專利名稱：解淀粉芽孢桿菌添加前體物發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生化工程領域，涉及一種基因工程菌添加前體物發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的工藝。
背景技術：
利巴韋林(ribavirin)，化學名為1-β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三氮唑_3_羧酰胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑制作用，在抗病毒臨床實踐中得到廣泛應用。利巴韋林生產(chǎn)方法有化學合成法、發(fā)酵法和酶法三類。目前，國內(nèi)在工業(yè)生產(chǎn)上實施的化學合成法占絕大多數(shù)，存在副產(chǎn)物多，產(chǎn)率低，操作步驟多，污染嚴重，成本高等不足。酶法生產(chǎn)利巴韋林由Witkowski等首創(chuàng)，在上個世紀80、90年代發(fā)展起來，隨后被廣泛應用于利巴韋林的生產(chǎn),但酶法生產(chǎn)利巴韋林的酶源細胞生產(chǎn)成本較高,必須先經(jīng)過對菌體進行分離后才能投入到反應中，菌體培養(yǎng)過程與利巴韋林生產(chǎn)過程分為兩個階段，不能實現(xiàn)偶聯(lián)，且需要維持較高的反應溫度。添加前體物發(fā)酵法(日本公開專利17830/1979)具有原料成本低，來源廣泛，能耗低，菌體培養(yǎng)與利巴韋林生產(chǎn)的過程同步進行等優(yōu)點，但是到目前為止，此法產(chǎn)量較低，仍然處于實驗室研究階段，不能投入到 工業(yè)生產(chǎn)當中，其關鍵原因在于:由于技術瓶頸，目前的利巴韋林生產(chǎn)菌株不能兼具高效生產(chǎn)核苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題，提供一種利用解淀粉芽孢桿菌添加前體物發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝。該工藝以鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208為改造對象，大幅度提高了該菌合成嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的能力，突破了一直以來不能突破的瓶頸，實現(xiàn)只要在培養(yǎng)基中添加前體物TCA (I, 2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)就可以直接生產(chǎn)利巴韋林。其優(yōu)點在于工藝簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，糖苷轉(zhuǎn)化率高，不需要高溫條件，降低了利巴韋林的生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌添加前體物發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝，其步驟如下:A、利用分子生物學技術以鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208作為宿主菌構建兼具高效表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):利用PCR技術從枯草芽孢桿菌BS168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pupG，與經(jīng)過改造的表達載體PBSA43連接，構建了具有較高表達效率和很高質(zhì)粒穩(wěn)定性的分泌型表達載體pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)，詳細過程見實施例1。
(注:鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208的選育及發(fā)酵工藝的研究由本實驗室的武改紅于2005年完成；編碼高酶活力的嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達、重組蛋白純化及酶學性質(zhì)研究由本實驗室的夏俊剛于2010年12月在《中國生物工程雜志》第30卷第12期發(fā)表。經(jīng)進一步改造獲得的利巴韋林工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)現(xiàn)保藏于天津科技大學代謝工程研究室。)B、工程菌添加前體物發(fā)酵:將步驟A中獲得的經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌種RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行工程菌添加前體物發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應為8% 12%，氮碳比N: C應介于10:100 15:100之間，無機鹽含量應為0.1% 12%，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH7.2 7.8，培養(yǎng)溫度33°C 35°C，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)60 80h，接種量為5% 10% (V/V)，發(fā)酵過程中，添加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值維持在7.0 7.4，發(fā)酵開始12-24h添加TCA。(I).發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖8% 12%,酵母膏0.8% 1.0%,豆?jié)?.6% 2%,玉米漿1% 2%, (NH3) 2S041% 1.5%, MgSO4.7Η20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L，自來水 96% 98%，培養(yǎng)基pH值為7.0 7.4。(2).發(fā)酵控制工藝采用5L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度33 35°C，空氣流量為0.8 8.0L/min,罐壓0.001
