專利名稱：一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體是一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸菌株及發(fā)酵產(chǎn)回香酸的方法，
背景技術(shù)：
茴香腦是茴香油的主要成分，通過深加工可以制取高附加值的茴香醛、茴香酸和茴香醇及其各種衍生物，茴腦等相關(guān)化合物廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、香料、醫(yī)藥和化工等多種領(lǐng)域。茴香醛和茴香酸廣泛用于合成香精香料、電鍍金屬的光亮劑同時(shí)還是合成多種西藥的中間體，具有較高的價(jià)值。目前茴香醛和茴香酸的生產(chǎn)主要為化學(xué)合成法(主要為氧化法)，生產(chǎn)率低，副產(chǎn)物多，不僅浪費(fèi)資源而且污染環(huán)境。生物轉(zhuǎn)化法作為一種綠色、環(huán)境友好型的生產(chǎn)方法，在轉(zhuǎn)化茴腦合成茴香醛、茴香酸等化合物方面具有良好的發(fā)展前景。關(guān)于茴香腦的代謝，只在近十年才逐漸開展起來的。目前報(bào)道能代謝反式茴 香腦的微生物菌種有 Arthrobacter TA13、Pseudomonas putida JYR-1、黑曲霉 ZJ-9 和Pseudomonas BT-13。Shimoni E等[從土壤中獲得一株能轉(zhuǎn)化反式茴腦的細(xì)菌菌株TA13,經(jīng)16S rDNA序列分析,鑒定為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.。此外,他們還研究了 ArthrobacterTA13及其誘變菌株代謝反式茴腦的途徑，根據(jù)代謝產(chǎn)物推斷了一條茴香腦環(huán)氧化后雙鍵斷裂的代謝途徑，誘變菌株能將異丁子香酚轉(zhuǎn)化生成香草醛和香草酸，以反式茴腦、茴香醇和茴香醒作為碳源可高產(chǎn)茴香酸。Ryu等報(bào)道在Pseudomonas putida JYR-I代謝茴香腦的轉(zhuǎn)化液中，檢測(cè)到了茴香腦環(huán)氧化合物、茴香酸及對(duì)羥基苯甲酸。國(guó)內(nèi)陳敏開展了微生物降解茴腦的篩選，獲得一株茴香醛產(chǎn)率較高的菌株，初步鑒定菌株ZJ-9為真菌黑曲霉，經(jīng)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，茴香醛的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)4. 54%。粟桂嬌等以廣西盛產(chǎn)的八角茴香油為碳源，開展了生物降解反式茴腦的菌株篩選工作，獲得一株細(xì)菌菌株BT-13，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析,初步鑒定為假單胞菌Pseudomonas sp.。同時(shí)考察了假單胞菌BT-13在有機(jī)溶劑-水兩相系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，茴香醛的摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)7. 7%，利用固定化細(xì)胞技術(shù)在兩相系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化，茴香醛的產(chǎn)量有所提高，達(dá)12. 6%。廣西盛產(chǎn)天然植物八角，八角和八角茴香油的產(chǎn)量居全國(guó)第一,這為我國(guó)以天然茴香腦生產(chǎn)茴香醛提供了充足的原料保證。本發(fā)明以廣西盛產(chǎn)的八角茴香油為原料，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化茴腦生成茴香酸的菌株篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述菌株的篩選方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是利用該菌株生物轉(zhuǎn)化茴香腦生產(chǎn)茴香酸的方法，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化提高茴香酸的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株，分類命名為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp) WGB31，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO. M 2012060，保藏日期是2012年3月12日。轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31),簡(jiǎn)稱為 WGB31,下述同。一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株是從廣西八角林土壤中篩選得到。所述的轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31)的篩選方法,包括如下步驟從八角林土壤中采用不同濃度的茴腦濃度梯度的富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集，再接種到含有5g/L茴腦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行平板篩選，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中于28°C搖瓶培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h，采用氣相色譜法定量測(cè)出茴香酸含量，選出產(chǎn)茴香酸高的菌株。所述富集培養(yǎng)基的組分及含量為葡萄糖20g、蛋白胨10g、K2HPO4 · 3H201g、NaClO. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 5g、FeSO4O. Olg、酵母浸出粉 2. 5g，蒸餾水定容至 IOOOmL, pH 為 7. 0。所述種子培養(yǎng)基的組分及含量為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,蒸餾·水定容至IOOOmL, pH為7. O。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量為葡萄糖6g，蛋白胨8g，牛肉膏2. 5g，KH2P041.0g，NaCl 0. 5g, MgSO4O. 5g, FeSO4O. Olg,茴香腦 4g/L,蒸懼水定容至 IOOOmLo所述轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31)在轉(zhuǎn)化茴腦生成茴香酸中的應(yīng)用。茴香酸薄層層析檢測(cè)發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯萃取，充分搖勻后在8000轉(zhuǎn)/分鐘下離心5分鐘，取上相點(diǎn)樣于硅膠板GF254，檢測(cè)是否有茴香酸的斑點(diǎn)出現(xiàn)。茴香酸氣相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯萃取，取上相，用氣相色譜法檢測(cè)茴腦的降解率及茴香醛的摩爾生成率。茴腦的降解率=(初始茴腦的摩爾數(shù)一殘余茴腦的摩爾數(shù))/初始茴腦的摩爾數(shù) X 100%茴香醛的生成率=生成茴香醛的摩爾數(shù)/初始茴腦的摩爾數(shù)X 100%利用所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)茴香酸的方法，包括下述步驟(I)、平板保存培養(yǎng)將菌株劃線到固體平板培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)24_36h，保存于4°C冰箱以及用于種子培養(yǎng)基的接種。(2)、種子培養(yǎng)于250mL的三角瓶中裝入50_80mL的種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，接入平板保存的菌株，30°C，搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為12-20h。