專利名稱：一種種子特異性高效啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種從谷子中分離到的種子特異性高效啟動子序列及其應(yīng)用。從谷子基因組DNA中克隆得到的上述種子特異性啟動子，并與不同的同源、異源基因連接構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主植物，使轉(zhuǎn)基因植株種子高效特異表達(dá)其下游基因的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物研究與開發(fā)的過程中發(fā)現(xiàn)，外源基因的表達(dá)量偏低，往往是造成無法得到理想的轉(zhuǎn)基因植物和有效的研究基因作用機(jī)理的重要因素。由于影響表達(dá)量的關(guān)鍵是基因上游的啟動子，因此，選擇合適的植物啟動子是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為三類組成型啟動子，組織或器官特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。現(xiàn)在植物基因工程中已經(jīng)依據(jù)不同用途，開始廣泛運(yùn)用上述三類啟動子。例如，組成型啟動子中CaMV 35S啟動子和CsVMV啟動子通常應(yīng)用于雙子葉植物，其中CsVMV啟動子在轉(zhuǎn)基因葡萄中驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄能力與使用兩個CaMV 35S啟動子相當(dāng)[Li Z J，et al.Expression of bifunctional GFP fusion marker underthe control of three constitutive promoter and enhanced derivatives intransgenic grape.Plant Sci，2001，160877]。單子葉植物中常使用來自玉米的Ubiqutin啟動子和來自水稻的Actinl啟動子。在這些組成型啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會持續(xù)表達(dá)。但是，由于組成型啟動子驅(qū)動基因的表達(dá)程度不同，應(yīng)用中逐漸暴露出一些問題外源基因在整株植物中表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，最終導(dǎo)致死亡。如利用組成型啟動子表達(dá)病毒衣殼蛋白，就可能會引起病毒衣殼轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致植物病毒新株系的產(chǎn)生[Robinson DJ.Environmental riskassessment of release of transgenic plants containing virus derived inserts.Transgene Res.1996，5359.]。除此，重復(fù)使用同一啟動子驅(qū)動兩個或兩個以上的外源基因，可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。
因而，利用特異性啟動子使基因在受體植物的特定部位和特定時間或特定條件下得以表達(dá)，而且可以表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，能夠有效避免組成型啟動子持續(xù)高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)和不利影響。組織或器官特異性啟動子，誘導(dǎo)型啟動子即屬于特異性啟動子，這類啟動子除具有一般的啟動子結(jié)構(gòu)外，同時還存在幾種控制組織特異性表達(dá)的元件，通常還有增強(qiáng)子和沉默子的一般特性，其表達(dá)特異性由這些元件的種類、數(shù)目及相對位置等共同決定，因此具有廣泛的應(yīng)用價值。隨著植物基因工程發(fā)展，組織或器官特異性啟動子的研究和應(yīng)用成為熱點(diǎn)之一。所謂組織或器官特異性啟動子包括種子特異性啟動子[Beachy RN，et al.(1985)Accumulation and assembly ofsoybeanβ-conglycinin in seeds of transformed petunia plants.The EMBOJournal，4(12)3047-3053]、胚乳特異性啟動子[V.Colot，et al.(1987)Localization of sequence in wheat endosperm protein gene which confertissue-specific expression in tobacco.The EMBO Journal，6(12)3559-3564]、根特異性啟動子[Yamamoto YT，et al.(1991)Characterization of cis-acting sequences regulating root-specific geneexpression in tobacco.Plant Cell，3，371-382]、韌皮部特異性啟動子[Bostwick DE，et al.(1994)Organization and characterization of cucurbitaphloem lectin genes.Plant Molecular Biology，26，887-897]等等。所謂誘導(dǎo)型啟動子包括損傷誘導(dǎo)型[Farmer EE，et al.(1992)Octadecanidprecursors of jasmonic acid activate synthesis of wound-inducibleproteinase inhinbitors.Plant Cell，4，129-134]、化學(xué)誘導(dǎo)[Williams S，et al.(1992)Chemicals regulation of Bacillus thuringiensis δ-endotoxinexpression intransgenic plants.Biol/Technol，10，540-543.]、光誘導(dǎo)[Sonnewald U，et al.(1992)Expression of mutant patatin protein intransgenic tobacco plantRole of glycans and intracellar location.PlantCell，2，345-355.]、熱激誘導(dǎo)[Schoffl F，et al.(1989)The function of plantheat shock promoter elements in the regulated expression of chimaericgene in transgenic tobacco.Mol Gen Genet，217(2-3)，246-253.]等等。