0.006MPa,溶氧維持在15 40%，發(fā)酵pH值控制在7.0 7.4，發(fā)酵開始12_24h添加TCA，繼續(xù)發(fā)酵至60-80h結束。C、產(chǎn)物利巴韋林定量分析:
取樣離心，取上清液經(jīng)無菌去離子水稀釋適當倍數(shù)，采用高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC)定量檢測利巴韋林。工作條件為:Agilent1200型高效液相色譜儀；檢測器VWD (可變波長紫外檢測器)；檢測波長207nm ;進樣器標準型自動進樣器；進樣量5μ L ;色譜柱Kromasil C18，5 μ，250mmX 4.6mm ;流動相水:乙腈=96:4 (V/V);柱溫 300C ;流速 lml/min。利巴韋林轉(zhuǎn)化率定義:
產(chǎn)物利巴韋林質(zhì)量 x1_/
_化率(％)=———.........................................................................Xl00%
雌葡萄_量本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果I)采用基因工程手段，突破了鳥苷高產(chǎn)和PNPase高效表達無法在同一株菌上得到實現(xiàn)的瓶頸，使PNPase得以在鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌ΤΑ208中得到高效表達，并且能很好的分泌到培養(yǎng)基中且保持活性，較改造之前的PNPase活力有大幅度提高。2)操作簡單，采用傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝、設備使本發(fā)明容易實現(xiàn)普及，發(fā)酵溫度控制在33 35°C，避免為了維持較高的轉(zhuǎn)化溫度而消耗額外的能源。3)發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高，經(jīng)60-80小時發(fā)酵即可在發(fā)酵液中檢測到較高的利巴韋林含量，目前最高可達27g/L，糖苷轉(zhuǎn)化率35%-44%。


圖1是轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒酶切驗證。
具體實施例方式實施例1構建基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)采用相關分子生物學技術對載體pBE2進行改造后命名為PBSA43，其具有如下特點:①配備有可以被解淀粉芽孢桿菌RNA聚合酶識別的P43啟動子，保證目的基因可以在宿主菌內(nèi)高效表達，并且無需化學誘導劑IPTG或乳糖誘導。②針對解淀粉芽孢桿菌限制-修飾系統(tǒng)的特點，移除了質(zhì)粒上的BamH I酶切位點，使質(zhì)粒更容易轉(zhuǎn)化可以將sacB基因序列中編碼信號肽的序列融合到目的基因的5’端，使目的基因可以分泌到培養(yǎng)基中。pBSA43質(zhì)粒的構建:采用PCR技術，分別將P43啟動子的序列和sacB基因序列中編碼信號肽的序列從枯草芽孢桿菌BS168基因組上克隆擴增，插入到pBE2質(zhì)粒的多克隆位點，使sacB基因序列中編碼信號肽的序列的5’端位于P43啟動子的序列的3’端的下游，形成的新質(zhì)粒命名為PBSA43。P43啟動子的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，序列見序列表SEQ ID N0.7 ;SacB信號肽的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，序列參見序列表SEQ ID N0.8。重組質(zhì)粒pBSA43_Bs816PNP的構建:采用PCR技術，將編碼嘌呤核苷磷酸化酶的基因pupG從枯草芽孢桿菌BS168基因組上克隆擴增，并與PBSA43質(zhì)粒重組，使pupG序列的5’端位于sacB基因序列中編碼信號肽的序列的3’端的下游(此處注意保證閱讀框架的完整)，構建了高效表達嘌呤核苷磷酸化酶的重組質(zhì)粒pBSA43-Bs816PNP。pupG的PCR擴增所采用的引物參見序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，序列參見序列表SEQ ID N0.9。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:根據(jù)解淀粉芽孢桿菌具限制-修飾系統(tǒng)的特點，在構建質(zhì)粒的時候盡量避免選用BamH I作為酶切位點，并且盡量保證質(zhì)粒上不含有BamH I酶切位點。通過電擊轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pBSA43-Bs816PNP轉(zhuǎn)化鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208，取I 10 μ L濃度為IOOng/ μ L重組質(zhì)粒溶液加入到100 μ L感受態(tài)細胞中冰浴30min后轉(zhuǎn)移至2mm冰浴預冷過的電轉(zhuǎn)杯中，在1800V電壓下進行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后立即加入900 μ L LB培養(yǎng)基，35°C振蕩培養(yǎng)2h，轉(zhuǎn)速為220r/min，進行復蘇培養(yǎng)。復蘇培養(yǎng)結束后取200 μ L培養(yǎng)液涂布至含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上，35°C倒置培養(yǎng)18h，待長出菌落后挑取單菌落接種于裝有5ml LB培養(yǎng)基的搖管中35°C振蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速為220r/min，提質(zhì)粒進行酶切驗證，結果見圖1。實施例2工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)質(zhì)粒穩(wěn)定性采用平板稀釋計數(shù)法。將凍存于_80°C甘油管中的工程菌(實施例1構建)在含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上三區(qū)劃線，37°C培養(yǎng)16h，挑取單菌落接種于5ml液體選擇性培養(yǎng)基(LB/Knf)中，搖管培養(yǎng)12h后以I %的接種量轉(zhuǎn)入5ml液體非選擇性培養(yǎng)基(LB)，開始連續(xù)搖管培養(yǎng)試驗。