專利名稱：一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在肺纖維化治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體為基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞在肺纖維化治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)在體內(nèi)外可以誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，可以改善多種損傷組織的結(jié)構(gòu)與功能。MSC在多種肺臟損傷疾病中(包括肺纖維化)都體現(xiàn)出了其治療潛能。在藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物肺損傷模型中，通過血循環(huán)應(yīng)用骨髓MSC能有效減輕肺臟損傷和纖維化。同時(shí)，MSC的以下特點(diǎn)使其在肺損傷引起的肺纖維化治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢:(I)無移植排斥反應(yīng):MSC屬于免疫赦免細(xì)胞；(2)MSC可歸巢至受損傷的肺臟局部，且可在刺激因子的作用下獲得肺泡上皮細(xì)胞的表型；(3)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng):MSC通過其免疫抑制功能(抑制免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等的激活)和改變細(xì)胞因子在疾病炎性過程中的表達(dá)譜(如抑制TNF-a、IL-1 β、IL_6等多種炎性細(xì)胞因子基因及蛋白的表達(dá)；抗炎 性細(xì)胞因子IL-10、IL-4等分泌增多)來發(fā)揮其抗炎作用；(4)抗凋亡:通過釋放細(xì)胞因子發(fā)揮其抗凋亡作用；(5)促血管生成:通過釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular en dothelial cell growth factor, VEGF),肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegr owth factor,HGF),膜島素樣生長因子(insulin like growth factor, I GF-1)等來發(fā)揮其促進(jìn)血管生成作用；(6)抑制纖維化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá):包括I型和III型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotei nase,MMP-l)和金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitor of metal1pr oteinase, TIMP-1)等。肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)是一種多功能的生長因子,它在體內(nèi)參與并主導(dǎo)促血管生成、抑制纖維化、抑制細(xì)胞凋亡和抗炎等病理生理學(xué)過程，在肺臟修復(fù)過程中具有以下幾方面的生理作用:(I)促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生而利于肺泡修復(fù)；(2)抑制炎癥因子的表達(dá):如可溶性細(xì)胞間粘附分子-1 (sICAM-1)等；
(3)抑制細(xì)胞凋亡:通過激活PI3K/Akt信號(hào)途徑、SPK-SlP信號(hào)途徑等來發(fā)揮其抗凋亡作用；(4)抑制纖維化效應(yīng):通過抑制促纖維化因子TGF-β的生成及其誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):激活 β-catenin 和 ρ42/ρ44ΜΑΡΚ 信號(hào)途徑,誘導(dǎo)環(huán)加氧酶-2 (Cyclooxygenase-2, C0X-2)表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)前列腺素E2 (Prostaglandin E2,PGE2)的產(chǎn)生來發(fā)揮抗纖維化作用；(5)促進(jìn)血管生成:通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成增加血液灌流,改善局部的血液供應(yīng)與低氧發(fā)生。而近期研究報(bào)道，HGF重組蛋白可以預(yù)防缺血再灌注導(dǎo)致的肺臟損傷；肺泡管HGF基因高表達(dá)可以抑制博萊霉素導(dǎo)致的肺纖維化，表明HGF是防治肺損傷及其引起的纖維化的理想的細(xì)胞生長因子。MSC和HGF均是防治肺損傷和纖維化的理想措施和手段。但是，它們的應(yīng)用均存在局限性。MSC植入體內(nèi)后脫離了特殊的培養(yǎng)環(huán)境，通過微循環(huán)滲透方式攝取營養(yǎng)，而營養(yǎng)所及范圍在100-200 μ m之間。