專利名稱：一種白樺葉片基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種高質(zhì)量白樺葉片基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
高純度基因組DNA是基因組測序、基因克隆、分子雜交、基因文庫構(gòu)建和分子標記等一系列分子生物學(xué)研究的前提。白樺葉片中酚類、多糖、萜類等次生物質(zhì)含量較高，特別是生長在我國東北白樺，由于要適應(yīng)東北地區(qū)較為嚴酷的地理及氣候環(huán)境，體內(nèi)各種次生物質(zhì)種類更多、含量更高，會對DNA的提取造成更為嚴重的影響。因此，如何去除這些雜質(zhì)以獲得高質(zhì)量的DNA是白樺葉片基因組DNA提取過程中面臨的主要問題，也是對白樺進行分子生物學(xué)研究的前提條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種高質(zhì)量白樺葉片基因組DNA提取方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300 U L改良STE溶液，300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等體積)和20 y L P —巰基乙醇，混合后震蕩3min ;改良 CTAB 溶液配方2. 5 % (ff/V)CTAB, 150mmol/LTris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良SET溶液配方150mmol/L Tris-Cl(pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl ；②常溫5000g離心5min，棄上清；向沉淀中加入加600 y L改良CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min ；③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復(fù)此步驟2次；④取上清加入等體積的無水乙醇異丙醇混合液(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min ；⑤倒掉上清液，用70%預(yù)冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中；⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。本發(fā)明的提取方法方法能提取出高質(zhì)量白樺葉片基因組DNA，其核心技術(shù)包括以下幾個內(nèi)容1、改良了 CTAB與STE溶液；2、采用常溫下等體積的改良CTAB溶液和STE溶液洗滌經(jīng)充分研磨的材料2次；3、水浴裂解溫度由65°C提高至70°C ;4、在沉淀DNA時，采用無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)混合沉淀劑，低速離心，以降低雜質(zhì)的沉淀。這種方法能分離出高質(zhì)量的白樺葉片基因組DNA。


圖1為不同方法提取的白樺DNA電泳結(jié)果；1、2泳道為CTAB法提取的DNA ;3、4泳道為SDS法提取的DNA ;5、6泳道方法III提取的DNA電泳；7泳道方法IV (STE洗滌I次)提取的DNA ；8泳道方法V (CTAB洗滌I次)提取的DNA ；圖2為方法IV提取的白樺DNA電泳結(jié)果；1.和2泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌I次后提取的白樺基因組DNA ；3.和4泳道STE和CTAB洗滌混合液洗滌I次后提取的白樺基因組DNA ；5.和6泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌2次后提取的白樺基因組DNA ；圖3為方法IV提取的白樺DNA EcoR I與MseI酶切電泳結(jié)果；1.為白樺葉片基因組DNA;2.白樺葉片基因組DNA被EcoR I酶切后電泳結(jié)果；3.白樺葉片基因組DNA被MseI酶電泳切結(jié)果；4.標準DNA分子量；5 7泳道為重復(fù)；圖4為白樺不同個體葉片基因組DNA的RAH)擴增結(jié)果。
具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。材料白樺葉片取自東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)已達開花結(jié)實的白樺，于8月未摘取的成熟葉片，葉片保存在_20°C冰箱。試劑CTAB 溶液(2 % (ff/V)CTAB, IOOmmoI/L Tris-Cl(pH8. 0), 20mmol/LEDTA(pH8. 0),1.4mmol/LNaCl)STE 溶液(IOOmmo 1/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0)，改良CTAB 溶液(2. 5 % (W/V)CTAB，150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；改良SET 溶液(150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；其他試劑40mmol/L疏基乙醇，lOOmmol/L Tris HCI (pH8. 0), 20mmol/LEDTA,10%SDS, IOmo 1/L LiCI (高壓滅菌)，氯仿 / 異戊醇(24 :1)，Tris 飽和酚，5mol/L KAC，TE 緩沖液。EcoRI和MseI酶購自紐英倫公司。其他均為常規(guī)國產(chǎn)試劑。主要儀器和設(shè)備凝膠成像系統(tǒng)(UVP)，MIKR0120微量臺式高速離心機(Hettich) ,-20°C超低溫冰箱(Harris),-40°C低溫冰箱(海爾公司),超純水儀(Milipore)；DYY-1I1-12B型三恒多用電泳儀(六一儀器廠)，可見紫外分光光度計(ABI);渦旋振蕩器GL-88B (江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)。1. DNA提取方法方法1:常規(guī)的CTAB法參照王關(guān)林等的《植物基因工程》。方法I1:SDS法參照顧洪雅的方法。方法III①向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LCTAB裂解液和20 ii L @ -巰基乙醇，65°C浴熱5min。②從-20°C取出材料后加液氮研磨至材料成灰白色，向步驟①中的每個離心管中加約0. 04g材料，劇烈震蕩混勻，65°C浴熱lOmin。③隨后加入1/3體積5mol/L KAC(pH8. 0)，充分混勻。再加入200 u LTris飽和酚(pH9. 5)和300 u L氯仿。輕輕震蕩IOmin。④常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3 1)，輕輕震蕩5min。⑤常溫16060g離心lOmin，取600 ii L上清液加適量無水乙醇，再加入等體積氯仿后震湯5min。⑥常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑦常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和2. 5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。
