專利名稱：與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0659的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，特別是涉及一種與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記和引物在谷子花粉顏色基因定位或谷子遺傳育種中的用途。
背景技術(shù)：
我國是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原產(chǎn)國，是世界上谷子的集中種植國，谷子在我國的國民經(jīng)濟(jì)和社會生產(chǎn)中占有重要的地位，對旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)有重要意 義。因此，加速谷子的育種進(jìn)程尤為重要。由于谷子只是區(qū)域重要性作物，因此當(dāng)前有關(guān)谷子的研究手段和方法相對較落后，如何應(yīng)用先進(jìn)科學(xué)的研究手段搞好谷子育種是一個嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新的思路和手段。開發(fā)具有我國特色的重要性狀基因的分子標(biāo)記并進(jìn)行輔助選擇育種研究，將對提高我國谷子育種水平起到促進(jìn)作用。谷子花粉顏色與谷子成熟后的顆粒顏色色澤以及雄性不育都有一定的相關(guān)聯(lián)。但目前對控制谷子花粉顏色相關(guān)基因的研究基本上沒有文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于PCR擴(kuò)增與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對，以及由該引物對擴(kuò)增獲得的分子標(biāo)記。本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標(biāo)記在谷子花粉顏色基因定位、檢測以及谷子輔助育種中的用途以及上述分子標(biāo)記的檢測方法。本發(fā)明的目的還包括提供一種包括上述分子標(biāo)記的載體，以及含有該載體的重組細(xì)胞；提供一種包括使用上述分子標(biāo)記的谷子花粉顏色基因的定位方法，和使用所述分子標(biāo)記的谷子輔助育種方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列；優(yōu)選的所述分子標(biāo)記具有SeqID No. I所示序列。本發(fā)明還公開了一種擴(kuò)增與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對，所述引物對的引物I含有Seq ID No. 2所示序列，引物2含有Seq ID No. 3所示序列；優(yōu)選的所述引物I具有Seq ID No. 2所不序列，引物2具有Seq ID No. 3所不序列；Seq ID No. 2 :5’ GTGATTCTAAGTGATCGAGCT-3’ ；Seq ID No. 3 :5’ -CGAAATTGGAACCCACAAGGT-3，。本發(fā)明還公開了一種與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是由上述的引物對以花粉黃白色或橙色的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。優(yōu)選的由上述引物對擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記含有Seq ID No. I所示序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)為谷子基因組中Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SeqID No. I的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選的，為谷子基因組中Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要擴(kuò)增或者檢測花粉黃白色或橙色的谷子基因組DNA中的該分子標(biāo)記，必然能夠檢測或擴(kuò)增得到含有Seq ID No. I所示的序列。Seq ID No. I的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當(dāng)長度，并不特別限定，例如，滿足分子標(biāo)記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于 2，OOObp、小于 I, 500bp、小于 I, 200bp、小于 I, OOObp、或者小于 800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記(含有Seq ID No. I所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No. I的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地”在本發(fā)明中定義為ー種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動子被適當(dāng)?shù)刂糜赟eq ID No. I的ー個位置上，以致該控制序列指導(dǎo)Seq ID No. I編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了ー種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標(biāo)記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標(biāo)記的表達(dá)載體或者克隆載體。獲得上述重組載體后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，根據(jù)不同的需要，將重組載體轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)胞中，得到含有該重組載體的重組細(xì)胞。因此，本發(fā)明還公開了ー種含有所述重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備方法，包括下述步驟使用花粉顔色黃白色或橙色的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的669bp擴(kuò)增產(chǎn)物即含有所述分子標(biāo)記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以DNA化學(xué)合成的方法得到本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明還公開了所述分子標(biāo)記的檢測方法，包括步驟根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物，以被檢測谷子基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)増，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的引物對。例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(SeqID No. 2和Seq IDNo. 3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。可以將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子花粉顔色基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明還公開了ー種谷子花粉顔色基因定位的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的分子標(biāo)記的步驟。本發(fā)明還公開了所述的分子標(biāo)記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明還公開了ー種谷子輔助育種方法，所述方法包括檢測本發(fā)明的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記引物對的步驟。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記來篩選谷子花粉是否含有控制花粉顏色為黃白色或橙色的顔色基因(例如，可以參考，DNA分子標(biāo)記在小麥抗病育種中的用途，隴東學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006年4月第16卷第I期，P65-69)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進(jìn)行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點。
