專利名稱：：用于dmo的有效靶向的葉綠體轉(zhuǎn)運肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體的說，本發(fā)明涉及允許有效加工和定位植物中的麥草畏單加氧酶的葉綠體轉(zhuǎn)運肽的鑒定和用途。相關(guān)技術(shù)描述DMO(麥草畏單加氧酶)在植物中催化除草劑麥草畏(3,6-二氯-鄰茴香酸)降解為無毒的3,6-二氯水楊酸(3,6-DCSA)，從而賦予除草劑耐受性。DMO的活性需要用于將電子從NADH向麥草畏轉(zhuǎn)移的兩種中間蛋白質(zhì)還原酶和鐵氧還蛋白(美國專利7,022,896;Herman等人,2005)。然而，轉(zhuǎn)基因植物中的麥草畏耐受性已通過單獨用DMO轉(zhuǎn)化得到證明，表明植物內(nèi)源性的還原酶和鐵氧還蛋白可以在電子轉(zhuǎn)移中代替。參與電子轉(zhuǎn)移的植物鐵氧還蛋白位于質(zhì)體中。因此，為了獲得DMO的高效性能并因此獲得*提高的麥草畏耐受性，需要將DMO靶向至葉綠體。在許多情況下，這種靶向可以通過被稱作葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)或者質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的N-末端延伸的存在而實現(xiàn)。如果表達(dá)的多肽將要在植物質(zhì)體(如葉綠體)中區(qū)室化，細(xì)菌來源的染色體轉(zhuǎn)基因必須具有與編碼表達(dá)的多肽的序列相融合的編碼CTP序列的序列。因此，將外源多肽定位到葉綠體中通常是借助于將編碼CTP序列的多核苷酸序列可操作地連接到編碼外源多肽的多核苷酸的5，區(qū)域上來完成的。CTP在向質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)移過程中通過加工步驟被去除。但是，加工效率可能受CTP的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影響。Weeks等人(美國專利7,022,896)描述了玉米cab-m7信號序列(參見，Becker等人，1992和PCTWO97/41228;GenBank登記號X53398)和豌豆谷胱甘肽還原酶信號序列(Creissen等人，1992和PCTWO97/41228)在將DMO靶向至植物質(zhì)體方面的潛在用途，但是沒有給出關(guān)于加工或者靶向效率的數(shù)據(jù)。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亞基編碼序列的27個氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基(RbcS)CTP,也已經(jīng)用于將DMO靶向至葉綠體(例如，美國臨時申請60/811,152)。然而，已經(jīng)在蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析過程中發(fā)現(xiàn)，這種豌豆RbcSCTP產(chǎn)生一個正確加工的DMO蛋白質(zhì)條帶(38kDa),但是還產(chǎn)生一個與DMO和RbcS編碼區(qū)的27個氨基酸相對應(yīng)的較大的條帶(41kDa)。額外的氨基酸可能不利地影響DMO的活性。此外，由于DMO的不完全加工，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中額外的蛋白質(zhì)造成監(jiān)管方面的障礙，為了使產(chǎn)品在政府機構(gòu)注冊的目的，還需要在產(chǎn)品表征方面投入額外的努力，由此增加了產(chǎn)品注冊的費用。因此，需要鑒定有效地產(chǎn)生正確加工的DMO的CTP,從而提供完全的DMO活性以及易于表征產(chǎn)品的優(yōu)點。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及一種重組DNA分子，其包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列，其中，該核苷酸序列編碼包括選自SEQIDNOs:1-11的序列的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。在某些實施方案中，重組DNA分子包括選自SEQIDNOs:12-22的核苷酸序列。在某些實施方案中，重組DNA分子包括編碼選自SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。包括與在植物細(xì)胞中具有功能的啟動子可操作地連接的DNA分子的DNA構(gòu)建體也是本發(fā)明的一方面。另一方面，本發(fā)明包括用DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述DNA分子包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列，其中，葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列選自SEQIDNOs:1-11。在某些實施方案中，重組DNA分子包括選自SEQIDNOs:12-22的核苷酸序列。在某些實施方案中，DNA分子包括編碼選自SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列，其中，DNA分子可操作地連接到在植物細(xì)胞中具有功能的啟動子上。在特定的實施方案中，DNA分子包括選自SEQIDNOs:23、25、27、29、31、33、35、37和39的核苷酸序列。在某些實施方案中，植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。在其它實施方案中，植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。在特定的實施方案中，植物細(xì)胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物細(xì)胞。本發(fā)明也涉及包括這樣的細(xì)胞的植物組織培養(yǎng)物，涉及包括這樣的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因種子和轉(zhuǎn)基因植物。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子或者植物是雙子葉種子或植物。在其它實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子或者植物是單子葉種子或者植物。轉(zhuǎn)基因種子或者植物可以是大豆、棉花、玉米或者油菜籽種子或者植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生耐受麥草畏的植物的方法，包括將重組DNA分子引入植物細(xì)胞中，并由其再生植物，所述DNA分子包括可才乘作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列，其中，編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列選自SEQIDNOs:12-22。在某些實施方案中，重組DNA分子包含編碼選自SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。DNA分子可以可操作地連接到在植物細(xì)胞中具有功能的啟動子上。該方法可以進(jìn)一步包括通過將親本植抹與它自身或者第二植抹雜交產(chǎn)生耐受麥草畏的植物，其中親本植林和/或第二植抹包括所述DNA構(gòu)建體，并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植林和/或第二植抹遺傳了該DNA構(gòu)建體。一種在植物細(xì)胞中表達(dá)麥草畏單加氧酶的方法是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，該方法包括將選擇的CTP可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的序列上。另一方面，本發(fā)明涉及一種在農(nóng)作物生長環(huán)境中控制雜草生長的方法，包括種植這樣的植物或其種子，并向農(nóng)作物生長環(huán)境施用有效控制雜草生長的量的麥草畏除草劑。麥草畏除草劑可以自上方向農(nóng)作物生長環(huán)境施用，由此麥草畏除草劑的量不損傷所述的植物或其種子，卻損傷與該植物或其種子基因型相同但是缺乏構(gòu)建體的植物或者種子。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及生產(chǎn)食物、飼料或者工業(yè)產(chǎn)品的方法，包括a)獲得植物，該植物包括按照5，到3'的方向可操作地連接到編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核普酸序列和編碼麥草畏單加氧酶的核苷酸序列或其部分上的編碼在植物細(xì)胞中具有功能的啟動子的核普酸序列；b)從所述植物或其部分制備食物、飼料、纖維或者工業(yè)產(chǎn)品。在該方法的某些實施方案中，食物或者飼料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白質(zhì)。在該方法的其它的實施方案中，工業(yè)產(chǎn)品是生物燃料、纖維、工業(yè)化學(xué)品、藥物或者營養(yǎng)品。針對出土前(preemergence)施用麥草畏提供保護的、包括可操作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA的耐受麥草畏的種子，是本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。在某些實施方案中，耐受麥草畏的種子包括編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列，例如選自SEQIDNOs:12-22的核苷酸序列。耐受麥草畏的種子可以進(jìn)一步包括編碼選自SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38和40的麥草畏單加氧酶的核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面涉及提高單子葉植物的直立能力(standability)的方法，包括a)獲得并培育通過將親本植抹與它自身或者第二植抹雜交產(chǎn)生的植物，其中該親本植抹和/或第二植林包含所述DNA構(gòu)建體并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植抹和/或第二植抹遺傳了該DNA構(gòu)建體；b)用麥草畏處理植物。在某些實施方案中，植物是玉米植物。在其它的實施方式中，可以測量包括支柱根的形狀、數(shù)量、長度和/或結(jié)構(gòu)、倒伏百分比和產(chǎn)量的與直立能力相關(guān)的參數(shù)。附圖簡述圖1:CTP-DMO構(gòu)建體在DMO的正確加工和:提供麥草畏耐受性中的應(yīng)用。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了用于在植物細(xì)胞中更有效地表達(dá)和向葉綠體轉(zhuǎn)運麥草畏單加氧酶(DMO)多肽的組合物和方法。