⑧常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 u LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A2607280測定DNA濃度和純度。方法IV:①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LSTE和20 u 一巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清；向下層沉淀中加入600 u L CTAB后劇烈振蕩混勻，65°C浴熱IOmin;再加入400 u L Tris飽和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，輕輕振蕩IOmin。②常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3 1)，輕輕震蕩5min。③常溫16060g離心lOmin，取600 ii L上清液加適量無水乙醇，再加入等體積氯仿后震湯5min。④常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑤常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和2. 5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。⑥常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 u LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A2607280測定DNA濃度和純度。方法V :①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LCTAB溶液和20 IiLP—巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清；向下層沉淀中加入600 u L CTAB后劇烈振蕩混勻，65°C浴熱IOmin;再加入400 u L Tris飽和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，輕輕振蕩IOmin。②常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3
1)，輕輕震蕩5min。③常溫16060g離心IOmin,取600 u L上清液加等體積氯仿后震蕩5min。④常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑤常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和
2.5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。⑥常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 ii LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A26Q/■測定DNA濃度和純度。VII方法V1:①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，分別用STE和CTAB溶液(等體積)與20 u L^-巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min，棄上清。重復(fù)此步驟f 2次。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ -疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復(fù)此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預(yù)冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水
中。 ⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。方法vn①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300 U L改良STE溶液、300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等體積)和20 y L P —巰基乙醇，混合震蕩3min。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復(fù)此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預(yù)冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中。⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。方法VDI①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，分別用改良STE和CTAB溶液(等體積)與20 u 一巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清。重復(fù)此步驟I次。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復(fù)此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預(yù)冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中。⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。2. DNA質(zhì)量檢測2.1DNA完整性檢測在0. 8%的瓊脂糖凝膠中，于5V/cm電壓下電泳，檢測總DNA的完整性。2. 2DNA純度檢測通過紫外分光光度測定260nm/280nm比值判斷總DNA的純度。2. 3DNA酶切檢測白樺葉片基因組DNA EcoRI單酶解，反應(yīng)體積20ii L :DNA800ng，酶2U，EcoR IBuffer 2u L0 酶解條件37°C，反應(yīng) 2h。
白樺葉片基因組DNA MseI單酶解，反應(yīng)體積20 ii L :DNA800ng，酶2U，MseI Buffer2uL0酶解條件37°C，反應(yīng)2h。白樺葉片基因組DNA 雙酶切體系2. 9 ii L DNA(50ng/ u L), 5 u L 10XBuffer,