其中，種子特異性啟動子，由于它只有在植物種子成熟過程中，大量表達(dá)其下游基因，而且所表達(dá)的外源蛋白大都集中在種子中，這樣使其外源蛋白容易儲藏，容易運(yùn)輸而備受關(guān)注。因此，種子特異性表達(dá)啟動子的克隆和應(yīng)用逐漸成為應(yīng)用的焦點(diǎn)。
自從1985年Beachy等人開始研究大豆伴球蛋白基因時發(fā)現(xiàn)，β-伴球蛋白α-亞基基因啟動子具有很強(qiáng)的時空調(diào)控功能，并在轉(zhuǎn)基因植物中只有在種子成熟后期大量表達(dá)下游基因，而轉(zhuǎn)基因植株的其他部位很少表達(dá)。隨之而來的是許多作物中的種子特異性啟動子相繼克隆出來，主要包括與淀粉合成有關(guān)的種子特異啟動子，如SBE1啟動子是淀粉分枝酶基因的啟動子，可控制外源基因在水稻種子盾片中特異表達(dá)[Qu L Q，et al.Evaluation of tissue specificity and expressionstrength of rice seed component gene promoters in transgenic rice.Plant[J].Biotechnology Journal，2004，2(2)113-125.]等等；與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的種子特異啟動子，如與種子中貯藏蛋白質(zhì)有關(guān)的，棉花α-球蛋白(globulin)B基因啟動子[Sunilkumar G，et al.Cotton α-globulinpromoterisolation and functional characterization in transgenic cotton，Arabidopsis，and tobacco[J].Transgenic Re2search，2002，11(4)347-359.]、水稻谷蛋白1(glutelin-1)基因啟動子和玉米素醇溶谷蛋白(Zeatin)啟動子[Russell D A，et al.Tissue-specific expression intransgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice[J].Transgenic Research，1997，6(2)157-168.]、葡萄中2S清蛋白(albumin)啟動子[Zhijian T.et al Isolation by improved thermal asymmerricinterlaced PCR characterization of seed-specific 2S albumin gene and itspromoter from grape，Genome，2005，48312-330.]、野生大豆中未知種子蛋白USP(unknown seed protein)啟動子[Baumlein H，et al.A novelseed protein gene from Vicia faba is developmentally regulated intransgenic tobacco and Arabidopsis plants[J].Molecular and GeneralGenetics，1991，225(3)459-467.]和油菜napinB蛋白啟動子[Zhang YJ，et al.Identification of seed-specific promoter nap300 and itscomparison with 7S promoter[J].Progress in Natural Science，2002，12(10)737-741.]等；與脂肪合成有關(guān)的種子特異啟動子，Rossak等將FAE1啟動子和gus基因連接導(dǎo)入擬南芥后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gus基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥開花后4～5天的魚雷型胚開始轉(zhuǎn)錄，在開花后9～11天達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰[Rossak M，et al.Expression of the FAE1 gene and FAE1promoter activity in developing seeds of Arabidopsis thaliana[J].PlantMolecular Biology，2001，46(6)717-725.]。
上述種子特異性啟動子大多數(shù)表現(xiàn)為種子特異性表達(dá)活性，即只有在受體植物種子或胚乳中特異性表達(dá)，而其他組織中幾乎不表達(dá)或表達(dá)量很少。
至今，各類作物種子特異性啟動子的研究與應(yīng)用都已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展；但是，直接從谷子中克隆或分離得到的種子特異性啟動子在國內(nèi)外還未見報道，在國內(nèi)也未見公開使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種種子特異表達(dá)啟動子，所述啟動子來自于谷子基因組DNA，其能夠在植物種子中特異表達(dá)；本發(fā)明的另一目的在于提供該啟動子在改造植物種子中的應(yīng)用，其能夠驅(qū)動同、異源基因在種子中高效特異表達(dá)中。