因此本發(fā)明的組合物和方法在增強植物和細(xì)胞對除草劑麥草畏的耐受性方面有用。尤其通過用葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)將DMO靶向至葉綠體，可以實現(xiàn)提高的DMO表達(dá)和對麥草畏的耐受性。然而，令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些CTP與DMO組合不能很好地發(fā)揮功能。例如，一些CTP不能導(dǎo)致足夠的蛋白質(zhì)表達(dá)。這包括蛋白質(zhì)的不正確表達(dá)，以及改變大小的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和不完全的體內(nèi)活性。這會導(dǎo)致不完全的除草劑耐受性并且使注冊審批變得復(fù)雜。本發(fā)明提供CTP，當(dāng)該CTP與DMO聯(lián)合使用時，提供意想不到的益處，包括但不限于提高的轉(zhuǎn)運至葉綠體的水平、在表達(dá)DMO的轉(zhuǎn)基因植物中增強的除草劑耐受性、正確大小的蛋白質(zhì)表達(dá)的理想水平和適當(dāng)?shù)姆g后修飾。當(dāng)與DMO組合后提供意想不到的益處的CTP的一個例子是轉(zhuǎn)運肽CTP2,包括SEQIDNO:4或5的核酸，并且包括編碼SEQIDNOs:15和16的序列。在其它實施方案中，使用豌豆CP&wwM"v"m)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP編碼序列，例如由SEQIDNO:2所代表的或者編碼SEQIDNO:13。因此，包括可操作地連接到CTP2和/或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP轉(zhuǎn)運肽編碼序列上的DMO編碼序列的DNA構(gòu)建體構(gòu)成本發(fā)明的一個方面，由其編碼的蛋白質(zhì)也構(gòu)成本發(fā)明的一個方面。嗜麥芽假單胞菌(尸wwdomo"cwma/to;/^"a)菌林DI6的麥草畏單加氧酶(Herman等人，2005;美國專利公開20030115626;GenBank登記AY786443,本文引入其編碼DMO的序列作為參考)催化除草劑麥草畏的解毒。DMO是用于將麥草畏解毒成無毒的3,6-二氯水楊酸(3,6-DCSA)的三組分體系中的一部分，且如上所述需要還原酶和鐵氧還蛋白功能來轉(zhuǎn)移電子。由于參與電子轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性植物鐵氧還蛋白定位于質(zhì)體中，為了獲得DMO的有效活性和例如在雙子葉植物中的麥草畏耐受性或者例如在單子葉植物中增強的麥草畏耐受性，優(yōu)選DMO靶向至質(zhì)體(例如葉綠體)。測試葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)在將DMO耙向至質(zhì)體和DMO加工中的效率。與這些CTP有關(guān)的DMO的質(zhì)體定位和加工/人沒有或部分到完全不等。發(fā)現(xiàn)只有一些CTP允許將DMO完全加工成正確的大小。因此，基于它的蛋白質(zhì)或者核苷酸序列，任意給定的CTP提供完全和有效的DMO加工的能力是難以預(yù)料和出人意料的。此外，也已經(jīng)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，在沒有合適的CTP的情況下，幾乎沒有或者沒有DMO的表達(dá)與幾乎沒有或者沒有麥草畏耐受性相關(guān)。這表明葉綠體靶向?qū)τ邴湶菸返慕舛具M(jìn)而對于耐受性是重要的。允許有效加工DMO的CTP在將DMO耙向至農(nóng)作物的質(zhì)體例如葉綠體方面是有用的，因此提供以下優(yōu)勢完全的DMO活性和對麥草畏的較高的耐受性，以及易于表征產(chǎn)品和降低注冊費用。包括可4喿作地連接到編碼麥草畏單加氧酶的DNA上的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA的嵌合DNA分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)方法制備(例如，Sambrook等人，1989)。本發(fā)明提供了可操作地連接到已知的編碼DMO(包括表1中列出的那些)的DNA分子上的CTP,用于提高植物中DMO的表達(dá)。來自在細(xì)胞核中編碼的任何基因并且其產(chǎn)物可將多肽靶向至葉綠體的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，可以進(jìn)行DMO有效表達(dá)的檢測。可以分離或者合成葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列。為了在雙子葉植物、單子葉植物或者這兩者中表達(dá)，可以優(yōu)化編碼CTP的核苷酸序列。通過將每一個可操作地連接到DMO編碼序列上，測試下面的轉(zhuǎn)運肽PsRbcS-衍生的CTPs(SEQIDNO:l和2:豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基CTP;Coruzzi等人,1984);AtRbcSCTP(SEQIDNO:3:擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶-力口氧酶小亞基1ACTP;CTP1;美國專利5,728,925);AtShkGCTP(SEQIDNO:4:擬南芥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS);CTP2;Klee等人，1987);AtShkGZmCTP(SEQIDNO:5:CTP2合成的；為單子葉植物表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化；WO04009761的SEQIDNO:14);PhShkGCTP(SEQIDNO:6:矮牽牛(P"wm'a/^6nWa)EPSPS;CTP4;為單子葉植物表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化；Gasser等人，1988);TaWaxyCTP(SEQIDNO:7:小麥(TW"cwmae^Vwm)結(jié)合顆粒的淀粉合酶CTP合成的，為玉米表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化Clark等人，1991):OsWaxyCTP(SEQIDNO:8:水稻(C^za^"Va)淀粉合酶CTP;Okagaki，1992);NtRbcSCTP(SEQIDNO:9:煙草(iV/cori""ato6acwm)核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽；Mazur,等人，1985);ZmASCTP(SEQIDNO:10:玉米()鄰氨基苯曱酸合酶a2亞單位基因CTP;Gardiner等人，2004);和RgASCTP(SEQIDNO:ll:蕓香(iwtograveo/e朋)鄰氨基苯曱酸合酶CTP;Bohlmann，等人，1995)。編碼SEQIDNO:l-SEQIDNO:l1的核香酸序列分別在SEQIDNO:12-SEQIDNO:22中給出。可能有用的其它轉(zhuǎn)運肽包括玉米cab-m7信號序列(Becker等人，1992;PCTWO97/41228)和豌豆(尸/wm^"vwm)谷胱甘肽還原酶信號序列(Creissen等人，1995;PCTWO97/41228)。具有來自于基因編碼區(qū)的額外氨基酸的CTP(所述氨基酸是該基因編碼區(qū)的一部分或與它融合)，例如AtRbcSCTP(其包含轉(zhuǎn)運肽，成熟核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶蛋白的24個氨基酸，然后是轉(zhuǎn)運肽的最后6個氨基酸的重復(fù))，可以被用來產(chǎn)生DMO。ZmASCTP7也包含來自于基因編碼區(qū)的額外18個氨基酸。其它CTP也可以用來產(chǎn)生DMO，它們具有來自于基因編碼區(qū)的額外的氨基酸(例如27個氨基酸)(所述氨基酸是該基因編碼區(qū)的一部分)，例如PsRbcSCTP,緊接著是通過克隆方法引入的氨基酸(例如3個氨基酸)。具有較少的編碼全長CTP的氨基酸(例如21個氨基酸)的CTP,例如RgAsCTP,也可以被用來產(chǎn)生DMO。優(yōu)選地，使用編碼全長CTP的核苷酸序列?？梢园ㄒ粋€或者多個核苷酸添加或者缺失，以便于CTP的克隆。這些添加或者缺失可以在其它表達(dá)元件和編碼區(qū)的前面或者后面，導(dǎo)致一個或者多個編碼氨基酸的修飾，例如在限制性酶識別位點處或者位于其附近。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核酸序列，該葉綠體轉(zhuǎn)運肽與SEQIDNOs:1-11中的任意一個或者多個多肽序列至少具有70%的同一性，包括與這些序列有至少大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，包括100%的同一性。在特定的實施方案中，所述核酸序列編碼與SEQIDNOs:1-11中的一個相同的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。在另一個實施方案中，編碼CTP的核酸序列與SEQIDNOs:12-22中的任意一個或者多個核酸序列具有至少70%的序列同一性，包括與這些序列中的一個或者多個至少有大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者更大的序列同一性，包括100%的同一性。這些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比較和同一性的確定可以如本領(lǐng)域公知的那樣進(jìn)行，例如，使用MEGAlign(DNAStar,Inc.,1228S.ParkSt.，Madison,WI)，采用缺省參數(shù)。這樣的軟件通過確定相似性或者同一性的程度，匹配相似的序列。通過使用前序列可以將DMO靶向至其它細(xì)胞器例如線粒體，以利用存在于該細(xì)胞器中的鐵氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)?；蛘撸ㄟ^雙靶向肽可以將DMO耙向至葉綠體和線粒體兩者，以利用兩個鐵氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)，使工作更加有效。這樣的元件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。例如，線粒體前序列在SilvaFilho等人，(1996)中有描述。編碼雙靶向肽序列的核酸序列可以從編碼下述已知能被靶向至葉綠體和線粒體兩者的蛋白質(zhì)的核苷酸序列中被鑒定出來Zn-MP(Moberg等人，2003)、谷胱甘肽還原酶(Rudhe等人，2002;Creissen等人，l995)和組氨酰-tRNA合成酶(Akashi等人，1998)。例如，如表1所示，在編碼SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38、40多肽的序列中，發(fā)現(xiàn)可以用于這方面的DMO編碼序列的例子。表1.使用的DMO和DMO變體。