0.5u LlOO X BSA, 0. 8u L MseI (I OU/ u L), 0. 4 u L EcoRI (20U/ u L)，加離子水至 50 y L 去。酶解產(chǎn)物點樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳、觀察并拍照。2. 4白樺葉片基因組DNA PCR擴增檢測
擴增體系(20ii L) :1. 2 ii LMg2+ (25mmol/L)，0. 4 ii LdNTPs (2. 5mmol/L)，0.4iiLRAPD$*(50pmol/iiL)，liiLTaq DNA 聚合酶(IU/y L)，I y 模板 DNA (40ng/U L), 2 u LlO XPCRbuffer0 擴增程序94°C 4min，然后進入下列循環(huán)94°C 45s, 56°C 45s,72°C 80s, 35個循環(huán)；72°C 7min。PCR儀為MJ-9600。擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上120V電泳2h，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。3.結(jié)果與分析3.1CTAB法、SDS法、方法II1、方法IV和方法V提取的DNA電泳檢測結(jié)果分別取2 U L DNA樣品，在0. 8%的瓊脂糖凝膠上用高電場(5V/cm)電泳法檢測其DNA的完整性。結(jié)果表明，常規(guī)CATB法(圖1中1、2泳道)、SDS法(圖1中3、4泳道)，方法III提取的DNA (圖1中5、6泳道);方法IV (STE溶液洗滌I次)提取的DNA (圖1中7泳道)，方法V (CTAB溶液洗滌I次)提取的DNA (圖1中8泳道)提取白樺基因組DNA時多糖污染嚴重，樣孔中EB吸收明顯，而且有大量的降解RNA的存在。此外，此圖為電泳l:30h后的圖譜，可以看出，DNA沒有離開樣孔，說明DNA已與多糖等次生物質(zhì)相結(jié)合，在電場中無法遷移。因此,常規(guī)的CTAB、SDS法，方法II1、方法IV和方法V和均不適應(yīng)富含較高多糖和次生物質(zhì)的白樣葉片基因組DNA提取。3. 2方法V1、VII和VDI的白樺DNA完整性和純度的檢測圖2中I和2泳道為方法VI提取的白樺葉片基因組DNA電泳結(jié)果，其DNA仍然在點樣孔附近，說明DNA中仍含有多糖或其也次生代謝物質(zhì)。圖2中3和4泳道為方法VII提取的白樺葉片基因組DNA電泳結(jié)果，其電泳后DNA條帶正齊，說明提以的DNA完整、無降解，而且將葉片中的RNA已完合去除，但點樣孔仍然有發(fā)亮的現(xiàn)象，說明提取的DNA中仍含有少量的多糖或次生代謝物質(zhì)。圖2中5和6泳道為方法VDI提取的白樺葉片基因組DNA電泳結(jié)果，其電泳后DNA條帶正齊，說明提以的DNA完整、無降解，而且將葉片中的RNA已完合去除，而且點樣孔非常干凈，說明提取的DNA中已完全去除了多糖或次生代謝物質(zhì)。方法IV提取的白樺葉片基因組DNA電泳結(jié)果如圖2中5飛泳道所示，點樣孔較干凈，說明方法IV中用SET多次洗滌對于去除多糖效果明顯。同時，也可以明顯看出，方法珊提取的DNA電泳條帶亮度較弱，說明有SET多次洗滌時，也造成了 DNA的大量丟失。5飛泳道對應(yīng)DNA的0D26Q/0D28Q分別為1. 82和1. 84，表明提取的DNA中沒有蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的污染，符合分子生物學(xué)研究所要求的質(zhì)量標準，說明改造后的方法較為適合提取富含多糖的白樺葉片基因組DNA。3. 3方法VDI的提取的DNA的酶切驗證為了進一步驗證圖2中5、6泳道對應(yīng)的方法提取的DNA的質(zhì)量，進行了 EcoR和MseI單酶切和雙酶切實驗，酶切后電泳結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，不論是單酶切還是雙酶切，酶切后的DNA均呈彌散狀，酶切效果較好，說明DNA純度較高，完全可以進行后續(xù)的分子生的學(xué)操作。3. 4方法VDI的提取的DNA的RAPD擴增驗證以方法VI提取不同纖維長度的白樺個體葉片基因組DNA材料，用篩選出的多態(tài)性高的引物進行擴增分析，擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4，結(jié)果表明，不同纖維長度個體擴增結(jié)果均較好，說明提取的DNA分子完全可來進行分子標記等分子生物實驗研究。
應(yīng)當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 一種白樺葉片基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300μ L改良STE溶液，300 μ L改良CTAB 溶液和20 μ Li3 —巰基乙醇，混合后震蕩3min ;改良CTAB溶液配方2. 5 % (W/V) CTAB， 150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良 SET 溶液配方150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ；②常溫5000g離心5min，棄上清；向沉淀中加入加600μ L改良CTAB溶液和20 μ L β — 巰基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min ；③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復(fù)此步驟1 2次；④取上清加入等體積的無水乙醇異丙醇混合液,無水乙醇異丙醇的體積比為2:1， 上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min，6080g離心3min ；⑤倒掉上清液，用70%預(yù)冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50μ L TE或去離子水中；⑥電泳檢測DNA的完整性，Α260/280測定DNA濃度和純度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白樺葉片基因組DNA提取方法，改良了CTAB與STE溶液；采用常溫下等體積的改良CTAB溶液和STE溶液洗滌充分研磨的材料2次；水浴裂解溫度由65℃提高至70℃；在沉淀DNA時，采用無水乙醇:異丙醇(體積比為2:1)混合沉淀劑，低速離心，以降低雜質(zhì)的沉淀。這種方法能分離出高質(zhì)量的白樺葉片基因組DNA。
文檔編號C12N15/10GK103013985SQ20131001627
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者魏志剛, 楊傳平, 張力杰, 曲贊霜, 候聰 申請人:東北林業(yè)大學(xué)