因此，90%以上的細(xì)胞在植入的幾天內(nèi)因營養(yǎng)缺乏而很快死亡，細(xì)胞并不能很好發(fā)揮其抗炎、抗凋亡、促增殖等功能。而重組HGF結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體內(nèi)代謝快，為了獲得HGF在損傷肺部的高濃度就需要持續(xù)大劑量給予重組蛋白。因此，采用基因治療策略，用攜帶HGF的重組腺病毒修飾MSC治療肺損傷及其引起的肺纖維化，具有干細(xì)胞治療和細(xì)胞生長因子治療的雙重優(yōu)勢，并發(fā)揮協(xié)同作用。一方面通過血液循環(huán)移植，間充質(zhì)干細(xì)胞最初大部分蓄留或歸巢于損傷的肺臟，在發(fā)揮干細(xì)胞修復(fù)作用的同時(shí)，使局部高表達(dá)HGF,同時(shí)發(fā)揮HGF的生物學(xué)作用；而高表達(dá)HGF又可以促進(jìn)骨髓MSC的存活、增殖以及內(nèi)源性MSC的遷移和歸巢，從而加強(qiáng)MSC的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的新用途，即在肺損傷及其纖維化中的新應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是HGF修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在放射性肺損傷及纖維化治療中的應(yīng)用。本發(fā)明所屬的HGF為人肝細(xì)胞生長因子，其基因序列記載于Miyaz awa K，Tsubouchi H， Naka D， et al.molecular cloning and sequence analysis of cDNAfor human hepatocyte growth fator.Biochem.Biop hys.Res.Commun.1989,163 (2):967-973.;所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓或臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明所述的HGF修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法為:(I)采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法制備重組腺病毒Ad-HGF:將人HGF基因克隆到穿梭質(zhì)粒pXCJLl-cmv/pA的多克隆位點(diǎn)；然后與腺病毒載體GT4050通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組，于HEK293細(xì)胞包裝獲得重組腺病毒Ad_HGF。(2)擴(kuò)增Ad-HGF，并采用CsCl密度梯`度離心進(jìn)行純化和滴度測定；(3)分離、純化骨髓或者臍帶MSC，體外培養(yǎng)至第3代，Ad-HGF以150感染復(fù)數(shù)(MOI)的強(qiáng)度感染第3代MSC。本發(fā)明獲得的HGF修飾的MSC，分別采用ELISA檢測HGF的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測表面分子；Dy670染料法檢測細(xì)胞增殖；缺氧模型檢測細(xì)胞抗凋亡性能。本發(fā)明采用HGF修飾的MSC干預(yù)放射性肺損傷及纖維化的方法是，于Y射線照射后Ih內(nèi)尾靜脈注射HGF修飾的MSC。HGF修飾的MSC可以歸巢到損傷肺臟的局部，并表達(dá)HGF。HGF不但能夠發(fā)揮抗炎、抑纖維化、促肺泡上皮細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)，還能促進(jìn)移植的MSC細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)源性HGF的大量表達(dá)，并趨化內(nèi)源性MSC聚集到損傷部位；而130則能夠發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，減輕損傷局部的炎癥，包括抑制炎癥因子和促纖維化因子的分泌等。在HGF和MSC的聯(lián)合作用下，可有效減輕肺臟損傷，抑制膠原纖維的沉積，從而達(dá)到治療目的。


附圖1穿梭質(zhì)粒pXCJLl-cmv/pA-HGF構(gòu)建圖。附圖2Real-time PCR檢測MSC治療后肺臟局部人HGF的表達(dá):MSCs_Null為Ad-Null修飾的MSC治療組;MSCs-HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖3流式細(xì)胞檢測MSC細(xì)胞的表面分子:MSCs-Null為Ad-Null修飾的MSC ；MSCs-HGF為Ad-HGF修飾的MSC ；conrol為不標(biāo)抗體的陰性對(duì)照。