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在某些實施方案中，編碼麥草畏單加氧酶的核酸與編碼SEQIDNOs:24、26、28、30、32、34、36、38和40中任意一個多肽的序列具有至少70%的同一性，包括與這些序列具有至少大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%和更高的序列同一性。在某些實施方案中，核酸與SEQIDNOs:23、25、27、29、31、33、35、37或39中的任意一個核酸序列具有至少70%的序列同一性，包括與這些序列中的一個具有至少大約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%和更大的序列同一性。在進(jìn)一步的實施方案中，麥草畏單加氧酶可以是任一個這樣的序列的變體和/或可以是工程化的合成DMO分子，例如，如在2007年1月12日提交的名稱為"DMOMethodsAndCompositions"的美國臨時申請60/884,854中描述的，本文特別引入其完整公開內(nèi)容作為參考。具有降解植物生長素樣除草劑的能力的DMO的變體，以及草甘膦或者其它除草劑耐受基因，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備，并測定其活性。也可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如，乂人合適的生物體中鑒定這些序列，所述生物體包括能夠降解例如麥草畏的生物素樣除草劑或者其它除草劑的細(xì)菌(美國專利5，445，962;Cork和Krueger,1991;Cork和Khalil,1995)。一種分離DMO或者其它序列的方法是通過例如與由來源生物體構(gòu)建的文庫進(jìn)行核酸雜交，或者使用來自來源生物體的mRNA和基于公開的去飽和酶的引物進(jìn)行RT-PCR。本發(fā)明因此包括在嚴(yán)格條件下與本文所述的DMO編碼序列雜交的核酸的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解通過增加鹽濃度和降低溫度可以提供嚴(yán)格性較低的條件。因此，雜交條件可以容易地控制，并且一般是根據(jù)預(yù)期的結(jié)果選擇的方法。高嚴(yán)格性條件的一個例子是5XSSC、5(T/。曱酰胺和42。C。通過在這樣的條件下序列。變體也可以化學(xué)合成，例如，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，利用已知的DMO多核苷酸序列合成。例如，DNA序列可以通過亞石舞酰胺化學(xué)法(phosphoroamidite)在自動DNA合成儀上合成?；瘜W(xué)合成有許多優(yōu)勢。特別是，化學(xué)合成是合乎需要的，因為將要表達(dá)DNA序列的宿主所偏好的密碼子可以用來優(yōu)化表達(dá)。并非所有的密碼子都需要改變來獲得改進(jìn)的表達(dá)，但是優(yōu)選地至少將那些在宿主中很少用到的密碼子改變?yōu)樗拗髌玫拿艽a子。通過改變超過大約50%，最優(yōu)選至少大約80%的密碼子成為宿主偏好的密碼子，可以得到高水平的表達(dá)。許多宿主細(xì)胞的密碼子偏好是已知的(例如，PCTWO97/31115;PCTWO97/11086;EP646643;EP553494;和美國專利5,689,052;5,567,862;5,567,600;5,552,299和5,017,692)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，推導(dǎo)出其它宿主細(xì)胞的密碼子偏好。此外，利用化學(xué)合成，可以容易地改變DNA分子的序列或者其編碼的蛋白質(zhì)，例如用來優(yōu)化表達(dá)(例如，消除干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的mRNA二級結(jié)構(gòu))、在方便的位點加入獨特的限制性位點、以及刪除蛋白酶酶切位點。在根據(jù)需要保留或者改變酶活性的同時，可以對蛋白質(zhì)的多肽序列，如本文提供的DMO序列，進(jìn)行修飾和改變。在2007年1月12日提交的美國臨時申請60/884,854中提供了產(chǎn)生DMO序列的示例性的方法。下面是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸來產(chǎn)生相當(dāng)?shù)幕蛏踔粮倪M(jìn)的、修飾的多肽和相應(yīng)的編碼序列的討論。已知，例如，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可以被其它氨基酸代替，卻不會明顯損失與底物分子上諸如結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)相互結(jié)合的能力。因為蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)限定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性，所以可以在蛋白質(zhì)序列中，當(dāng)然也可以在其DNA編碼序列中，進(jìn)行某些氨基酸序列置換，而仍然獲得具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此設(shè)想可以對本文描述的DMO肽序列或者其它除草劑耐受性多肽和相應(yīng)的DNA編碼序列進(jìn)行各種改變，而不會明顯減弱它們的生物學(xué)效用或者活性。進(jìn)行這樣的改變時，需要考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域中一般理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用生物學(xué)功能方面的重要性(Kyte等人，1982)。普遍認(rèn)為，氨基酸的相對親水特性對產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)具有貢獻(xiàn)，而蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)又限定了蛋白質(zhì)與例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等其它分子的相互作用?；谒鼈兊氖杷院碗姾商匦?，每種氨基酸已被分配了親水指數(shù)(Kyte等人，1982),這些是異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);曱硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(—1.3);脯氨酸(—1.6);組氨酸(—3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9)和精氨酸(4.5)。本領(lǐng)域已知，氨基酸可以被其它具有相似親水指數(shù)或者得分的氨基酸代替，而仍然產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即，仍然獲得生物學(xué)功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。進(jìn)行這樣的轉(zhuǎn)變時，優(yōu)選其親水指數(shù)在土2之內(nèi)的氨基酸置換，尤其優(yōu)選在土l之內(nèi)的氨基酸置換，甚至更優(yōu)選在士0.5之內(nèi)的氨基酸置換。本領(lǐng)域中也理解在親水性的基礎(chǔ)上可以有效進(jìn)行相似氨基酸的置換。美國專利4,554,101提出，受到鄰近氨基酸親水性控制的蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。如美國專利4,554,101所述，下面的親水性值被分配給氨基酸殘基精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(—0.4);脯氨酸(—0.5±1);丙氨酸(—0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(—1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)理解氨基酸可以被另一種具有相似親水性值的氨基酸代替，而仍然獲得生物學(xué)相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。在這樣的改變中，優(yōu)選其親水性值在土2之內(nèi)的氨基酸置換，尤其優(yōu)選在土l之內(nèi)的氨基酸置換，甚至更優(yōu)選在土0,5之內(nèi)的氨基酸置換。將這些和各種上述特征考慮在內(nèi)的示例性的置換是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，且包括精氨酸和賴氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，絲氨酸和蘇氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。包括可操作地連接到DMO序列上的CTP序歹'J的DNA構(gòu)建體可以通過被可操作地連接到在植物中具有功能的啟動子上而在諸如原生質(zhì)體、瞬時或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞等測試系統(tǒng)中表達(dá)。描述這樣的啟動子的例子包括美國專利6,437,217(玉米RS81啟動子)、美國專利5,641,876(水稻肌動蛋白啟動子；OsActl)、美國專利6,426,446(玉米RS324啟動子)、美國專利6,429,362(玉米PR-1啟動子)、美國專利6,232,526(玉米A3啟動子)、美國專利6,177,611(組成型玉米啟動子)、美國專利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S啟動子)、美國專利6,433,252(玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子)、美國專利6,429，357(水稻肌動蛋白2啟動子以及水稻肌動蛋白2內(nèi)含子)、美國專利5,837,848(根特異性啟動子)、美國專利6,294,714(光誘導(dǎo)型啟動子)、美國專利6，140,078(鹽誘導(dǎo)型啟動子)、美國專利6,252,138(病原體誘導(dǎo)型啟動子)、美國專利6,175,060(磷缺乏誘導(dǎo)型啟動子)、美國專利6,388,170(例如，PClSV啟動子)、SEQIDNO:41的PC1SV啟動子、美國專利6,635,806(y-薏苡醇溶蛋白(coixin)啟動子)和美國專利7,151,204(玉米葉綠體醛縮酶啟動子)?？梢允褂玫钠渌鼏幼邮请僦彼岷厦?NOS)啟動子(Ebert等人，1987)、章魚氨酸合酶(OCS)啟動子(其在根癌土壤桿菌(爿gra6a"ehwm/wme/ac&w)的月中瘤誘導(dǎo)的質(zhì)粒中攜帶)、花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等人,1987)、CaMV35S啟動子(Odell等人，1985)、玄參花葉病毒35S-啟動子(Walker等人，1987)、蔗糖合酶啟動子(Yang等人，1990)、R基因復(fù)合體啟動子(Chandler等人，1989)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子等。