本發(fā)明利用Tail-PCR從谷子基因組DNA中克隆得到的核苷酸序列，稱之為pF128，長度為1053bp，為雙鏈核酸類型，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。通過三大數(shù)據(jù)庫的檢索，未發(fā)現(xiàn)有相同或相似性較高的序列。生物信息學(xué)分析pF128序列，發(fā)現(xiàn)其具備真核啟動子的基本元件和種子特異表達(dá)的相關(guān)順式元件。
本發(fā)明構(gòu)建了含有pF128驅(qū)動外源基因的植物表達(dá)載體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，其表達(dá)盒是由pF128啟動子和GUS(β-葡糖醛酸酶基因)報告基因及來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶II(NPTII)，所述的表達(dá)載體優(yōu)選的是重組質(zhì)粒pBIpF128。
本發(fā)明將上述含有所述pF128啟動子序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或宿主組織及其后代細(xì)胞，獲得外源基因在種子中高效驅(qū)動表達(dá)的基因工程化宿主細(xì)胞或宿主組織及其后代細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，將含有所述pF128啟動子序列驅(qū)動的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了GUS基因在種子中高效驅(qū)動表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明所述的植物宿主細(xì)胞或宿主組織是植物種子細(xì)胞或植物種子本身，或它們的后代，蛋白質(zhì)等組成成分或種子特性已經(jīng)改變的植物種子細(xì)胞或植物種子本身。
本發(fā)明所述的植物組織中表達(dá)種子特異性啟動子的方法，包括下述步驟(1)將含有本發(fā)明啟動子的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞；(2)使所述的植物細(xì)胞生長成能夠結(jié)種子的成熟植物。
本發(fā)明中所述啟動子的核苷酸序列還包括取代、缺失或插入一個或幾個核苷酸所形成的具有相同功能的核苷酸序列。還可以是所述核苷酸序列與其他啟動子融合序列。
本發(fā)明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質(zhì)或其他活性物質(zhì)功能，包括RNA或DNA序列，該序列與種子特異性啟動子正常情況不相結(jié)合。此核酸序列包括不同于啟動子植物種類的異源核酸序列，以及從相同于啟動子植物種類得到的同源核酸序列，但這些序列與野生型(非轉(zhuǎn)基因)植物的啟動子無關(guān)。
本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在植物中進(jìn)行表達(dá)的任何一種載體，如pBI121等。
本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)化技術(shù)是指已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞或植物組織的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。
本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞或宿主組織及后代細(xì)胞是指所有植物細(xì)胞或植物組織或由這些細(xì)胞或組織發(fā)育成熟的整株植株(包括種子)。
術(shù)語“核酸序列”指含有天然存在的堿基，糖和糖之間(支鏈)的鍵的核苷酸或核苷酸單體的序列。該序列也包括含有發(fā)揮相似功能的非天然存在的單體或其部分被修飾或取代的序列。
術(shù)語“種子特異性啟動子”是指在啟動子控制下表達(dá)的基因在有或沒有基本表達(dá)的植物種子中優(yōu)先表達(dá)。
本發(fā)明的谷子種子特異高效表達(dá)啟動子，是國內(nèi)首次克隆得到的谷子種子特異性啟動子，將所述的啟動子序列連接異源或同源基因后，轉(zhuǎn)化到植物中可使異源或同源基因在植物種子中高效特異表達(dá)，避免了目的基因在其他部位持續(xù)表達(dá)所帶的不利影響。本發(fā)明提供了一種利用所述核苷酸序列驅(qū)動目的基因在植物種子中高效特異表達(dá)的新方法，在植物的遺傳改良和植物生物反應(yīng)器研究方面具有重大的應(yīng)用前景。


圖1Tail-PCR克隆pF128片段電泳圖，圖中1為λ/HindIII+EcoRI標(biāo)記物；2.為陰性對照3、4、5、6、7、8、9、10.分別是引物組合SP4+AD2，SP4+AD3，SP3+AD2，SP3+AD3，SP2+AD2，SP2+AD3，SP1+AD2和SP1+AD3克隆結(jié)果；圖2pF128片段分離電泳圖，圖中1為λ/HindIII+EcoRI標(biāo)記物；2為PCR分離pF128序列；圖3由pF128驅(qū)動的植物表達(dá)載體構(gòu)建過程；圖4GUS組織化學(xué)分析，A根；B莖；C葉；D花；E結(jié)實(shí)后10天的種子；F結(jié)實(shí)后15天的種子；G結(jié)實(shí)后20天的種子；H基本成熟的種子；I轉(zhuǎn)化19Z啟動子[梁華等，玉米醇溶貯藏蛋白基因啟動子PCR擴(kuò)增及其驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草種子中的表達(dá)，生物工程學(xué)報，1996，12(3)295-300.]的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子；J野生型擬南芥種子。
圖5.1轉(zhuǎn)pBIpF128基因擬南芥不同組織GUS熒光定量分析，其中，128-R，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根；128-L，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉；128-F，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花；128-10結(jié)實(shí)后10天的種子；128-15結(jié)實(shí)后15天的種子；128-20結(jié)實(shí)后20天的種子；128-SM基本成熟的種子。