附圖4Dy670染色法檢測MSC細(xì)胞的增殖能力:control為Dye670處理MSC細(xì)胞后即刻檢測結(jié)果；MSCs-HGF 48h為感染Ad-HGF后48h檢測結(jié)果；MSCs_HGF 96h為感染Ad-HGF后96h檢測結(jié)果；MSCs-Null 48h為感染Ad-Null后48h檢測結(jié)果；MSCs_Null 96h為感染Ad-Null后96h檢測結(jié)果。附圖5HGF對(duì)MSC細(xì)胞凋亡的作用:1為常氧培養(yǎng)的MSC對(duì)照；2為低氧培養(yǎng)的Ad-Null感染的MSC細(xì)胞；3為低氧培養(yǎng)的Ad-HGF感染的MSC細(xì)胞。附圖6C57小鼠放射性肺損傷動(dòng)物模型建立:A為正常對(duì)照的HE染色；B為照射后28天的HE染色；C為照射后6個(gè)月的HE染色；D為照射后6個(gè)月的天狼猩紅染色。附圖7ELISA測定肺灌洗液中總蛋白、白蛋白和IgM(l個(gè)月):A為總蛋白；B為白蛋白；(:為 IgM。radiation 為 PBS 治療組；MSCs_Null 為 Ad-Null 修飾的 MSC 治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖8ELISA測定血清中TNF-α表達(dá)結(jié)果:radiation為PBS治療組；MSCs_Null為Ad-Null修飾的MSC治療組;MSCs-HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖9Real_time PCR檢測MSC治療I個(gè)月后肺臟局部TNF- α表達(dá)結(jié)果:MSCs-NulI為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖10ELISA測定血清中ICAM表達(dá)結(jié)果:radiation為PBS治療組；MSCs_Null為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs-HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖1lMSC治療后肺臟局部colIal的表達(dá):control為正常對(duì)照；radiation為PBS治療組；MSCs-Null為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖12MSC治療后肺臟局部col3al的表達(dá):control為正常對(duì)照；radiation為PBS治療組；MSCs-Null為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖13ELISA檢測小鼠血清中TGF-β的表達(dá)結(jié)果:radiation為PBS治療組；MSCs-NulI為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖14Real-time PCR檢測MSC治療I個(gè)月后肺臟局部TGF-β的表達(dá)結(jié)果:MSCs-NulI為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖15HGF對(duì)照射誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用(治療后14天):A為正常對(duì)照為PBS治療組；C為Ad-Null修飾的MSC治療組；D為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖16Real_time PCR檢測肺臟局部內(nèi)源性HGF表達(dá)的結(jié)果:Non-radiation為正常對(duì)照；radiation為PBS治療組；MSCs_Null為Ad-Null修飾的MSC治療組；MSCs_HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖17免疫組化檢測肺臟局部c-met表達(dá)的結(jié)果:A為PBS治療28天；B為PBS治療6個(gè)月；C為Ad-Null修飾的MSC治療28天；D為Ad-Null修飾的MSC治療6個(gè)月；E為Ad-HGF修飾的MSC治療28天；B為Ad-HGF修飾的MSC治療6個(gè)月。附圖18Real_time PCR檢 測肺臟局部c_met表達(dá)的結(jié)果:Non_radiation為正常對(duì)照；radiation 為 PBS 治療組；MSCs_Null 為 Ad-Null 修飾的 MSC 治療組；MSCs_HGF 為 Ad-HGF修飾的MSC治療組。附圖19Real-time PCR檢測肺臟局部的SlP受體表達(dá)的結(jié)果:A為SlP受體I出為SlP 受體 3 ;C 為 SlP 受體 5。radiation 為 PBS 治療組;MSCs_Null 為 Ad-Null 修飾的 MSC治療組；MSCs-HGF為Ad-HGF修飾的MSC治療組。28days為治療后28天；6months為治療后6個(gè)月。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組腺病毒-肝細(xì)胞生長因子(Ad-HGF)的制備和純化其方法是目的基因?qū)⑷薍GF基因克隆到穿梭質(zhì)粒pXCJLl-cmv/pA的多克隆位點(diǎn)，獲得pXCJLl-cmv/pA-HGF ;然后與腺病毒載體GT4050通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組，于HEK293細(xì)胞包裝獲得重組腺病毒Ad-HGF?；蚪M水平鑒定正確后，進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測定。