在本發(fā)明中，具有增強子序列的CaMV35S(e35S;美國專利5,322,938;5，352，605;5，359，142和5，530，196)、FMV35S(美國專利6,051,753;5,378,619)、花生褪綠條紋花椰菜花葉病毒(PC1SV;美國專利5,850,019)、At.Act7(登記號#U27811)、At.ANTl(美國專利申請20060236420)、FMV.35S-EFla(美國專利申請20050022261)、elF4A10(登記號弁X79008)和AGRtu.nos(GenBank登記號V00087;Depicker等人,1982;Bevan等人，1983)、水稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶(OsTPI;美國專利7,132,528)和水稻肌動蛋白15基因(OsActl5;美國專利申請2006-0162010)啟動子可能特別有用。作為翻譯前導(dǎo)序列起作用的5，UTR是位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的DNA遺傳元件，可以#1包括在啟動子和CTP-DMO序列之間。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯啟動序列上游的完全加工的mRNA之中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級轉(zhuǎn)錄物向mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或者翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子包括玉米和矮牽?；嵝菘说鞍浊皩?dǎo)序列(美國專利5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶前導(dǎo)序列、GmHsp(美國專利5,659,122)、PhDnaK(美國專利5,362,865)、AtAntl、TEV(Carrington和Freed,1990)和AGRtunos(GenBank登記號V00087;Bevan等人，1983)等(Turner和Foster,1995)。在本發(fā)明中，可能尤其有益的5，UTR是GmHsp(美國專利5,659,122)、PhDnaK(美國專利5,362,865)、AtAntl、TEV(Carrington和Freed,1990)、OsActl(美國專利5641876)、OsTPI(美國專利7,132,528)、OsActl5(美國公開20060162010)和AGRtunos(GenBank登記號V00087;Bevan等人，1983)。3，非翻譯序列、3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)或者多腺苷酸化區(qū)域意思是連接到并位于結(jié)構(gòu)多核普酸分子下游的DNA分子，并且包括提供能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或者基因表達(dá)的多腺苷酸化信號和其它調(diào)控信號的多核苷酸。多腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，以導(dǎo)致向mRNA前體的3，末端增加多聚腺苷酸。多腺苷酸化序列可以來源于天然基因、多種植物基因或者T-DNA基因。這些序列可以包含于CTP-DMO序列的下游。3，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的例子是胭脂氨酸合酶3'區(qū)(nos3，；Fraley等人，1983)。舉例說明了不同的3'非翻譯區(qū)的應(yīng)用(Ingelbrecht等人，1989)。來自豌豆RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9;Coruzzi等人，1984)、AGRtu.nos(Genbank登記號E01312)、E6(登記號#U30508)和TaHspl7(小麥低分子量熱休克蛋白基因；登記號弁X13431)的多腺苷酸化分子特別有利地用于本發(fā)明。除了上述的表達(dá)元件以外，為了尤其在單子葉植物中表達(dá)編碼區(qū)，在啟動子和3，UTR之間可能需要內(nèi)含子。"內(nèi)含子"指的是多核苷酸分子，其可以從基因的基因組拷貝的間插序列分離或者鑒定，而且一般可以被定義為在翻i奪前mRNA加工過程中被剪切掉的區(qū)域?；蛘?，內(nèi)含子可以合成產(chǎn)生。內(nèi)含子本身可以包含影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的亞元件例如順式元件或者增強子區(qū)域。"植物內(nèi)含子"是在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的天然或者非天然的內(nèi)含子。植物內(nèi)含子可以用作調(diào)控元件來調(diào)節(jié)可操作地連接的一種或多種基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化構(gòu)建體中的多核苷酸分子序列可以包含內(nèi)含子。相對于可以轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列，內(nèi)含子可以是異源的。內(nèi)含子的例子包括玉米肌動蛋白內(nèi)含子(美國專利5641876)、玉米HSP70內(nèi)含子(ZmHSP70;美國專利5,859,347;美國專利5，424，412)和水稻TPI內(nèi)含子(OsTPI;美國專利7,132,528)，并且在實施本發(fā)明中是有益的?？梢酝ㄟ^植物組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法，在如原生質(zhì)體或者瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的單子葉或雙子葉植物細(xì)胞的測試系統(tǒng)中測試CTP-DMO構(gòu)建體是否提供DMO的正確加工。按照本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域中已知的任一種將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入植物的技術(shù)(參見，例如，Miki等人，1993)。據(jù)信，合適的植物轉(zhuǎn)化方法實際上包括任一種可將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，如美國專利5,384,253所描述的電穿孔法；美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160，208、6,399,861和6,403,865所描述的微粒轟擊法；美國專利5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301所描述的土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法；和美國專利5,508,184描述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。通過應(yīng)用如這些方法的技術(shù)，實際上任何植物種的細(xì)胞都可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，而且這些細(xì)胞可以發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。美國專利5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344公開了在棉花轉(zhuǎn)化中特別有用的技術(shù)。例如，在美國專利5,750,871中特別公開了轉(zhuǎn)化蕓苔屬(5raM/w)植物的技術(shù)；例如，在Zhang等人,1999、美國專利6,384,301和US7,002,058中公開了轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)。在WO9506722中公開了轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)?？梢杂糜诒景l(fā)明的植物的一些非限制性例子包括苜蓿、大麥、豆類、甜菜、花莖甘藍(lán)、巻心菜、胡蘿卜、油菜、花椰菜、芽菜、大白菜、玉米、棉花、黃瓜、干豆、茄子、茴香、青刀豆、葫蘆、韭菜、萵苣、甜瓜、燕麥、黃秋葵、洋蔥、豌豆、胡椒、南瓜、花生、馬鈴薯、南瓜、蘿卜、水稻、高粱、大豆、菠菜、倭瓜、甜玉米、甜菜、向日葵、西紅柿、西瓜和小麥。實現(xiàn)將外源DNA導(dǎo)入接受體細(xì)胞后，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的下一步一般涉及鑒定用于進(jìn)一步的培養(yǎng)和植物再生的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可能需要與按照本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)化載體一起使用可選擇或可篩選的標(biāo)記基因。在這種情況下，一般接下來通過將細(xì)胞暴露于一種或多種選擇劑檢測可能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群，或者針對需要的標(biāo)記基因的性狀篩選細(xì)胞。在暴露于選擇劑后存活的細(xì)胞，或者在篩選試驗中評分為陽性的細(xì)胞，可以在支持植物再生的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。任何合適的植物組織培養(yǎng)基，例如，MS或者N6培養(yǎng)基(Mumshige和Skoog,1962;Chu等人,1975),可以通過包含如生長調(diào)節(jié)劑的其它物質(zhì)進(jìn)行改變?？梢栽诤猩L調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上維持組織，直到獲得足夠的組織來開始植物再生工作，或者進(jìn)行反復(fù)幾輪人工選擇，直到組織的形態(tài)適合再生，典型地至少兩周，然后轉(zhuǎn)移到有助于幼苗形成的培養(yǎng)基上。定期轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直到發(fā)生足夠的幼苗形成。一旦幼苗形成，就將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的培養(yǎng)基上。一旦形成足夠的根，就可以將植物轉(zhuǎn)移到土壤中進(jìn)一步生長和成熟。為了證實外源DNA或者"轉(zhuǎn)基因，，在再生植物中的存在，可以進(jìn)行多種試驗。這樣的試驗包括，例如，"分子生物學(xué)"試驗，如DNA印跡法和RNA印跡法和PCRtm;"生物化學(xué)，，試驗，如檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如，通過免疫學(xué)方法(ELISA和蛋白質(zhì)印跡法)或者通過酶功能；植物部分試驗，如葉或者根試驗；以及，通過分析整個再生植物的表型。