一種測定rhCNB含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種測定rhCNB含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是一種具有復(fù)雜的空間立體結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，易受外界條件的影響發(fā)生 變性。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與組成中的氨基酸種類有關(guān)系，最常見的是半脫氨酸，蛋白質(zhì)對空氣中 的氧較為敏感，容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，形成一系列聚合物。
[0003] 巧調(diào)憐酸酶(化1C i neur i η, CN)是目前所知唯--種依賴化2 YCaM (巧調(diào)素）的蛋白 憐酸酶，由A，B亞基W1:1的比例組成。A亞基(CNA)是催化亞基，B亞基(CNB)是調(diào)節(jié)亞基。CN 在免疫激活通路中發(fā)揮重要作用，示T細胞活化的關(guān)鍵沒。CN作為大分子酶蛋白，易失活，不 穩(wěn)定，而CNB作為該酶的調(diào)節(jié)亞基，能促進CAN的活性，且相對分子質(zhì)量小，性質(zhì)穩(wěn)定。由研究 表明CNB能刺激T細胞和NK細胞增殖W及增強NK細胞的殺傷活性，增強巨隧細胞吞隧能力等 免疫功能，且重組人巧調(diào)憐酸酶B亞基（Recombinant human Calcineurin B subunit, rhCNB)是開發(fā)中的基因工程創(chuàng)新腫瘤藥物。
[0004] rhCNB具有明顯的殺傷腫瘤細胞的作用，單體是一種含有兩個琉基結(jié)構(gòu)的蛋白，在 生產(chǎn)、放置等過程中，易受溫度、水分、pH值、光照、氧化等因素影響形成二聚體、Ξ聚體等多 聚體結(jié)構(gòu)，造成各組分比例不穩(wěn)定，無法準(zhǔn)確測定其量。其純化工藝中又需要用到緩沖鹽、 絡(luò)合劑、金屬離子、氧化還原性物質(zhì)等等對蛋白測定有干擾的物質(zhì)。
[000引傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測量方法普遍存在專屬性弱、準(zhǔn)確度低、重復(fù)性差、操作復(fù)雜、易受 干擾等等缺點。蛋白質(zhì)在純化過程中往往含有各種干擾性物質(zhì)或者目標(biāo)蛋白自身組分復(fù)雜 等問題，造成目標(biāo)蛋白在各工藝步驟中回收率難W準(zhǔn)確計算。
[0006] 凱氏定氮法缺點:①主要針對氮為負Ξ價的有機氮化合物，不包括疊氮化合物，聯(lián) 氮，偶氮，腺，硝酸鹽，亞硝酸鹽，硝基，臘，目虧和半卡己腺類的含氮化合物，導(dǎo)致最終測定的 是總有機氮，而不只是蛋白質(zhì)氮;②精度差;③所用試劑有腐蝕性等問題。
[0007] Lowry法缺點：①對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的 蛋白質(zhì)，有一定的誤差.故該法適于測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。②若樣品 中含有嚷嶺、喀晚、核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。
[0008] Folin酪法缺點：①費時，要精確控制操作時間；②試劑的配制比較繁瑣且酪類和 巧樣酸、硫酸錠、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原型DTT、琉基乙醇、EDTA、脈素均會干 擾反應(yīng)。
[0009] 紫外吸收法缺點①測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差;②干擾物質(zhì)多，若樣 品中含有嚷嶺、喀晚及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。
[0010] 考馬斯亮藍法缺點：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此 用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。
[0011] 雙縮脈法缺點①靈敏度差;②化is、一些氨基酸和邸TA等會干擾該反應(yīng)。
[0012] 2010版《中國藥典》Ξ部附錄VIU采用高效液相法及Ci8色譜柱梯度洗脫檢測重組人 粒細胞集落刺激因子方法，對疏水性相近的蛋白質(zhì)分辨率較低。
[0013] 因此，提供一種準(zhǔn)確測定重組人巧調(diào)蛋白憐酸酶B亞基蛋白質(zhì)含量的方法具有重 要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種測定rhCNB含量的方法。該方法能夠準(zhǔn)確測定rhCNB的 含量，排除使用經(jīng)典方法所帶來的重復(fù)性差、抗干擾能力低、結(jié)果不準(zhǔn)確等問題。
[0015] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0016] 本發(fā)明提供了一種現(xiàn)憶rhCNB含量的方法，包括如下步驟：
[0017] 步驟1:取rhCNB粗品，與還原劑混合發(fā)生還原反應(yīng)，制得供試品溶液；
[0018] 步驟2:取所述供試品溶液、已經(jīng)標(biāo)定的化CNB對照品分別經(jīng)高效液相色譜測定，按 照外標(biāo)法W峰面積獲得rhCNB的含量。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述還原劑為還原型DTT(二硫蘇糖醇）、還原型 谷脫巧膚、β-琉基乙醇、棚氨化鋼或亞硫酸氨鋼中的一種或兩者W上的混合物。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度為80°C~100°C，所述 還原反應(yīng)的反應(yīng)時間為15~60min。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述還原劑的使用量至少為所述rhCNB粗品的 蛋白量的l%(w/w)。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，Wg/mol計，所述rhCNB粗品（折純重組人巧調(diào)蛋 白憐酸酶B亞基6. Omg)與所述還原劑的質(zhì)量摩爾比為6:0.08。
[0023] 在本發(fā)明中，所述rhCNB粗品（折純重組人巧調(diào)蛋白憐酸酶B亞基6.Omg)是指將被 檢測蛋白調(diào)到運個濃度附近可W得到準(zhǔn)確度更高的結(jié)果。一般蛋白樣品在制備提取時是采 用色譜層析等純化技術(shù)獲得的，層析的過程中一般有280nm、214nm等圖譜，根據(jù)收集樣品量 和吸收峰的高度大概可知蛋白濃度，運是一個經(jīng)驗值。對于完全未知濃度的樣品可W先預(yù) 配一個濃度的樣品測定后再進行重新稀釋或者濃縮使指符合檢測要求;也可W通過紫外等 簡易粗略的的方法來測定其大概濃度，再由高效液相進行精密測定。
[0024] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述還原反應(yīng)還需堿性環(huán)境;所述堿性環(huán)境包 括添加金屬氨氧化物、強堿弱酸鹽、TRIS生物堿或堿性氨基酸中的一種或兩者W上的混合 物。