圖5.2轉(zhuǎn)化pBI121和pBIpF128轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS熒光定量比較分析，其中，1、結(jié)實(shí)后10天的種子；2、結(jié)實(shí)后15天的種子；3、結(jié)實(shí)后20天的種子；4、基本成熟的種子。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.谷子種子特異性啟動子序列pF128的克隆谷子3661種子(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源所)表面消毒后，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，24-28℃培養(yǎng)3-5天，使其長出幼嫩葉片后，收集2g鮮嫩幼苗，用CTAB改進(jìn)方法提取總DNA，取2-3μlDNA樣品，瓊脂糖凝膠電泳檢測器純度和濃度。
依據(jù)已知F128 cDNA序列[Xue J.et al，Cloning andCharacterization of seed-specific Expression f128 Gene in Setariaitalica.Journal of Agricultural Biotechnology，2004，12(5)505-508.]，設(shè)計合成3個套式引物SP1-SP3，再根據(jù)Liu Yao-Guang等人的Tail-PCR方法，合成4條簡并引物AD1-AD4，引物序列如下Sp15’-AATTAGGTCTTTGAGGCCATCG-3’Sp25’-CCTTTTTTACCAGACCGCAGC-3’Sp35’-GACACAATCGCCTCAATAGCCT-3’AD15’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’AD35’-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3’AD45’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’用以上引物進(jìn)行Tail-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件根據(jù)Liu Yao-Guang等人的Tail-PCR方法，并略做改進(jìn)，Tail-PCR反應(yīng)成分如下

以特異引物SP3分別與4個簡并引物AD1，AD2，AD3和AD4配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物稀釋100倍后取1μl作為模板，以特異引物SP2和相應(yīng)的簡并引物開始進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；依理進(jìn)行第三次PCR。Tail-PCR反應(yīng)步驟如下

PCR反應(yīng)完成后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段的大小和特異性，選取正確目的片段pS3A2，用DNA膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司原天為時代生物公司)回收，把回收片段亞克隆到測序載體pMD18-T(Takara公司產(chǎn)品)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook，etal.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，p19-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆(電泳結(jié)果如圖1所示)，命名重組質(zhì)粒為pMDpS3A2。
實(shí)施例2.谷子種子特異性啟動子序列pF128的分離設(shè)計并合成如下兩條引物，為以后分離和構(gòu)建的需要，在兩個引物的5’端分別加入了限制性內(nèi)切酶HindIII位點(diǎn)和限制性內(nèi)切酶XbaI位點(diǎn)引物15’TGCTCTAGACCTCTCTTGGATGCTAACACA 3’XbaI引物25’CCAAGCTTTGTGGAGAAGCAGAGAGAAG 3’HindIII以質(zhì)粒DNA pMDpS3A2為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下

擴(kuò)增條件95℃ 10min；95℃ 1min、58.5℃ 1min、72℃ 1min，共30個循環(huán)；72℃ 10min。電泳檢測結(jié)果表明(附圖2所示)，擴(kuò)增得到1053bp的DNA片段。用DNA膠回收試劑盒(天根科技生化有限公司)回收，把回收片段亞克隆到測序載體pMD18-T(Takara公司產(chǎn)品)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆，命名重組質(zhì)粒為pMDpF128。
實(shí)施例3.植物表達(dá)載體pBIpF128的構(gòu)建構(gòu)建流程如圖3所示，用堿裂解法提取pMDpF128質(zhì)粒，經(jīng)過HindIII和XbaI雙酶切，得到pF128啟動子片段，與經(jīng)過同樣酶切的植物表達(dá)載體pBI121的大片段相連，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素(終濃度100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含卡那霉素(終濃度100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質(zhì)粒pBIpF128，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定，確證pBIpF128含有pF128啟動子片段。