一旦轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入植物中，就可以通過雜交將該基因?qū)氲饺魏闻c該第一植物性相容的植物中，而根本不需要直接轉(zhuǎn)化第二種植物。因此，本文中使用的術(shù)語"后代"指的是按照本發(fā)明制備的親本植抹的任何一代后代，其中，該后代包含按照本發(fā)明制備的選擇的DNA構(gòu)建體。因此，"轉(zhuǎn)基因植物"可以是任何一代。如本文公開的，"雜交"一種植物以提供相對于初始植物系具有一個或者多個添加的轉(zhuǎn)基因或者等位基因的植物系，被定義為通過將初始系與包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或者等位基因的供體植物系雜交從而導(dǎo)致特定的序列被導(dǎo)入植物系中的技術(shù)。為了實現(xiàn)這一點，例如，可以進(jìn)^f亍如下步驟(a)種才直第一(初始系)和第二(包含需要的轉(zhuǎn)基因或者等位基因的供體植物系)親本植林的種子；(b)將第一和第二親本植抹的種子培育成有花的植物；(c)用第二親本植物的花粉對第一親本植物的花授粉；和(d)收獲具有已受精的花的親本植物上產(chǎn)生的種子?？梢詼y試穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物組織和植物是否通過DMO蛋白質(zhì)的正確加工提供麥草畏耐受性。在農(nóng)作物植物中提供麥草畏耐受性可以用來設(shè)計控制生長環(huán)境中的雜草生長的方法，包括向農(nóng)作物生長環(huán)境施用有效控制雜草生長的量的麥草畏除草劑。麥草畏除草劑以一定的量自上方向農(nóng)作物生長環(huán)境施用，所述麥草畏除草劑的量不損傷用CTP-DMO構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物植物或種子，卻損傷具有同樣的基因型但是缺乏CTP-DMO構(gòu)建體的農(nóng)作物才直物。基于公開的內(nèi)容，用于本發(fā)明的除草劑組合物的制備對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這樣的可商購的組合物除了活性成分外，典型地還包含如表面活性劑、固體或液體載體、溶劑和粘合劑等組分?？捎糜谙蛑参锸┯玫谋砻婊钚詣┑睦影ㄒ韵挛镔|(zhì)的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽芳香族磺酸類，例如，木素磺酸、苯酚磺酸、萘磺酸和二丁基萘磺酸，和脂肪酸、芳基磺酸酯、烷基醚、月桂基醚、脂肪醇硫酸鹽和脂肪醇二醇醚硫酸鹽，磺化萘及其衍生物與甲醛的縮合物、萘或萘磺酸與苯酚和甲醛的縮合物、苯酚或苯酚磺酸與甲醛的縮合物、苯酚與曱醛和亞硫酸鈉的縮合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化的異辛基-、辛基-或壬基苯酚、三丁基苯基聚二醇醚、烷基芳基聚醚醇、異十三烷醇、乙氧基化的蓖麻油、乙氧基化的三芳基苯酚、磷酸化的三芳基苯酚乙氧基化物的鹽、月桂醇聚二醇醚乙酸酯、山梨醇酯、木質(zhì)素-亞硫酸鹽廢液或甲基纖維素，或它們的混合物。表面活性劑應(yīng)用的常見實例是大約0.25重量%-1.0重量％,更常用地為大約0.25重量％-0.5重量％。向植物施用的組合物可以是固體或液體。使用固體組合物時，可能需要包含一種或多種載體材料和活性化合物。載體的例子包括礦物土，如硅石、硅膠、硅酸鹽、滑石、高呤土、鎂質(zhì)粘土(attaclay)、石灰石(limestone)、白堊(chalk)、黃土(loess)、粘土、白云石(dolomite)、珪藻土(diatomaceousearth)、石克酸4丐、石危酸鎂、氧化鎂、磨碎的合成材料，肥料，如辟u酸銨、磷酸銨、硝酸銨、石克脲和脲，植物來源的產(chǎn)品，如谷物粗粉、樹皮粗粉、木粉和堅果殼粗粉、纖維素粉、珪鎂土(attapulgites)、蒙脫石(montmorillonites)、云母(mica)、蛭石(vermiculites)、合成的二氧化硅和合成的硅酸鈣，或它們的混合物。對于液體溶液，可以包含水:容性的化合物或鹽，如石克酸鈉、碌u酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、硫酸氫銨、氯化銨、醋酸銨、甲酸銨、草酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、硫代硫酸銨、二磷酸氫銨、磷酸二氬銨、磷酸氫銨鈉、硫氰酸銨、氨基磺酸銨或氨基甲酸銨。除草劑組合物中的其它示例性的成分包括粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、部分水解的聚醋酸乙烯酯、羧甲基纖維素、淀粉、乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物和聚醋酸乙烯酯或它們的混合物；潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、滑石或聚乙二醇或它們的混合物；防泡劑，如乳化硅油、長鏈醇、磷酸酯、乙炔二醇、脂肪酸或有機氟化合物；和螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)的鹽、三次氮基三乙酸的鹽或聚磷酸的鹽或它們的混合物。可以使用從大約2.5g/ha到大約10,080g/ha的麥草畏，包括大約2.5g/ha-大約5,040g/ha、大約5g/ha-大約2,020g/ha、大約10g/a-大約820g/h和大約50g/ha-大約l，OOOg/ha、大約100g/ha-大約800g/ha和大約250g/ha-大約800g/ha。CTP-DMO構(gòu)建體可以連接到包含用于可篩選/可評分/可選擇的標(biāo)記和/或賦予另一種需要的性狀的遺傳元件的一個或者多個多核苷酸分子上。通常用來篩選推測轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因包括f3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、p-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Jefferson，1987;Teeri等人,1989;Koncz等人1987;DeBlock等人，1984)、綠色熒光蛋白(GFP)(Chalfie等人，1994;Haseloff和Amos,1995;和PCT申請WO97/41228)。例如，在Miki和McHugh,2004中描述了選擇性標(biāo)記基因的非限制例子。賦予另一種需要的性狀的核苷酸分子包括，但不限于提供需要的與植物形態(tài)、生理、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)強化、抗病性或抗蟲性、或環(huán)境或化學(xué)耐受性有關(guān)的特性的基因，還可以包括遺傳元件，包括除草劑抗性(美國專利6,803,501;6,448,476;6,248,876;6,225,114;6,107,549;5,866,775;5,804,425;5,633,435;5,463,175)、增加的產(chǎn)量(美國專利RE38，446;6,716,474;6,663,906;6,476,295;6,441,277;6,423,828;6,399,330;6,372,211;6，235，971;6,222,098;5，716,837)、害蟲控制(美國專利6，S09，078;6,713，063;6,686,452;6,657,046;6,645,497;6,642,030;6,639,054;6,620,988;6,593,293;6，555，655;6,538,109;6,537,756;6,521,442;6,501,009;6,468,523;6,326,351;6,313,378;6,284,949;6,281,016;6,248,536;6,242,241;6,221,649;6,177,615;6,156,573;6,153,814;6,110,464;6,093,695;6,063,756;6,063,597;6,023,013;5，959，091;5,942,664;5,942,658,5，880，275;5,763,245;5,763,241)、真菌病4元'性(美國專利6,653,280;6，573，361;6,506,962;6，316，407;6,215,048;5,516,671;5,773,696;6，121，436;6,316,407;6，506，962)、病毒抗性(美國專利6,617,496;6,608,241;6,015,940;6,013,864;5,850,023;5,304,730)、線蟲抗性(美國專利6,228,992)、細(xì)菌性疾病抗性(美國專利5,516,671)、植物生長發(fā)育(美國專利6,723,897;6，518，488)、淀粉生產(chǎn)(美國專利6,538,181;6,538,179;6,538,178;5,750,876;6,476,295)、改變的油的生產(chǎn)(美國專利6,444,876;6，426，447;6，380，462)、高油產(chǎn)量(美國專利6,495,739;5,608,149;6,483,008;6,476,295)、改變的脂肪酸含量(美國專利6,828,475;6,822,141;6,770,465;6，706，950;6，660，849;6,596,538;6,589,767;6,537,750;6，489，461;6,459,018)、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量(美國專利6,380,466)、果實成熟(美國專利5，512，466)、加強的動物和人的營養(yǎng)(美國專利6,723,837;6,653，530;6,541,259;5,985,605;6,171,640)、生物聚合物(美國專利RE37,543;6,228,623;5，958,745和美國專利公開US20030028917)、環(huán)境應(yīng)激耐受性(美國專利6,072,103)、藥物肽和可分泌的肽(美國專利6,812,379;6，774，283;6,140,075;6,080,560)、改進(jìn)的加工性狀(美國專利6,476,295)、提高的可消化性(美國專利6,531,648)、低水平的棉子糖(美國專利6,166,292)、工業(yè)酶生產(chǎn)(美國專利5,543,576)、改進(jìn)的香味(美國專利6,011,199)、固氮(美國專利5,229,114)、雜交種子生產(chǎn)(美國專利5,689,041)、纖維生產(chǎn)(美國專利6,576,818;6,271,443;5,981,834;5，869，720)和生物燃料生產(chǎn)(美國專利5,998,700)。這些或者其它的遺傳元件、方法和轉(zhuǎn)基因中的任一種可以用于本發(fā)明，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本公開內(nèi)容可以理解的。另外，一個或者多個連接到CTP-DMO構(gòu)建體上的多核苷酸分子通過編碼導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)的靶向抑制(例如經(jīng)過反義、抑制性RNA(RNAi)或者共抑制介導(dǎo)的機制)的RNA分子，可以實現(xiàn)上面提到的植物特性或者表型。