每12h轉(zhuǎn)種一次，接種量為1%，連續(xù)傳代30次，每隔5次取樣進行平板稀釋檢測質(zhì)粒的缺失程度。檢測時，取菌液Iml用無菌水逐級稀釋，取三個合適的梯度，本實驗選擇10_7、10_8、10_9三個梯度分別涂在固體選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基平板上，每個處理三個重復。倒置在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，計算各皿中的菌落數(shù)。將選擇性培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與非選擇性培養(yǎng)基中菌落數(shù)進行比較， 即可根據(jù)公式計算出質(zhì)粒的缺失率，見表I。表I工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)質(zhì)粒結構穩(wěn)定性
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌添加前體物TCA (1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝，即利用自行構建的兼具高效生產(chǎn)核苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點的基因工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)通過發(fā)酵過程中添加前體物TCA實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)利巴韋林，具體工藝包括: A.利用分子生物學技術以鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208作為宿主菌構建兼具高效表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):即利用PCR技術從枯草芽孢桿菌BS168中擴增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因pupG，與經(jīng)過改造的表達載體PBSA43連接，構建了具有較高表達效率和很高質(zhì)粒穩(wěn)定性的分泌型表達載體pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)； B.工程菌添加前體物發(fā)酵:將步驟A中獲得的經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌種RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行工程菌添加前體物發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量應為8% 12%，氮碳比N: C應介于10:100 15:100之間，無機鹽含量應為0.1% 12%，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH7.2 7.8，培養(yǎng)溫度33°C 35°C，振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐培養(yǎng)60 80h，接種量為5% 10%V/V，發(fā)酵過程中，添加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值維持在7.0 7.4，發(fā)酵開始 12-24h 添加 TCA。
2.根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步生產(chǎn)利巴韋林發(fā)酵采用的培養(yǎng)基:葡萄糖8% 12%，酵母膏0.8% 1.0%,豆?jié)?.6% 2%，玉米漿1% 2%，(NH3) 2S04 1% 1.5%, MgSO4.7H20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L,自來水 96% 98%，發(fā)酵pH值控制在7.0 7.4，發(fā)酵開始12_24h添加TCA。
3.根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于B步生產(chǎn)利巴韋林發(fā)酵采用的控制工藝:發(fā)酵溫度33 3 5°C，溶氧維持在15 40%，發(fā)酵時間為60 80h。
全文摘要
一種解淀粉芽孢桿菌添加前體物TCA(1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺)發(fā)酵法生產(chǎn)抗病毒藥物利巴韋林的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明首先構建了一個能在解淀粉芽孢桿菌細胞內(nèi)穩(wěn)定復制并高效分泌表達嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的重組質(zhì)粒pBSA43-Bs816PNP，并將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鳥苷生產(chǎn)菌解淀粉芽孢桿菌TA208，得到一株兼具高效生產(chǎn)鳥苷和高效表達嘌呤核苷磷酸化酶這兩種特點基因工程菌RBVM(pBSA43-Bs816PNP)。采用該工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆?jié)?、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和自來水為原料，添加前體物TCA進行發(fā)酵，添加前體物幾小時后便可在培養(yǎng)基中檢測到較高濃度的利巴韋林。本發(fā)明具有發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高，糖苷轉(zhuǎn)化率高，工藝簡便，成本低，能耗低，污染小等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/125GK103146785SQ20131009783
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權日2013年3月25日
發(fā)明者陳寧, 馬躍超, 劉莉, 徐慶陽, 謝希賢, 張成林 申請人:天津科技大學