(I)穿梭質(zhì)粒 pXCJLl-cmv-HGF 的構(gòu)建:首先用PCR方法從人胎盤cDNA文庫中擴(kuò)增肝細(xì)胞生長因子cDNA，將PCR產(chǎn)物克隆至pBluescript SK(pSK)載體的BamHI和Sail酶切位點(diǎn)中，命名為pSK_HGF。以限制性內(nèi)切酶Apa I酶切質(zhì)粒pBLUESCRIPTSK-HGF后，用DNA聚合酶Klenow大片段將該端補(bǔ)平，然后再用Not I酶切，回收大小約2.2kb的DNA片段(HGF cDNA);將HGF cDNA克隆至pXCJLl-CMV/PA載體的Hind III和Not I位點(diǎn)之間，從而獲得攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因表達(dá)盒以及腺病毒基因組左端序列的穿梭質(zhì)粒pXCJLl-CMV/pA-HGF(如附圖1)。根據(jù)pXCJLl_CMV/pA的酶切圖譜和結(jié)構(gòu)圖譜，結(jié)合pXCJLl-CMV/pA-HGF的構(gòu)建過程，用Hind III和Sal I雙酶切pXCJLl-CMV/PA-HGF，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，進(jìn)行鑒定。(2)重組腺病毒Ad-HGF的制備、純化和滴度測定通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法使鑒定正確的穿梭質(zhì)粒pXCJLl-CMV/HGF/P和腺病毒質(zhì)粒GT4050共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒。普通顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，9天可見噬斑形成，并逐漸擴(kuò)大，直至12d出現(xiàn)完全病變。收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍溶3次后收集上清，獲得重組腺病毒Ad-HGF。采用Hirt法提取病毒基因組DNA，并經(jīng)PCR鑒定正確。經(jīng)大量擴(kuò)增后，采用氯化銫密度梯度離心純化，并保存于10%甘油的Hank’s液中備用。紫外分光光度計(jì)法(波長260nm)和有限稀釋法(Median Tissue CultureInfective Dose，TCID50)分別測定輔助腺病毒 Ad5/Fllp_HV 的顆粒滴度(Viral ParticleUnits per Milliliter, vp/ml),純度(0D260nm/280nm)和感染滴度(Infection Units perMilliliter, IU/ml)。結(jié)果如表 I 所示。表I重組腺病毒Ad-HGF的純度和滴度測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)在肺損傷及纖維化治療中的應(yīng)用；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，治療肺損傷及纖維化的MSC來源于臍帶或骨髓，并通過感染150M0I的重組腺病毒獲得HGF修飾的MSC ；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺損傷及纖維化，包括放射性肺損傷、矽肺、塵肺等多種急、慢性肺損傷 。
全文摘要
一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在肺纖維化治療中的應(yīng)用，涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，包括骨髓或臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchy mal stem cell，MSC)的體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，重組腺病毒Ad-HGF介導(dǎo)肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)體外修飾MSC。基因修飾的MSC移植C57小鼠，干預(yù)放射所致肺損傷和纖維化，其可減少肺泡腔多種蛋白的滲出，包括白蛋白、IgM等；可減輕肺臟局部炎癥反應(yīng)，并抑制TNF-α和可溶性ICAM-1等多種因子表達(dá)；可抑制促纖維化因子TGF-β、膠原蛋白基因col1α1和col 3α1的表達(dá)，減少肺組織膠原纖維的沉積。內(nèi)源性HGF和及其受體cmet表達(dá)的結(jié)果，表明可誘導(dǎo)內(nèi)源性HGF表達(dá)和內(nèi)源性MSC歸巢到損傷部位。因此，采用HGF修飾的MSC治療多種病因引起的肺損傷及其纖維化意義重大。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103203025SQ20121000981
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者王 華, 王立生, 吳祖澤, 楊月峰, 肖鳳君, 段海峰, 李慶芳, 張群偉 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所