專利名稱：一種提取擴增用taq酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性蛋白酶的提取方法，尤其是涉及一種提取擴增用TAQ酶的方法。
背景技術(shù)：
目前，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件(4°C)下進行，常規(guī)純化TAQ酶方法采用低溫破解，反復(fù)通過離子交換，親和層析進行純化，有少許雜蛋白很 難完全去除，純化過程中每根層析柱都要有20%左右的損失，產(chǎn)品的純度也只能達到85%以上，產(chǎn)量也會有所下降。因其純度問題也就影響了后期產(chǎn)品用來做基因擴增的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種合理簡單、基因擴增效果良好的提取擴增用TAQ酶的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將TAQ酶菌體利用TEBG緩沖溶液進行懸浮，再進行壓力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴溫度為70°C，將蛋白液在緩沖溶液中反應(yīng)lh，去除雜蛋白，最后將蛋白液通過層析即可以得到高純活性蛋白TAQ酶。所述的TEBG緩沖溶液含有維持蛋白空間構(gòu)象的穩(wěn)定劑及防止蛋白不飽和鍵被氧化的保護劑。所述的穩(wěn)定劑為丙三醇，所述的保護劑為P -巰基乙醇(BSA)，穩(wěn)定劑終濃度10%(V/V)，保護劑終濃度為0. I % (G/V)。所述的壓力破碎步驟的壓力控制為8000psi。所述的雜蛋白包括膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白。所述的高純活性蛋白通過SDS蛋白膠電泳觀察為單一條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高熱法提取擴增用TAQ酶的生產(chǎn)工藝合理簡單，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件(4°C )下進行，避免了常規(guī)純化中反復(fù)通過離子交換，親和層析進行純化，使得收率減少和少許雜蛋白很難完全去除的因素，最大限度保證了產(chǎn)品產(chǎn)量和純度，后期的基因擴增效果良好。


圖I為實施例I中提取擴增用TAQ酶的生產(chǎn)工藝圖；圖2為實施例I得到的高純活性蛋白電泳純度圖；圖3為傳統(tǒng)方法得到的高純活性蛋白電泳純度圖。圖中I為TAQ酶菌體、2為TEBG緩沖液、3為破碎裝置、4為水浴裝置、5為層析柱、
6為高純活性蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例ITAQ酶提取試驗組如圖I所示，將發(fā)酵好的TAQ酶菌體I溶于TEBG緩沖液2中，然后利用壓力破碎裝置3，控制壓力為8000psi進行壓力破碎，從而去除核酸，控制水浴裝置4的溫度為70°C，利用該蛋白在TEBG緩沖液中的熱穩(wěn)定性，將去除核酸的蛋白液在緩沖溶液中反應(yīng)lh, TEBG緩沖溶液含有終濃度10% (V/V)，維持蛋白空間構(gòu)象的穩(wěn)定劑丙三醇及終濃度為0. 1% (G/V)，防止蛋白不飽和鍵被氧化的保護劑P -巰基乙醇(BSA)。雜蛋白變性后的蛋白液通過層析柱5層析去除膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白等雜蛋白，最終得到高純活性蛋白6。 對照組將菌體溶于常規(guī)Tris緩沖液后，破碎去除核酸后，反復(fù)通過柱層析的到純化的活性蛋白TAQ酶。產(chǎn)品純度試驗將純化好的活性TAQ酶，通過標記法或擴增法測定其活性單位，分別將實驗組和對照組各點5U，10U, 15U，20U, 30U通過SDS蛋白凝膠上點樣，上交15mA電泳，下膠25mA電泳，然后通過考馬斯亮蘭染色，觀察蛋白條帶情況。試驗組蛋白為單一條帶，如圖2所示，對照組有肉眼可見的雜蛋白，如圖3所示。實施例2一種高熱法提取擴增用TAQ酶的生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟將發(fā)酵好的TAQ酶菌體用TEBG緩沖液懸浮，TEBG緩沖溶液含有終濃度10% (V/V)，維持蛋白空間構(gòu)象的穩(wěn)定劑丙三醇及終濃度為0. 1% (G/V)，防止蛋白不飽和鍵被氧化的保護劑￠-巰基乙醇(BSA)。然后控制壓力裝置的壓力為SOOOpsi進行壓力破碎，去除核酸后的蛋白液，利用其該蛋白在該緩沖液中的熱穩(wěn)定性，控制反應(yīng)溫度為70°C高熱作用lh，去除絕大部分雜蛋白，然后通過一根層析柱即可得到所需高純活性蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高熱法提取擴增用TAQ酶的生產(chǎn)工藝理簡單，傳統(tǒng)工藝需要四到五根層析柱，而現(xiàn)在只需一根即可，縮短了生產(chǎn)周期，同時原來難以除去的結(jié)合蛋白也隨著熱變性而去除，大大提高了產(chǎn)品的純度、生產(chǎn)批量和生產(chǎn)效率，為基因擴增試驗提供了強有力的保障。
權(quán)利要求
1.一種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在干，該方法包括以下步驟將TAQ酶菌體利用TEBG緩沖溶液進行懸浮，再進行壓力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴溫度為70°C，將蛋白液在緩沖溶液中反應(yīng)lh，去除雜蛋白，最后將蛋白液通過層析即可以得到高純活性蛋白TAQ酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的TEBG緩沖溶液含有維持蛋白空間構(gòu)象的穩(wěn)定劑及防止蛋白不飽和鍵被氧化的保護劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑為丙三醇，所述的保護劑為巰基こ醇(BSA)，穩(wěn)定劑終濃度10% (V/V)，保護劑終濃度為O.I % (G/V)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的壓カ破碎步驟的壓カ控制為8000psi。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的雜蛋白包括膜蛋白、脂蛋白或有色蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提取擴增用TAQ酶的方法，其特征在于，所述的高純活性蛋白通過SDS蛋白膠電泳觀察為單一條帯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取擴增用TAQ酶的方法，該方法包括以下步驟將TAQ酶菌體利用TEBG緩沖溶液進行懸浮，再進行壓力破碎去除核酸，得到蛋白液，控制水浴溫度為70℃，將蛋白液在緩沖溶液中反應(yīng)1h，去除雜蛋白，最后將蛋白液通過層析即可以得到高純活性蛋白TAQ酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明生產(chǎn)工藝合理簡單，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件(4℃)下進行，避免了常規(guī)純化中反復(fù)通過離子交換，親和層析進行純化，使得收率減少和少許雜蛋白很難完全去除的因素，最大限度保證了產(chǎn)品產(chǎn)量和純度，后期的基因擴增效果良好。
文檔編號C12N9/12GK102690798SQ20111007268
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者朱德華 申請人:上海吉泰遠成生物科技有限公司