實(shí)施例4.pF128啟動子序列/GUS報告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥利用凍融發(fā)將重組的植物表達(dá)載體pBIpF128轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化方法參照Hofen等[Hofen R，Willmitzer L，(1988)Storage of competent cells for Agrobacterium transformation.NucleicAcids Research，16，9877]。
擬南芥的轉(zhuǎn)化參照Clough等[Clough SJ，Bent AF.(1998)Floral dipa simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.The Plant Journal，16(6)，735-743]的Floral dip方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化受體為擬南芥(Arabidopsis thaliana.)。將過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌GV3101[Van Larebeke N，Engler G，Holsters M，Van den ElsackerS，Zaenen I，Schilperoort RA，and Schell J(1974)Large plasmid inAgrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability.Nature(London)，252，169-170](含有pBIpF128)菌液，按照1∶100比例轉(zhuǎn)接至YEB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600值0.6-0.8；收集菌體后，用滲入緩沖液懸浮菌體，稀釋到OD600值0.6左右，把將要開花的花蕾浸泡在含有農(nóng)桿菌細(xì)胞的滲入液里2分鐘，22--26℃暗培養(yǎng)24小時。然后，將轉(zhuǎn)化的植株開花結(jié)果后，收集種子。
實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和檢測將收集到的種子，分別利用2.5％次氯酸鈉溶液和70％乙醇進(jìn)行表面消毒，種植在含有終濃度100μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。在卡那霉素抗性培養(yǎng)基上能夠正常生長的擬南芥幼苗移栽到花盆中，待其開花結(jié)果，收集種子。共篩選到58株能夠在卡那霉素抗性培養(yǎng)基上正常生長的擬南芥幼苗，移栽花盆后成活54株，每個植株取一片葉，用SDS改進(jìn)法提取植物總DNA，用分離pF128啟動子所用的引物1、2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，54株擬南芥中，有48株表現(xiàn)為陽性，擴(kuò)增出1053bp的pF128片段，并測序正確，而剩余部分未能擴(kuò)增出此片段。
實(shí)施例6.轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性組織化學(xué)染色分析和熒光定量分析GUS基因活性的組織化學(xué)染色分析方法依據(jù)Bradford等人[Bradford H M.A rapid and sensitive method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J].Anal Biochem.，1976，72248-254.]。將收集轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織材料與含底物X-Gluc(X-Gluc染液組成1.0mg/μlX-Gluc；50mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0；10mmol/L EDTA，pH 8.0；0.05mmol/L鐵氰化鉀；0.05mmol/L亞鐵氰化鉀；甲醇，終濃度20％；0.1％ Triton X-100.)的染色反應(yīng)液于37℃保溫過夜，進(jìn)行組織化學(xué)染色觀察，葉片等綠色組織用95％乙醇脫色后觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照株相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉、花均未有藍(lán)色出現(xiàn)，僅有轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同時期的未成熟種子有藍(lán)色出現(xiàn)，如圖4。
GUS基因活性的熒光定量分析，根據(jù)Jefferson等人[Jefferson RA.(1987)Assaying chimeric genes in plantsThe GUS gene fusionsystem.Plant Molecular Biology Repoerter，5(4)，387-405]，取轉(zhuǎn)基因植物材料(根、葉、花、種子)300-500mg，放入1.5ml的離心管中，液氮條件下，研磨材料為粉末后，加入600μl提取緩沖液，冰上充分振蕩混勻，離心12600rpm，4℃，15min，吸取上清，即為GUS酶粗提取液。吸取40μl GUS酶粗提取液與360μl GUS反應(yīng)緩沖液(提取緩沖液中加入1mM的MUG)，充分混勻，37℃下進(jìn)行反應(yīng)，于反應(yīng)開始后不同時期取樣100μl，加入盛有900μl反應(yīng)終止液(0.2mol/L NaCO3)的離心管中終止反應(yīng)，用熒光分光光度計在激發(fā)365nm、發(fā)射455nm、狹縫5nm條件下測定各樣品的熒光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照株相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、葉、花并未發(fā)現(xiàn)較高的GUS酶活性，而在不同時期的轉(zhuǎn)基因植株的未成熟種子中卻有較高的GUS酶活性，且隨著種子逐漸成熟，GUS酶活性逐漸增高，如圖5-1；而且和含有組成型啟動子35S和玉米19KD醇溶蛋白基因啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥的同時期未成熟種子相比，含有pF128啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥的未成熟種子中表現(xiàn)出了較高的GUS酶活性，如圖5-2。