RNA也可以是催化性的RNA分子(即核酶)，設(shè)計用來切割需要的內(nèi)源性mRNA產(chǎn)物。因此，任何編碼影響感興趣的表型或者形態(tài)學(xué)改變的轉(zhuǎn)錄RNA分子的多核苷酸分子可以用于實踐本發(fā)明。本發(fā)明也公開了生產(chǎn)食物、飼料或工業(yè)產(chǎn)品的方法，包括包含CTP-DMO構(gòu)建體的植物或者這種植物的一部分，以及從植物或者其部分制備食物、飼料、纖維或工業(yè)產(chǎn)品，其中，食物或飼料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或蛋白質(zhì)，且工業(yè)產(chǎn)品是生物燃料、纖維、工業(yè)化學(xué)品、藥物或營養(yǎng)品。本發(fā)明的另一方面涉及改進(jìn)單子葉植物的直立能力的方法，包括a)獲得并種植通過將親本植林與它自身或者第二植抹雜交產(chǎn)生的植物，其中親本植抹和/或第二植抹包含所述DNA構(gòu)建體，并且耐受麥草畏的植物從所述的親本植抹和/或第二植抹遺傳了該DNA構(gòu)建體；和b)用麥草畏處理該植物。可以測量包括支柱根的數(shù)量、形狀、長度或結(jié)構(gòu)、倒伏百分比和產(chǎn)量的與直立能力相關(guān)的參數(shù)。在某些實施方案中，植物是玉米植物。實施例下述這些實施例用來說明本發(fā)明的實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)的實踐中良好地發(fā)揮作用的技術(shù)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容應(yīng)該理解，可以對公開的特定的實施方案進(jìn)行許多改變，仍然獲得相同或類似的結(jié)果，而沒有偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地說，顯然某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑可以代替本文中所述的試劑，而將獲得相同或相似的結(jié)果。所有這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的類似的代替和修改，被認(rèn)為是在所附的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。實施例1用于轉(zhuǎn)化的CTP-DMO構(gòu)建體的制備按照標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Sambrook等人，1989)制備表2中所示的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體在植物啟動子和多腺苷酸化信號序列之間包含與DMO基因或其變體可操作地連接的CTP。如下所述，在玉米原生質(zhì)體系統(tǒng)或在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的擬南芥或者大豆植物中測試這些構(gòu)建體。表l.通過不同的CTP，DMO和DMO變體的加工。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例2玉米原生質(zhì)體中的CTP-DMO構(gòu)建體的分析從12天的黃化幼苗(來自LH200xLH5雜交)制備玉米葉葉肉原生質(zhì)體。將第二葉的中間部分(大約6cm長)用刀片切割成0.5mm的條，并且在真空過濾30分鐘后，在燒瓶中用含有2。/。(w/v)纖維素酶RS、0.3%(w/v)離析酶R10(都來自KarlanResearchProductsCorp,SantaRosa,CA)、0.6M甘露醇、10mMMES(pH5.7)和1mMCaCl2的酶溶液在23°C消化不超過2小時。來自過濾的和消化的葉組織的原生質(zhì)體通過用手搖動燒瓶5分鐘釋放，并通過6(Him尼龍網(wǎng)過濾分離。原生質(zhì)體通過以150g離心2分鐘收集，用0.6M冷甘露醇溶液洗滌一次，離心，以2x106/mL再懸浮于冷0.6M甘露醇中。然后使用聚乙二醇(PEG)，以12.5iagDNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，并在室溫下孵育16-20小時。原生質(zhì)體存儲于-80。C，直到通過蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)分析。原生質(zhì)體在水上融化，并將1-3倍體積的含有5.0%(3-ME的2xLaemmli樣品緩沖液/染料(BioRad)力口到原生質(zhì)體。然后將原生質(zhì)體蛋白質(zhì)樣本的等分試樣加熱到大約100。C保持5分鐘，并加樣到預(yù)制的Tris-HCL10%聚丙烯酰胺凝膠上。在大約80-100Amps的恒定電流下電泳大約35分鐘。然后將蛋白質(zhì)在100V恒定電壓下從凝膠電轉(zhuǎn)移至0.2微米的硝酸纖維素膜上進(jìn)行1-3小時。膜用TBST中的5%(w/v)奶粉在室溫下封閉1小時或者在4。C下封閉過夜。用在TBST中1:200稀釋的山羊抗-DMO抗體探測膜1小時。使用TBS沖洗3次，每次5分鐘，以除去過量的抗體。用在含0.5%(w/v)奶粉的TBST中以1:7,500比例稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗山羊IgG(Sigma,St.Louis,MO)探測膜1小時。用TBST沖洗3次，每次5分鐘，以除去過量的過氧化物酶偶聯(lián)物。除了那些特別指出的以外，所有的程序，包括封閉和所有的其它孵育，在室溫下進(jìn)4亍。<吏用ECL4全測系統(tǒng)(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)顯示免疫活性的條帶，并在KodakBioMaxMS膠片上曝光。適當(dāng)大小的免疫活性條帶的存在表明DMO的正確加工和定位(表1)。因此，例如，使用可操作地連接到DMO上并轉(zhuǎn)化到玉米原生質(zhì)體中的CTP4在蛋白質(zhì)印跡分析后產(chǎn)生38kDa的免疫活性條帶。實施例3各種CTP-DMO構(gòu)建體在擬南芥中的測試按照Clough和Bent(1998)開發(fā)的方法，轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞生態(tài)型植物。將通過這種方法獲得的種子接種到含有0.5、1.0到2.0或4.0毫克/升的多種濃度麥草畏的植物選擇培養(yǎng)基上。將這些板在4。C孵育48小時，然后轉(zhuǎn)移到設(shè)定為23.5°C、具有16小時光周期的Percival孵箱中。用CTP-DMO構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的種子在含有麥草畏的培養(yǎng)基上生長成植物，并長出初生葉和次生葉，而未轉(zhuǎn)化的種子和陰性分離子(segregants)死亡或者沒有長出初生葉和次生葉。通過InvaderPCR試驗檢測為3，UTR陽性的轉(zhuǎn)基因植物用于進(jìn)一步分析。來自轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的3-5個葉穿孔用于蛋白質(zhì)印跡分析。在Harbilpaint振搖器中用500-1000piPSBT和4個玻璃珠進(jìn)行蛋白質(zhì)提取3分鐘。在4。C下以3000rpm旋轉(zhuǎn)樣本3分鐘。向上清液的等分試樣中加入等體積的含有5.0%(3-ME的2xLaemmli樣品緩沖液/染料(cat.No.161-0737BioRad)。蛋白質(zhì)印跡分析的其余步驟與實施例2中一樣。正確大小的免疫活性條帶的存在表明DMO的正確加工和定位(表2)。例如，如表2所示，在用pMON73749或者pMON73725轉(zhuǎn)化擬南芥后可見的條帶的比較中，使用缺少來自豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的27個氨基酸的編碼序列的RbcSnoc-CTP產(chǎn)生定位于葉綠體的正確加工的DMO，而使用包含27個氨基酸的編碼序列的RbcSCTP則產(chǎn)生2個免疫活性條帶。實施例4CTP-DMO構(gòu)建體在大豆中的測試使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過土壤桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化(例如，Zhang等人，1999;US7,002,058)獲得轉(zhuǎn)基因大豆(例如，cvs.Thorne,NE3001和A3525)植物。來自轉(zhuǎn)基因大豆植物的3-5個葉穿孔用于蛋白質(zhì)印跡分析。在Harbilpaint振搖器中用500-1000plPSBT和4個玻璃珠進(jìn)行蛋白質(zhì)提取3分鐘。在4。C下以3000rpm旋轉(zhuǎn)樣本3分鐘。向上清液的等分試樣中加入等體積的2xLaemmli樣品緩沖液/染料(BioRad)/5.0%卩-ME。蛋白質(zhì)印跡分析的其余步驟與實施例2中一樣。正確大小的免疫活性條帶的存在表明DMO的正確加工和定位(表2)。用構(gòu)建體(其編碼連接到附著有核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶編碼區(qū)的另外24個氨基酸和由于引入限制性酶識別位點而添加的3個氨基酸的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶轉(zhuǎn)運肽上的DMO)轉(zhuǎn)化的大豆植物，當(dāng)在出土前階段用0.51b的麥草畏處理接著在出土后(V6)階段用21b麥草畏處理時，顯示17-20%的損傷率。將其與用編碼只連接到豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶轉(zhuǎn)運肽上的DMO的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆植物進(jìn)行比較，后者顯示大約12%的損傷率。這些結(jié)果表明使用沒有額外氨基酸的轉(zhuǎn)運肽導(dǎo)致單一DMO活性的產(chǎn)生(而不是多個部分或不同加工的多肽)和對麥草畏的較高的耐受性。單一形式的酶的產(chǎn)生也導(dǎo)致易于表征產(chǎn)品和降低注冊費用。實施例5DMO的高效生產(chǎn)和較高的麥草畏耐受性需要CTP用如實施例3所述的幾種構(gòu)建體(圖1)轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞生態(tài)型植物。在包含從0.5、l.O到2.0毫克/升的各種濃度的麥草畏的植物組織培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的種子。用CTP-DMO構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的種子在含有麥草畏的培養(yǎng)基上生長成植物，并長出初生葉和次生葉，而未轉(zhuǎn)化的種子和陰性分離子死亡或者沒有長出初生葉和次生葉。生長并檢測為DMO基因陽性的轉(zhuǎn)基因植物用于進(jìn)一步分析。