸排 列特征，推測(cè)該序列屬于昆蟲防衛(wèi)素家族。整個(gè)數(shù)據(jù)篩選策略如圖1所示。
[0032] 實(shí)施案例2:菜蛾盤絨繭蜂畸形細(xì)胞抗菌多肽防衛(wèi)素（CvT-Def)cDNA克隆
[0033] 1. 1畸形細(xì)胞的收集
[0034] 在一只長5cm、直徑1. 5cm的小試管內(nèi)引入羽化2天已交配過的菜蛾盤絨繭蜂雌 蜂1頭，然后用毛筆挑取一頭3齡中期小菜蛾幼蟲放入管內(nèi)，觀察產(chǎn)卵行為發(fā)生兩次后用 毛筆移出幼蟲，換另一頭未寄生的幼蟲重復(fù)操作，控制每頭雌蜂寄生30頭左右。寄生后 的小菜蛾幼蟲于25土1°C、75%相對(duì)濕度的條件下分別飼喂3、4、5、6、7天后解剖。解剖 時(shí)，將小菜蛾從