在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷I號、谷子A2不育系、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代。其中，張谷I號花粉顏色黃白色；谷子A2不育系花粉顏色棕色；張雜谷3號花粉顏色橙色；張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代花粉顏色部分黃白色、部分橙色、部分棕色。由于采用以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供了與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記將基因組DNA序列與谷子花粉顏色基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與谷子花粉顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為2. 6cM。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子育種實踐和資源及品種鑒定。


圖I :分子標(biāo)記引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)對F2代480個單株擴(kuò)增的部 分結(jié)果。其中泳道1-12為F2代中12株谷子花粉顏色黃白色或橙色的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13-24為F2代中12株花粉顏色棕色的單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道M為marker，其為IOObp DNA Ladder ;其分子量包括、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 以及 IOObp0
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種引物對以及與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0659。利用本發(fā)明的引物對，以谷子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可以得到與谷子花粉顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記在本發(fā)明中命名為分子標(biāo)記SIsv0659。需要指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了通過上述PCR擴(kuò)增獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記外，還可以通過化學(xué)合成獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記。本發(fā)明的引物對分別含有序列表Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 :5，-GTGATTCTAAGTGATCGAGCT-3，；Seq ID No. 3 :5’ -CGAAATTGGAACCCACAAGGT-3，。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在上述Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列中，可在其5 ’端或3’端分別增加I 10個堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)谷子基因組DNA上與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與Seq IDNo. 2和Seq ID No. 3的擴(kuò)增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No. 2和Seq ID No. 3的5’端或3’端分別增加I 10個堿基并能擴(kuò)增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在本發(fā)明的引物對中。在本發(fā)明具體的實施方式中，本發(fā)明的引物對優(yōu)選為Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示序列。本發(fā)明將父本花粉黃白色和母本花粉棕色的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號)，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個單株。優(yōu)選的采用SV分子標(biāo)記開發(fā)方法，首先對父本進(jìn)行 de novo 測序(60X contig N50 22K, scaffold N50 320K ；Total size 400Mb)，母本重測序(IOX);然后根據(jù)父母本測序數(shù)據(jù)，利用華大自主開發(fā)的SOAP軟件比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5’端和3’端外側(cè)約50bp位置，隨機(jī)選取20bp左右的長度設(shè)計差異序列擴(kuò)增的引物，根據(jù)不同的差異序列設(shè)計了 1105對引物。以父母本及Fl的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從1105對引物中篩選出616對具有多態(tài)性和有效性的引物。采用開發(fā)出的616對引物，對F2群體的480個個體進(jìn)行PCR檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Map Maker3. O軟件進(jìn)行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與花粉顔色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，及其擴(kuò)增引物。采用篩選出的引物對擴(kuò)增得到的父本序列，即本發(fā)明中的分子標(biāo)記SIsv0659。對F2個體進(jìn)行性狀分析，并根據(jù)基因性狀數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)將谷子花粉顔色基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例I :谷子F2代分離群體的構(gòu)建父本抗拿捕凈，株型高，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏緑，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷I號種子。
母本不抗拿捕凈，株型矮，旗葉短而寬，剛毛緑色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為谷子A2不育系種子。F2群體構(gòu)建父本和母本雜交得到Fl代(Fl花粉顏色為橙色)，F(xiàn)l自交得到F2。其中Fl是張雜谷3號種子。共得F2代單株480株，其中，花粉顏色為黃白色的有120株，橙色的有240株，棕色的有120株。上述張谷I號種子、谷子A2不育系種子及張雜谷3號種子可參見中國專利申請《與谷子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標(biāo)記SIsv0372》，
發(fā)明者全志武, 夏秋菊, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司