如圖1所示，用不含CTP的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物幾乎沒有或者沒有表現(xiàn)出對麥草畏的耐受性。當(dāng)在出土前階段用0.5lb/a的麥草畏處理接著在出土后(V6)階段用2lb/a的麥草畏處理時，用編碼沒有連接到CTP上的DMO的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆植物沒有顯示出土前耐受性，而用其中DMO連接到CTP上的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物顯示出土前和出土后對麥草畏的耐受性。實施例6耐受麥草畏的轉(zhuǎn)基因玉米植物的產(chǎn)生為了測試DMO基因在向單子葉植物提供麥草畏耐受性方面的用途，在植物基因表達(dá)元件如啟動子(例如，PC1SV、e35S、OsActl、OsTPI、OsActl5)和內(nèi)含子(例如，OsActl、OsActl5、OsTPI、ZmHSP70)的控制下，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因玉米植物，其包含DMO基因(例如，SEQIDNOS:29、33、35、37、39),具有或者不具有轉(zhuǎn)運肽(例如，TaWaxy、CTP1、CTP2合成、CTP4)。該表達(dá)元件包含來自水稻肌動蛋白l基因的第一內(nèi)含子和側(cè)翼UTR外顯子序列，還在5，端包含外顯子1的12nt和在3，端包含外顯子2的7nt,還有3，UTR(例如，TaHspl7)。轉(zhuǎn)基因玉米植物基本上通過美國專利申請20040244075所述的方法產(chǎn)生。在單一位置重復(fù)試驗中評價具有單一拷貝的轉(zhuǎn)基因玉米事件的麥草畏耐受性。使用來自6個構(gòu)建體中的每一個的6個事件。實驗設(shè)計如下歹'J/項目1;處理在V3階段的0.5lb/a麥草畏，接著在V8階段的1lb/a麥草畏(Clarity⑧，BASF,Raleigh,NC);重復(fù)2;行距30英寸；地塊長度最小20英尺；植物密度大約30抹/17.5英尺；通道(alley):2.5英尺。整個地塊均勻施肥以獲得農(nóng)藝學(xué)上可接受的農(nóng)作物。為了控制玉米根蟲，在耕種時期施用每排1000英尺5盎司土壤殺蟲劑，如Force3G(SyngentaCropProtection,Greensboro,NC,USA)。^果》見察到小地老虎(blackcutworm)的侵?jǐn)_，以每英畝4-8盎司的量施用POUNCE3.2EC(FMCCorporation,Philadelphia,PA)。此外，使用噴灑殺蟲劑計劃以控制所有地上的鱗翅目害蟲，包括歐洲玉米螟、玉米耳蟲和秋季粘蟲。每3周以每英畝4-8盎司的量施用POUNCE3.2EC以控制鱗翅目害蟲；大約施用4次。出土前施用如HarnessXtra5.6L(Monsanto,St.Louis，MO)禾口DegreeXtra(Monsanto,St.Louis,MO)的除草劑，以保持地塊無雜草。在整個實驗中，如果在未處理的檢查中觀察到雜草出現(xiàn)，則通過手工除草或者出土后施用PERMIT(Monsanto,St.Louis,MO)或者BUCTRIL⑧(Bayer，ResearchTrianglePark,NC)控制雜草。當(dāng)在V3階段用0.5lb/a麥草畏處理接著在V8階段用1lb/a麥草畏處理時，通過測量支柱根損傷來測試用包含DMO轉(zhuǎn)基因的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米近交系的麥草畏耐受性。通過計數(shù)一排中與"手指樣"結(jié)構(gòu)的典型形態(tài)相比顯示支柱根融合的"非典型"形態(tài)的植物的數(shù)量，目視評價支柱根損傷。如表4所示，用編碼未與CTP連接的DMO的DNA構(gòu)建體(pMON73699、pMON73704)轉(zhuǎn)化的玉米植物顯示較高水平的支柱根損傷，即，麥草畏處理后的低水平保護。編碼連接到CTP上的DMO的DNA構(gòu)建體(pMON73716、pMON73700、pMON73715、pMON73703)顯示較低水平的支柱根損傷，即，麥草畏處理后較高水平的保護。表4.用攜帶DMO的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米在測試麥草畏耐受性時顯示出的支柱根損傷百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>從在不同的植物物種中進(jìn)行的這些研究(另外，例如，實施例3、4和8)可見，葉綠體轉(zhuǎn)運肽可用于DMO的高效靶向和DMO活性的完全產(chǎn)生，導(dǎo)致對麥草畏較高的耐受性。此外，在玉米中CTP-DMO的表達(dá)提供了對麥草畏的出土前耐受性。實施例7有效DMO表達(dá)單元的構(gòu)建一些遺傳元件可以影響基因的有效表達(dá)，如啟動子、葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列、內(nèi)含子、5'UTR、基因的編碼區(qū)、3'UTR。然而，不清楚哪些組合運行最好。需要有效的DMO表達(dá)單元或者構(gòu)建體來產(chǎn)生改進(jìn)的產(chǎn)物如耐受麥草畏的種子和植物。通過可操作地連接各種啟動子、CTP、DMO變體和3'UTR中的各一種來構(gòu)建幾個DMO表達(dá)單元，以獲得用于產(chǎn)品開發(fā)的有效的DMO表達(dá)單元。通過本領(lǐng)域已知的方法將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大豆中(例如，U.S.6,384,301、U.S.7,002,058或Zhang等人，1999)。獲得轉(zhuǎn)基因種子，并檢測出土前和出土后對麥草畏除草劑的耐受性。表5顯示了當(dāng)種子和植物在出土前用0.51b/英畝麥草畏處理接著在出土后V6階段用2lb/英畝的麥草畏處理時，由麥草畏造成的損傷百分比(較低的損傷意味著較高的耐受性)。用不攜帶CTP的DNA構(gòu)建體pMON68939和pMON73723轉(zhuǎn)化的種子不能耐受麥草畏的出土前施用，表明為了獲得對麥草畏的出土前耐受性，需要將DMO靶向至葉綠體。用pMON68939和pMON73723(不含CTP)轉(zhuǎn)化的植物，在V3后階段用麥草畏以1lb/a的量處理后，分別顯示類似于野生型大豆(60%)的55%和57%的損傷率，而用pMON68938(含有CTP)轉(zhuǎn)化的植物顯示很低的損傷率。這些結(jié)果表明，在大豆中獲得對麥草畏的出土前和出土后耐受性需要CTP。表5.用特異性DMO表達(dá)單元轉(zhuǎn)化并在出土前和出土后用麥草畏處理的大豆植物顯示的損傷百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實施例8耐受麥草畏的轉(zhuǎn)基因棉花植物的產(chǎn)生為了測試DMO基因在給棉花提供麥草畏耐受性方面的用途，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物。產(chǎn)生了幾個DNA構(gòu)建體，它們攜帶在植物基因表達(dá)元件如啟動子(例如，PC1SV、FMV或e35S)和3'UTR(例如，E6;登記號弁U30508)控制下的具有轉(zhuǎn)運肽(例如，PsRbcSCTP、CTP1、CTP2)的DMO編碼區(qū)(例如，SEQIDNO:23、25、27、29、31、35),并如下所述轉(zhuǎn)化到棉花(陸地棉(Gossj^wm/^m^m))中。所用的培養(yǎng)基在表6中列出。棉花cvCokerl30的幼苗離體生長，并切下胚軸部分，并接種于攜帶DNA構(gòu)建體的根癌土壤桿菌的液體懸浮液，印跡干燥(blotdried),并共培養(yǎng)2天。然后將接種的胚軸外植體轉(zhuǎn)移到葡萄糖選擇培養(yǎng)基中4周，蔗糖選擇培養(yǎng)基中l(wèi)周，葡萄糖選擇培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4周，來誘導(dǎo)愈傷組織。在16/8(光/暗)循環(huán)和28。C下孵育培養(yǎng)物。然后將卡那霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到UMO培養(yǎng)基中，并在28-30°C、黑暗條件下培養(yǎng)16-24周來誘導(dǎo)生胚愈傷組織。然后從這些愈傷組織中收獲生胚愈傷組織，并在28-30。C、黑暗條件下、在TRP+培養(yǎng)基上維持長達(dá)4-16周。收獲來自生胚愈傷組織的小胚，并在SHSU培養(yǎng)基上、在28-30。C溫度下和6/8(光/暗)循環(huán)條件下發(fā)芽。然后將看起來正常的小植抹轉(zhuǎn)移到土壤中以獲得成熟的棉花植物。轉(zhuǎn)化抹的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)通過DNA檢測來證實。表6.用于棉花轉(zhuǎn)化的各種培養(yǎng)基的組成。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在V4-5生長階段以561gae/ha(0.5lb/a)的量用麥草畏(Clarity⑧，BASF,Raleigh,NC)處理包含這樣的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的棉花植物作為出土后處理，每個DNA構(gòu)建體包含DMO編碼區(qū)與轉(zhuǎn)運肽、啟動子和3'UTR的不同的組合，發(fā)現(xiàn)有耐受性，而未轉(zhuǎn)化的棉花植物顯示79%-86%的損傷率。選擇顯示超過95%的耐受性(等于少于5%的損傷)的轉(zhuǎn)基因植物用于進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)基因植物也對隨后的麥草畏出土后處理具有耐受性。例如，在V3-4階段用0.5lb/英畝的麥草畏處理隨后在V5階段或者更晚的階段用1或2lb/英畝的麥草畏處理的植物依然對麥草畏耐受。該實施例顯示DMO基因可以向各個生長階段的棉花提供麥草畏耐受性，因而能夠在各個階段施用麥草畏以獲得有效的雜草控制。實施例9提高玉米直立能力的方法如玉米的某些單子葉植物產(chǎn)生支柱根，支柱根從地表以上的節(jié)點生長，并有助于支撐植物和在生殖階段從土壤上層吸收水分和營養(yǎng)。如果得較弱時，健康的支柱根系統(tǒng)變得重要。為了控制闊葉雜草，允許對如玉米的單子葉植物使用如麥草畏和2，4-D的合成除草劑。對于玉米的出土后雜草控制，麥草畏是第五廣泛施用的除草劑。盡管用于控制闊葉雜草的最優(yōu)量是280-560克/公項(g/h)或者0.25-0.5lb/英畝，但是玉米中的平均使用量是168g/h或者0.151b/英畝，因為在更高的施用量和如熱天的某些環(huán)境條件下，麥草畏能夠損傷玉米。此外，幾種玉米雜交體，如DKC61-42、DKC64-77、DKC63-46、DKC66-21和DKC61-44,以及近交體，如01CSI6、16IUL2、70LDL5和90LCL6,對麥草畏施用敏感。敏感性以多種方式表現(xiàn)，如出現(xiàn)洋蔥剝離(onionleafing)、穗畸形、抹高降低或者不正常的支柱根的形成，例如融合或者扭曲的根的形成。支柱根變得多瘤節(jié)，趨向于成長在一起，并且不向土壤中生長來支撐植物。這可能導(dǎo)致較弱的玉米作物直立能力、較高的易倒伏性和最終的產(chǎn)量損失。