[0025] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，Wg/mL計，所述rhCNB粗品（折純重組人巧調(diào)蛋 白憐酸酶B亞基6. Omg)與所述金屬氨氧化物的質(zhì)量體積比為6:40。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述供試品溶液的濃度為0.6mg/mL。
[0027] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述高效液相色譜采用凝膠柱，W含異丙醇的 憐酸鹽緩沖液pH7.0溶液為液動相。
[0028] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述流動相的流速為0.7mL/min。
[0029] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述高效液相色譜的檢測波長為280nm。
[0030] 本發(fā)明具體設(shè)及了一種能夠準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)含量的方法。通過還原型DTT或其他 還原劑打開各種聚合物的二硫鍵形成均一穩(wěn)定的單體結(jié)構(gòu)，使用高效液相和凝膠色譜柱進 行分析后采用面積歸一化法計算其含量。
[0031 ]本發(fā)明提供了一種測定rhCNB含量的方法，包括如下步驟:步驟1:取rhCNB粗品，與 還原劑混合發(fā)生還原反應(yīng)，制得供試品溶液;步驟2:取所述供試品溶液、已經(jīng)標(biāo)定的rhCNB 對照品分別經(jīng)高效液相色譜測定，按照外標(biāo)法W峰面積獲得RhCNB的含量。本發(fā)明在研究 rhCNB項目的過程中，發(fā)現(xiàn)rhCNB由于二硫鍵的形成，產(chǎn)生了單體、二聚體、Ξ聚體、四聚體等 一系列聚合物。其含量的測定因組分比例的不同而出現(xiàn)較大偏差重復(fù)性較差。對含有rhCNB 的多組分樣品進行還原，得到單一rhCNB單體的樣本。再采用高效液相和凝膠柱進行測定， 既排除了各種無機鹽和含氮小分子又排除了雜蛋白、核酸等大分子的干擾，得到單一的目 標(biāo)峰。該方法專屬性好、抗干擾性強、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性高。為驗證該方法的專屬性、抗干擾 性、準(zhǔn)確性W及重復(fù)性，在實施例中對樣品加入各種類型的干擾物質(zhì)仙15、66了4伯 2+、構(gòu)祿 酸鹽緩沖液、小分子鹽類及氨基酸），均取得良好結(jié)果。
[0032] 本發(fā)明相較凱氏定氮法、Lowry法(福林酪法）、雙縮脈法等經(jīng)典方法，本法具有專 屬性好、準(zhǔn)確度高、簡便易行等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0033] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0034] 圖1示實施例2的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、TRIS等小分子、最 后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0035] 圖2示實施例3的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、巧樣酸根峰、最后 一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0036] 圖3示實施例4的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后 一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0037] 圖4示實施例5的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、還原 型DTT及其衍生物氧化型DTT、最后一個峰是色氨酸峰，金屬離子(Ca 2+)的峰未有明顯吸收峰 即使有吸收也在DTT附近遠離目標(biāo)蛋白峰；
[0038] 圖5示實施例6的色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后一個峰 是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0039] 圖6示實施例6的色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后一個峰 是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0040] 圖7示實施例6的色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后一個峰 是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0041] 圖8示實施例6的色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后一個峰 是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0042] 圖9示實施例6的色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸根峰、最后一個峰 是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0043] 圖10示實施例7中重復(fù)1的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0044] 圖11示實施例7中重復(fù)2的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0045] 圖12示實施例7中重復(fù)3的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0046] 圖13示實施例7中重復(fù)4的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0047] 圖14示實施例7中重復(fù)5的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT;
[0048] 圖15示實施例7中重復(fù)6的色譜圖；色譜圖中各吸收峰依次是目標(biāo)蛋白峰、構(gòu)祿酸 根峰、最后一個峰是還原型DTT及其衍生物氧化型DTT。
【具體實施方式】
[0049] 本發(fā)明公開了一種測定rhCNB含量的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容，適 當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進 行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用 進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0050] 本發(fā)明的主要目的是準(zhǔn)確測定rhCNB的