專(zhuān)利名稱(chēng)：一種簡(jiǎn)單高效制備人γδT細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種體外大量?jī)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血
YS T細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞根據(jù)表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor, TCR)的不同分為兩類(lèi) TCRa β T細(xì)胞和TCR γ δ T細(xì)胞，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為α β T細(xì)胞和γ δ T細(xì)胞。其中γ δ T細(xì)胞是介于特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類(lèi)型的細(xì)胞，大多數(shù)為CD4和CD8分子雙陰性，少數(shù)可表達(dá)⑶8分子。γ δ T細(xì)胞主要分布于皮膚和黏膜組織，一般不超過(guò)T細(xì)胞總數(shù)的5%。γ δ T細(xì)胞具有特異性識(shí)別抗原而無(wú)MHC限制性，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能，是機(jī)體免疫監(jiān)視的第一道防線(xiàn)。但由于Y ST細(xì)胞在外周血和腫瘤組織中含量不高，要獲得大量高細(xì)胞毒活性的Y S T細(xì)胞是十分困難的。雖然已有技術(shù)通過(guò)抗TCR γ δ 抗體或非肽磷酸類(lèi)抗原獲得大量Y S T細(xì)胞，這無(wú)疑會(huì)增加其制備的成本。經(jīng)廣泛查閱國(guó)內(nèi)外專(zhuān)利文獻(xiàn)和各種出版物，迄今為止，均未見(jiàn)有實(shí)用、高效、快速體外大量?jī)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血Y δT細(xì)胞的發(fā)明或報(bào)道。因此發(fā)明一種實(shí)用、高效、快速體外大量?jī)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血
YST細(xì)胞的方法，對(duì)于γ δ T細(xì)胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗腫瘤和抗感染能力是非常重要的，對(duì)于攻克人類(lèi)渴望解決的惡性腫瘤性疾病這一難題也是十分有價(jià)值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種實(shí)用高效的體外大量擴(kuò)增人外周血Y δΤ細(xì)胞的方法?？朔F(xiàn)有制備Y S T細(xì)胞數(shù)量不足、細(xì)胞毒性低、成本高的限制。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種制備人Y δΤ細(xì)胞的方法，包括如下步驟培養(yǎng)結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)并制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原 (Mycobacterium tuberculosis heated antigen, Mtb—HAg),采集并分離夕卜周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，用 Mtb-HAg 激活，同時(shí)加入細(xì)胞因子 rhIL-2和rhIL-21，置于37°C，5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時(shí)后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液并補(bǔ)加等量的rhIL-2，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2 3天進(jìn)行補(bǔ)加含有等量 rhIL-2的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為(0. 5 2. 0) X 106/ml。10 15天即可以獲得大量、 高細(xì)胞毒活性的Y S T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述的Mtb培養(yǎng)基為蘇通式液體培養(yǎng)基或者M(jìn)iddlebrook7H9，Mtb經(jīng)過(guò)高壓蒸汽處理，并經(jīng)離心超濾制備成Mtb-HAg。所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得。所述Mtb-HAg的終濃度為5 10μ g/ml,rhIL-2的終濃度為50 500IU/ml，rhIL_21的終濃度為5 20ng/ ml。根據(jù)PBMCs的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間約為10 15天。本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說(shuō)明外，均市售可得。
本發(fā)明的有益效果是利用Mtb-HAg作為刺激劑，激活γ δ T細(xì)胞，并聯(lián)合細(xì)胞因子rhIL-2和rhIL-21共同刺激培養(yǎng)γ δ T細(xì)胞，使獲得的γ δ T細(xì)胞具有數(shù)量大、純度高、 細(xì)胞毒性強(qiáng)等特點(diǎn)，從而能夠滿(mǎn)足臨床的需要，同時(shí)與IPP等非肽磷酸類(lèi)抗原、抗TCR γ δ 抗體等刺激劑相比培養(yǎng)成本大大降低。解決了現(xiàn)有技術(shù)體外培養(yǎng)Y ST細(xì)胞數(shù)量低、毒性弱、成本高等問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為遵照常規(guī)方法和廠(chǎng)家提供的操作說(shuō)明執(zhí)行。實(shí)施例1本實(shí)施例1是用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原。包括以下步驟 1.將結(jié)核桿菌菌體種子濕重50 100克接種于200ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，于 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)2周，然后將其分裝到含有10% 30%新生牛血清的250ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶50ml，分裝成4瓶，再繼續(xù)于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4周，收集培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘以收獲結(jié)核桿菌菌體。2.將收集的菌體經(jīng)生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，115°C 高壓蒸汽處理20分鐘，4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘收集上清液，即為Mtb-HAg。實(shí)施例2本實(shí)施例2是用制備的Mtb-HAg刺激PBMCs，以獲取大量、高純度、高細(xì)胞毒活性的 Y δT細(xì)胞。具體操作包括以下步驟1.無(wú)菌條件下用血細(xì)胞分離機(jī)或50ml注射器采集患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。具體步驟為1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56 °C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1 2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。2.