由此可知，本發(fā)明所述的谷子種子特異性啟動子確實(shí)具有種子特異性表達(dá)活性。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種種子特異性高效啟動子及其應(yīng)用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1053<212>DNA<213>谷子(Setaria italica)<400>1tgtggagaag cagagagaag taacaatttg gtgggatcaa gtaaaaaaca ttgagaaatt 60actatgatgc tcttttaatt atgtataaat ttatttttta agcaaaataa gaaaagaaag120taccagtacc actggtactt taaaaccatg gtaacaaagc tcctgttcct ggtggttcgc180tcccttaatg ctcgtacgtg tgccgaatat tgatggatca agacgaataa gattgacatt240tcgttcctac cttatgcact atgtccatcc ttcttgtata atgttcattt gcccgcgacg300agagatgtat ttagtctata ctactgttgt ctcggtatct cttggataag tttgtttgca360ttgcatgtat ctcgaatata ttaaccacct ctgttgctga tgtgatctat gttaacctct420attcctagct ttattatgtt ttgttttaaa aaatattgtt ttgcaaatat ttgaaaaaat480atctccaata aatgacaact aaataaatgc ttatgatagg tatactttca taatttttta540tagattttat gatattatat ccagtaagtg ctaataagac tgatggaaat tgtatccata600gaggccatcc gttgtcataa atgtgtagca ccaatcttga tacatgtcaa tatagtcagt660accaatttca aaataattat gcataataaa tttagatgtt tgtgaatata gaagtactat720tgctcacacg tgtgtatcta ctagtgttga ttgtgccact tgtctgtgta atggtatcat780gttttacacc tgtataacat gcaacactaa atttgacatg tgtctaacat gcaacactga840tatcaacact tgtccatata gcctgtcccc acatcaatcc ttaccatcaa ttctgtatcc900aatggctaac atacacaatc gcaaaatagg agcggacctt ccctcatgct tctatataaa960
ccgggtacca ttctcagaaa actcacatca aaaccaacat agttcttgtg ttagcatcca1020agagaggcca aactacttgt agatctaata gcc 105權(quán)利要求
1.一種種子特異性啟動子，其特征在于，所述啟動子具有SEQID No.1所示的核苷酸序列或該序列經(jīng)過取代、缺失或插入一個或幾個核苷酸所形成的具有相同功能的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述啟動子的表達(dá)載體。
3.含有權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的植物宿主細(xì)胞或植物宿主組織。
4.按照權(quán)利要求3所述的植物宿主細(xì)胞或宿主組織，其特征在于所述植物宿主細(xì)胞是植物種子細(xì)胞所述植物宿主組織是植物種子本身。
5.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，該方法包括步驟1)將權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，2)使步驟1)所述的植物細(xì)胞生長成能夠結(jié)種子的成熟植物。
6.權(quán)利要求1所述的啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為擬南芥。
8.權(quán)利要求1所述的啟動子在生產(chǎn)人類食品、動物飼料、化妝品或藥品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的啟動子在改造植物種子特性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從谷子中分離到的種子特異性啟動子，該啟動子是利用Tail－PCR(染色體步移法)從谷子基因組DNA中克隆得到，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，本發(fā)明還包括具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主。本發(fā)明還涉及該啟動子的應(yīng)用，具體地說是利用該啟動子序列來改造植物種子，其方法是將所述啟動子下游銜接異源或同源基因，并構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主植物，該啟動子序列能夠驅(qū)動其下游基因在其種子中高效特異表達(dá)目的蛋白，實(shí)現(xiàn)植物遺傳改良，或者作為研究植物生物反應(yīng)器的有效工具。
文檔編號C12N15/82GK101063139SQ200710099169
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日
發(fā)明者于靜娟, 梁翰文, 朱登云, 薛靜, 趙倩, 敖光明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),