專利名稱：與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0690的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，特別是涉及一種與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記和引物在谷子葉片顏色基因定位或谷子遺傳育種中的用途。
背景技術(shù)：
我國是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原產(chǎn)國，是世界上谷子的集中種植國，谷子在我國的國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生產(chǎn)中占有重要的地位，對旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)有重要意義。因此，加速谷子的育種進(jìn)程尤為重要。由于谷子只是區(qū)域重要性作物，因此當(dāng)前有關(guān)谷子的研究手段和方法相對較落后，如何應(yīng)用先進(jìn)科學(xué)的研究手段搞好谷子育種是一個(gè)嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新 的思路和手段。開發(fā)具有我國特色的重要性狀基因的分子標(biāo)記并進(jìn)行輔助選擇育種研究，將對提高我國谷子育種水平起到促進(jìn)作用。植物葉色是葉綠體中各種色素的綜合表現(xiàn)，正常葉片中葉綠素占優(yōu)勢，通常表現(xiàn)為綠色。葉色變異是高等植物中突變頻率較高且易于鑒定的突變性狀。迄今為止，在水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、棉花、煙草、玉米、向日葵、番茄、黃瓜、馬鈴薯、桑樹等幾乎所有高等植物中都發(fā)現(xiàn)了葉色突變體。其突變基因直接或間接影響光合色素，特別是葉綠素的合成和降解，導(dǎo)致各種色素的含量和比例改變，從而引起植物葉色變異。近年來，葉色突變體的利用價(jià)值越來越受到關(guān)注，現(xiàn)已成為研究植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的發(fā)育和遺傳控制機(jī)理的特殊材料，同時(shí)葉色突變體在高光效育種和標(biāo)記性狀的利用上也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。一些葉色變異被作為標(biāo)記性狀用于良種繁育和雜交種生產(chǎn)。隨著擬南芥、水稻等模式植物基因組測序的完成，葉色突變體在功能基因組學(xué)上的研究價(jià)值受到越來越多的關(guān)注，它們已成為研究光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、基因功能及其調(diào)控機(jī)制的理想材料。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前報(bào)道的水稻葉色突變的相關(guān)基因已經(jīng)超過80個(gè)，這些突變體大致可分為白化型、黃化型、條紋型、轉(zhuǎn)綠型、斑馬葉等5大類。但對于谷子葉色基因以及與之緊密連鎖的分子標(biāo)記的研究基本沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于PCR擴(kuò)增與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對，以及由該引物對擴(kuò)增獲得的分子標(biāo)記。本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標(biāo)記在谷子葉片顏色基因定位、檢測以及谷子輔助育種中的用途以及上述分子標(biāo)記的檢測方法。本發(fā)明的目的還包括提供一種包括上述分子標(biāo)記的重組載體，以及含有該重組載體的重組細(xì)胞；提供一種包括使用上述分子標(biāo)記的谷子葉片顏色基因的定位方法，和使用所述分子標(biāo)記的谷子輔助育種方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列；優(yōu)選的所述分子標(biāo)記具有Seq ID No. I所示序列。本發(fā)明還公開了一種擴(kuò)增與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對，所述引物對的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；優(yōu)選的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5，-CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3，；Seq ID No. 3 :5，-TGCACAAAGACCCTTACGTT-3，。本發(fā)明還公開了一種與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是 由上述的引物對以葉片偏綠色的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。優(yōu)選的由上述引物對擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)為谷子基因組中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選的，為谷子基因組中Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要擴(kuò)增或者檢測葉片偏綠色的谷子基因組DNA中的該分子標(biāo)記，必然能夠檢測或擴(kuò)增得到含有Seq ID No. I所示的序列。Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當(dāng)長度，并不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長度小于10，00(^ 、小于5，00(^ 、小于2，OOObp、小于 I, 500bp、小于 I, 200bp、小于 I, OOObp、或者小于 800bp。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、酶切位點(diǎn)、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地”在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動(dòng)子被適當(dāng)?shù)刂糜赟eq IDNo. I的一個(gè)位置上，以致該控制序列指導(dǎo)Seq ID No. I編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。獲得上述重組載體后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)不同的需要，將重組載體轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)胞中，得到含有該重組載體的重組細(xì)胞。因此，本發(fā)明還公開了一種含有所述重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用葉片顏色偏綠色的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的632bp擴(kuò)增產(chǎn)物即含有所述分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以DNA化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明還公開了所述分子標(biāo)記的檢測方法，包括步驟根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以被檢測谷子基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物對。例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(Seq ID No. 2和SeqID No. 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢詫⒌玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子葉片顏色基因定位或檢測中的用途。