一些含有麥草畏的除草劑產(chǎn)品，例如Clarity、BANVEL、MARKSMAN、DISTINCT、NORTHSTAR和CELEBRITYPLUS,可以導(dǎo)致這些效應(yīng)。提高玉米對麥草畏的耐受性在保護較接近耐受麥草畏的農(nóng)作物種類(如大豆、棉花)種植的玉米地也是有用的，而且其中允許更高的麥草畏施用量。本實施例提供了一種改進(jìn)玉米和其它單子葉植物的直立能力的方法，包括在玉米中引入DMO基因并用麥草畏處理玉米。在一個實施方案中，DMO基因在組成型啟動子的控制下表達(dá)，所述組成型啟動子也能夠在節(jié)點區(qū)域和/或支柱根中表達(dá)DMO。在另一個實施方案中，DMO基因在一種嵌合組成型和節(jié)點/支柱根特異性啟動子的控制下表達(dá)。在另一個實施方案中，DMO基因在根特異性啟動子如RCc3或者其變體(例如，在US20060101541中發(fā)現(xiàn)的SEQIDNOs:l-6)的控制下表達(dá)。DMO在支柱根中的表達(dá)導(dǎo)致支柱根沒有或者有較少的損傷，導(dǎo)致玉米的較高的直立能力、較少的倒伏，因而導(dǎo)致較高的產(chǎn)量。來自用各種DMO構(gòu)建體(在表7中列出)轉(zhuǎn)化的玉米植物的3個單拷貝事件的Rl或者Fl種子在4.0"托盤中發(fā)芽。將健康植物移植到大約IO，，的罐中。發(fā)芽和生長培養(yǎng)基包括Redi-earthTM(Scotts-SierraHorticulturalProductsCo.,Marysville，Ohio)。將罐》文在35英寸x60英寸的玻璃纖維澆水托盤中的毛細(xì)管墊上，用于在測試期間進(jìn)行亞澆灌，從而保持對于植物生長而言最佳的土壤含水量。用Osmocote(14-14-14緩釋；Scotts-SierraHorticulturalProductsCo.,Marysville,Ohio)以100gm/cu.ft.的量對罐施肥，以在溫室試驗期間維持植物生長。植物在29。C/21°C的晝/夜溫度、25%-75%的相對濕度的溫室中生長，以模擬晚春溫暖季節(jié)的生長條件。按照需要，為最少14小時的光照周期提供大約600^E的補充光。使用具有設(shè)定為最小24psi(165kpa)的大氣壓的Teejet9501E平扇噴嘴(SprayingSystemsCo,Wheaton,IL),用軌道噴霧器來施用麥草畏。噴嘴保持在比植物頂端高大約16英寸的位置進(jìn)行噴霧。噴霧體積是10加侖/英畝或者93升/公項。當(dāng)植物達(dá)到V4-5葉階段時，開始施用。通過在V4-5階段用2lb/英畝或者4lb/英畝的麥草畏處理，并在處理后24天評估植物的支柱根損傷(0%;沒有可見的損傷，到100%，植物完全死亡)和倒伏(傾斜程度)，來^r測用包含DMO表達(dá)單元的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米近交系的植物的支柱根損傷和倒伏情況。如表7所示，與未被轉(zhuǎn)化的對照近交系和只用選擇性標(biāo)記表達(dá)單元(pMON73746)轉(zhuǎn)化的植物相比較，用含有DMO表達(dá)單元的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米植物顯示沒有或者幾乎沒有支柱根損傷和倒伏。本實施例顯示當(dāng)用麥草畏處理時，包含DMO的植物可以被用來提供提高的直立能力。表7.當(dāng)用麥草畏處理時，用各種DMO構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米植物顯示沒有或者幾乎沒有支柱根損傷和倒伏。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>參考文獻(xiàn)以下列出的文獻(xiàn)引入本文作為參考，以補充、解釋、提供背景或教導(dǎo)本文采用的方法、技術(shù)和/或組合物。美國專利4,554,101;美國專利5,015,580;美國專利5,846,797;美國專利5，004，863;美國專利5,017,692;美國專利5,159,135;美國專利5,229,114;美國專利5,304,730;美國專利5,322,938;美國專利5,352,605;美國專利5，359，142;美國專利5,362,865;美國專利5,378,619;美國專利5,384,253;美國專利5，424,412;美國專利5,463,175;美國專利5,508,184;美國專利5，512,466;美國專利5,516,671;美國專利5,530,196;美國專利5,538,880;美國專利5,543,576;美國專利5,550,318;美國專牙5，552,299;美國專利5,641,876美國專利5,567,600;美國專牙5,567,862，美國專利5，591，616美國專利5，608，149;美國專牙5,633,435;美國專利5,635,055美國專利5,641,876;美國專禾5,659,122,美國專利5,689,041美國專利5,689,052;美國專牙5,716,837,美國專利5,728,925美國專利5,750,871;美國專牙5,750,876美國專利5,763,241:美國專利5,763,245,美國專牙5,773,696美國專利5,804,425:美國專利5,824,877;美國專牙5,837,848美國專利5,850,019,美國專利5,850,023,美國專5,859,347美國專利5,866,775;美國專利5,869,720'美國專禾5,942,664:美國專利5,958,745;美國專利5，959，091美國專牙5，981，834美國專利5,981,840;美國專利5,985,605，美國專矛5,998,700.美國專利5,942,658;美國專利5,880,275美國專禾'6，541，259.美國專利6，011,199;美國專利6,013,864美國專牙6,015,940美國專利6,023,013;美國專利6,051,753美國專禾6,063,597美國專利6,063,756;美國專利6,072,103,美國專牙6,080,560美國專利6,093,695;美國專利6,107,549美國專矛6,110,464美國專利6，121，436，美國專利6,140,075，美國專牙6,140,078美國專利6,153,814;美國專利6,156,573，美國專矛6,160,208美國專利6,166，292;美國專利6，171，640,美國專禾6,175,060美國專利6,177,611;美國專利6,177,615,美國專6，215，048美國專利6,221，649;美國專利6,222,098，美國專牙6，225，114美國專利6,228,623;美國專利6，228,992美國專牙6，232，526美國專利6,235,971，美國專利6,242,241,美國專禾6,248,536美國專利6，248,876;美國專利6,252,138,美國專牙6,271,443美國專利6,281,016;美國專利6,284,949;美國專牙6，294，714美國專利6，313，378;美國專利6,316,407;美國專矛6,326,351;美國專利6,372,211;美國專利6,380,462,美國專利6,380,466;美國專利6,384,301;美國專利6,388,170，美國專利6,399,330;美國專利6,399,861;美國專利6,403,865，美國專利6,423,828,美國專利6,426,446,美國專利6,426,447，美國專利6，429，357,美國專利6,429,362，美國專利6,433,252，美國專利6,437,217,美國專利6，441，277,美國專利6,444,876美國專利6，448，476美國專利6,459,018美國專利6,468,523美國專利6,476,295美國專利6，476，295美國專利6,483,008美國專利6,489,461美國專利6,495,739美國專利6，501,009:美國專利6,506,962美國專利6,506,962美國專利6,518,488,美國專利6,521,442美國專利6,531，648美國專利6,537,750,美國專利6,537,756美國專利6,538,109美國專利6,538,178:美國專利6,538,179美國專利6,538,181美國專利6,555,655:美國專利6,573,361美國專利6,576,818美國專利6,589,767:美國專利6,593,293:美國專利6，596,538:美國專利6,608,241;美國專利6,617,496:美國專利6,620,988美國專利6,624,344:美國專利6,635,806美國專利6,639,054美國專利6，642，030:美國專利6,645,497:美國專利6,653,280美國專利6,653,530，美國專利6,657,046.美國專利6,660,849美國專利6,663,906，美國專利6,686,452美國專利6,706,950,美國專利6,713,063美國專利6,716,474美國專利6,723,837美國專利6,723,897美國專利6,770,465美國專利6,774,283美國專利6,803,501美國專利6,809,078美國專利6,812,379美國專利6,822,141:美國專利6，828，475美國專利7,022,896;美國專利7,002,058;美國專矛jNo.7,132，528美國專利No.7,151,204;美國專利RE38,446;美國專利RE37，543。美國專利公開20030028917;美國專利公開20030135879;美國專利公開20030115626;美國專利公開20040244075;美國專利公開20050022261;美國專利公開20060101541;美國專利公開20060162010;41美國專利公開20060236420。美國臨時申請60/811,152;美國臨時申請60/884,854Akashi等人,尸五^S丄e".431:39-44,1998.Becker等人，尸/朋fMo/.說W.20:49,1992.Bevan等人，A/a,wre,304:184-187，1983.Bohlmann等人，尸/a"〃"7(3):491-501,1995.Carrington和Freed,o/KVo/o^64:1590-1597,1990.Chalfie等人，6We"ce,263(5148):802-805，1994.Chandler等人,地"/CW/，1:1175-1183,1989.Chu等人5We船Vz57m.ca18:659,1975.Clark等人,P/a"ZMo/.5Zo/.，16(6):1099-1101，1991.Clough和Bent,P/gWJ"16:735-743,1998.Cork和Khalil,爿^.j/p/.Mz.cra&o/"40:289-321,1995.Cork和Krueger，^v.^4///.Mkro&'o/.，36:1-66,1991.Coruzzi等人，￡71^(9/"3:1671-1679，1984.Creissen等人，P/a""，2(1):129-131,1992.Creissen等人，8:167-175,1995.DeBlock等人，EM^9人3(8):1681-1689,1984.Depicker等人,/Mo/.j/^/.GWzW.1:561-573,1982.Ebert等人，TVoc.A^/.JcW.L/5"A84:5745-5749,1987.歐洲申請646643歐洲申請553494Fraley等人，尸亂編.<SW.,,80:4803-4807,1983.Gardiner等人,P/aW尸/yw'o/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