培養(yǎng)物用于發(fā)酵培養(yǎng)的接種。(3)、發(fā)酵培養(yǎng)容積為200mL的發(fā)酵瓶中裝入61. 22mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入經(jīng)種子培養(yǎng)的菌液7-10%(v/v)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-24h，轉(zhuǎn)速為160-200轉(zhuǎn)/分鐘，分離提取茴香酸。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為葡萄糖5g，蛋白胨6g，KH2PO4L 0g, NaCl 0. 5g，MgSO4O. 5g, FeSO4O. 01g，茴香腦3_5g/L，pH為6· 23，蒸餾水定容至IOOOmL0上述(3)中所述的發(fā)酵條件是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的針對(duì)WGB31轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的發(fā)酵過程進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取了 3個(gè)主要影響因子葡萄糖濃度，pH,裝液量。使用Design-Expert進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì),得到17個(gè)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)這17個(gè)實(shí)驗(yàn)給出的葡萄糖濃度，pH和裝液量分別進(jìn)行這17個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)得出茴香酸含量之后通過軟件建模并運(yùn)算得出最優(yōu)化條件葡萄糖、pH、裝液量分別為6. 01g/L、6. 23,61. 22mL時(shí)，茴香酸產(chǎn)量達(dá)到最大值。本發(fā)明的有益效果提供一種能利用茴香腦轉(zhuǎn)化生成茴香酸的菌株，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，能在含有茴香腦的發(fā)酵培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化茴腦生成茴香酸。
具體實(shí)施例方式以下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。實(shí)施例I菌株的篩選每份采集到的土壤樣品稱取5g加入已滅菌的富集培養(yǎng)基中，30°C搖床200rpm培養(yǎng)72h。將菌液按10%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)中，經(jīng)三次茴腦濃度梯度富集培養(yǎng)， 取ImL富集培養(yǎng)物，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取10_5、10_6和10_7三個(gè)濃度，涂布于基本培養(yǎng)基平板上，30°C倒置培養(yǎng)3-5天。挑取平板上的單菌落，接種到IOml基本培養(yǎng)基的指形瓶中，添加4g/L茴腦，30°C搖床200rpm培養(yǎng)48h，劃線于基本培養(yǎng)基平板上；重復(fù)幾次進(jìn)行純化；將純化后的菌株接種至含有IOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的指形瓶中，添加4g/L茴腦，30°C，搖床200rpm轉(zhuǎn)化48h，轉(zhuǎn)化液經(jīng)萃取后用薄層色譜法進(jìn)行定性分析，記錄并保存有茴香酸斑點(diǎn)出現(xiàn)的菌株；將產(chǎn)茴香酸菌株接種至裝液量約100mL/250mL的三角瓶中，添加4g/L茴腦，300C，搖床200rpm轉(zhuǎn)化48h，轉(zhuǎn)化液經(jīng)萃取后采用氣相色譜法進(jìn)行定量分析，篩選出茴香酸產(chǎn)量高的菌株如下表。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(ifer姑o7oferia spWGB31),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012060。
2.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(ifcr姑spWGB31)的篩選方法，其特征是，從八角林土壤中采用不同濃度的茴腦濃度梯度的富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集，再接種到含有5 g/L茴腦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行平板篩選，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中于28 °C搖瓶培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，采用氣相色譜法定量測(cè)出茴香酸含量，選出產(chǎn)茴香酸高的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的篩選方法，其特征在于，所述富集培養(yǎng)基的組分及含量為葡萄糖.20g、蛋白胨 10g、K2HPO4 · 3H20 lg、NaCl O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 5g、FeSO4 0. Olg、酵母浸出粉.2.5g以及蒸餾水1000 L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的組分及含量為胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOg，定容至1L，pH為7. O。
5.根據(jù)權(quán)利2所述的篩選方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量為葡萄糖.6 g，蛋白胨 8 g，牛肉膏 2. 5g, KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，茴香腦4 g/L,定容至1L，pH為6. 0 ；250 mL發(fā)酵瓶裝液量為60 mL。
6.如權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株(ifcr姑o7oferiaspWGB31)在轉(zhuǎn)化茴腦生成茴香酸中的應(yīng)用。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)化茴香腦生成茴香酸的菌株及其篩選方法和應(yīng)用，從八角林土壤中采用不同濃度的茴腦濃度梯度的富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集，再接種到含有5g/L茴腦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行平板篩選，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中于28℃搖瓶培養(yǎng)12h，再轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h，采用氣相色譜法定量測(cè)出茴香酸含量，選出產(chǎn)茴香酸高的菌株(BurkholderiaspWGB31)。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化得到的茴香酸生成率為28.75%。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102888355SQ20121031599
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者武波, 申佩弘, 曾華賀, 宋張楊, 蔣承建, 唐咸來 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)