將上述分離的PBMCs置于含有1 10 μ g/ml的Mtb_HAg、50 500IU/ml rhIL-2,5 20ng/ml rhIL-21 和 10% 自體血菜的 RPMI1640、AIM-V 或 GT-T551 培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)細(xì)胞密度為(1 2)X106/ml，優(yōu)選的刺激劑和細(xì)胞因子的濃度分別為5yg/ ml Mtb-HAg、200IU/ml rhIL-2、lOng/ml rhIL-21，自體血漿的濃度為 5%，細(xì)胞的初始密度2 X 106/ml，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋內(nèi)，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)袋，于37°C、5 % C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時(shí)后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液并補(bǔ)加等量的rhIL-2，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2 3天進(jìn)行補(bǔ)加含有等量rhIL-2的培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞密度為(0. 5 2. 0) XlOVml0根據(jù)PBMCs的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間約為10 15天。在細(xì)胞培養(yǎng)的第 14天，培養(yǎng)增殖的人Y δ T細(xì)胞絕對(duì)擴(kuò)增細(xì)胞倍數(shù)平均高達(dá)500倍(n = 8)。實(shí)施例3本實(shí)施例3將對(duì)上述培養(yǎng)的Y δ T細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、純度及免疫表型和細(xì)胞毒活性檢測(cè)。具體操作包括以下步驟1.細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)小時(shí)即可見(jiàn)Y δ T細(xì)胞沉于培養(yǎng)器皿的底部，并趨于集落化，48小時(shí)集落開(kāi)始變大，培養(yǎng)6 10天即可以看到大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)10 天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)1個(gè)小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)10 天的細(xì)胞100 μ 1，加入100 μ 1 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。本發(fā)明制備的細(xì)胞活力大于95%。2.分別取第0、7、14、21和觀天的細(xì)胞，用含5%新生牛血清和0. 疊氮納的PBS 洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X 106/ml，每個(gè)檢測(cè)管內(nèi)加入50 μ 1細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記抗體(抗⑶3-FITC、抗TCR γ δ -ΡΕ)染色，4°C避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)文件采用WinMDI軟件分析。本發(fā)明制備的細(xì)胞制劑，⑶3+T細(xì)胞高度富集純度達(dá)到98%，γ δ T細(xì)胞從第10 14 天達(dá)到峰值平均為80% (n = 8)。3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Κ562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為lX105/ml、 5XioVml,2. 5X 104/ml，每孔取100 μ 1鋪于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)，取本發(fā)明制備的細(xì)胞調(diào)密度為IX 106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，使效靶比分別為10 1,20 1和40 1， 各密度設(shè)3個(gè)復(fù)孔并分別設(shè)置空白對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT 20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清，每孔加入DMSO 100 μ 1，于A570nm和A630nm處測(cè)吸光度 (A)值，計(jì)算出絕對(duì)A值(A = A570-A630)，按下式計(jì)算殺傷活性殺傷活性(％ ) = (A靶細(xì)胞+A效應(yīng)細(xì)胞-A效靶混合細(xì)胞)/A靶細(xì)胞X 100%。結(jié)果顯示本發(fā)明制備的Y δΤ細(xì)胞對(duì)Κ562細(xì)胞株具有較高的殺傷活性，殺傷率平均為82% (n = 8)。
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)單高效制備人Y S T細(xì)胞的方法，其特征在于(1)用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原；(2)用制備的Mtb-HAg刺激PBMCs，同時(shí)加入細(xì)胞因子rhIL_2和 rhIL-21 ；(3)細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2 3天進(jìn)行補(bǔ)加培養(yǎng)液；(4)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第10 15天收獲細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人YS T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述結(jié)核桿菌耐熱性抗原的制備方法為經(jīng)高壓蒸汽處理、離心超濾制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人YS T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述 Mtb-HAg的使用濃度為1 10μ g/ml，合適的刺激濃度為5μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人、ST細(xì)胞的方法，其特征在于，所述 rhIL-2的使用濃度為50 500IU/ml，合適的使用濃度為200IU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人YS T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述 rhIL-21的使用濃度為5 20ng/ml，合適的使用濃度為lOng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人YS T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行半量更換培養(yǎng)液，同時(shí)并補(bǔ)加等量的rhIL-2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種簡(jiǎn)單高效制備人YS T細(xì)胞的方法，其特征在于，所述根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2 3天進(jìn)行補(bǔ)加培養(yǎng)液，同時(shí)并補(bǔ)加等量的rhIL-2。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種體外大量?jī)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血γδT細(xì)胞的方法。本發(fā)明包括以下步驟(1)用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原；(2)用制備的結(jié)核桿菌耐熱性抗原，聯(lián)合細(xì)胞因子rhIL-2和rhIL-21刺激擴(kuò)增γδT細(xì)胞；(3)通過(guò)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀進(jìn)行純度和免疫表型分析、MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)條件和操作較為簡(jiǎn)便，能在短時(shí)間內(nèi)制備出大量、高純度、高細(xì)胞毒活性的γδT細(xì)胞，并且成本較為低廉。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102533649SQ20121003019
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者王宇環(huán), 羅曉玲, 馬飛 申請(qǐng)人:深圳市合一康生物科技有限公司