本發(fā)明還公開了一種谷子葉片顏色基因定位的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子輔助育種方法，所述方法包括檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記引物對的步驟。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選谷子葉片是否含有控制葉片顏色為偏綠色的顏色基因(例如，可以參考，DNA分子標(biāo)記在小麥抗病育種中的用途，隴東學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進(jìn)行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷I號、谷子A2不育系、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代。其中，張谷I號、張雜谷3號或張雜谷3號自交產(chǎn)生的部分F2代葉片顏色偏綠色；谷子A2不育系、張雜谷3號自交產(chǎn)生的部分F2代葉片顏色偏黃色。由于采用以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供了與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記將基因組DNA序列與谷子葉片顏色基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與谷子葉片顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為0. 15cM。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子育種實(shí)踐和資源及品種鑒定。


圖I :分子標(biāo)記引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)對F2代480個(gè)單株擴(kuò)增的部分結(jié)果。其中泳道1-12為F2代中12株谷子葉片顏色偏綠色的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13-24為F2代中12株葉片顏色偏黃色的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道M為marker，其為IOObp DNA Ladder ;其分子量包括、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 IOObp0
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種引物對以及與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0690。利用本發(fā)明的引物對，以谷子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可以得到與谷子葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記在本發(fā)明中命名為分子標(biāo)記SIsv0690。需要指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了通過上述PCR擴(kuò)增獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記外，還可以通過化學(xué)合成獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明的引物對分別含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-CAATTACACTCTAGTCTTGCC-3，；Seq ID No. 3 :5，-TGCACAAAGACCCTTACGTT-3’本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 ’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)谷子基因組DNA上與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與SeqID No. 2和Seq ID No. 3的擴(kuò)增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5’端或3’端分別增加I 10個(gè)堿基并能擴(kuò)增得到基本相同DNA片段的 引物對，均包括在本發(fā)明的引物對中。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物對優(yōu)選為Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列。本發(fā)明將父本葉片偏綠色和母本葉片偏黃色的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號)，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個(gè)單株。優(yōu)選的采用SV分子標(biāo)記開發(fā)方法，首先對父本進(jìn)行de novo測序(60X contig N50 22K, scaffold N50 320K ;Total size :400Mb)，母本重測序(IOX)；然后根據(jù)父母本測序數(shù)據(jù)，利用華大自主開發(fā)的SOAP軟件比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5’端和3’端外側(cè)約50bp位置，隨機(jī)選取20bp左右的長度設(shè)計(jì)差異序列擴(kuò)增的引物，根據(jù)不同的差異序列設(shè)計(jì)了 1105對引物。以父母本及Fl的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從1105對引物中篩選出616對具有多態(tài)性和有效性的引物。采用開發(fā)出的616對引物，對F2群體的480個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Map Maker3. 0軟件進(jìn)行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與葉片顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，及其擴(kuò)增引物。采用篩選出的引物對擴(kuò)增得到的父本序列，即本發(fā)明中的分子標(biāo)記SIsv0690。對F2個(gè)體進(jìn)行性狀分析，并根據(jù)基因性狀數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)將谷子葉片顏色基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :谷子F2代分離群體的構(gòu)建父本抗拿捕凈，株型高，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷I號種子。母本不抗拿捕凈，株型矮，旗葉短而寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為谷子A2不育系種子。F2群體構(gòu)建父本和母本雜交得到Fl代(Fl葉色為偏綠)，F(xiàn)1自交得到F2。其中Fl是張雜谷3號種子。共得F2代單株480株，上述張谷I號種子、谷子A2不育系種子及張雜谷3號種子可參見中國專利申請《與谷子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0372》，
發(fā)明者全志武, 夏秋菊, 張厚寶, 張耕耘 申請人:深圳華大基因科技有限公司