專(zhuān)利名稱(chēng)：體外抑制af116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究，特別是體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重大突破，已成為近期研究的熱點(diǎn)，不僅因?yàn)槠渚哂醒芯可窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要性，更主要的是其潛在的治療價(jià)值。Mckay等認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞指具有自我更新能力和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞。它的分化、遷移、成熟的過(guò)程是內(nèi)因和外因相互作用的結(jié)果，內(nèi)因也就是細(xì)胞基因的表達(dá)狀態(tài)。神經(jīng)干細(xì)胞要進(jìn)入臨床應(yīng)用，首先要解決的是定向分化問(wèn)題，因?yàn)橹挥懈闱迳窠?jīng)干細(xì)胞的分化機(jī)制，才能充分利用它的可塑性，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞替代。膽堿能神經(jīng)元是一種重要的神經(jīng)元，能取代由于肌委縮或脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失，能改善人或動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶等能力，對(duì)老年癡呆、癲癇等也具有重要的調(diào)節(jié)作用。該發(fā)明為體外獲得膽堿能神經(jīng)元提供了一條途徑，為治療老年癡呆、癲癇等疾病提供了一定的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過(guò)采用基因調(diào)控的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的定向分化。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的構(gòu)思為將編碼對(duì)應(yīng)AF116909基因特異序列的并能形成小的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(small hairpin RNA，shRNA)的一對(duì)57bp DNA回文序列插入到含有RNA聚和酶III(Pol III)U6啟動(dòng)子的pSilenCircle載體中構(gòu)建成shRNA表達(dá)載體，再將該shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到NSCs中，觀(guān)察到NSC的分化情況。
根據(jù)上述的構(gòu)思，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，包括以下步驟(1)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；
(2)shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄shRNA的對(duì)應(yīng)于A(yíng)F116909基因的回文序列，將兩條回文序列在95℃退火合成雙鏈序列，再與線(xiàn)狀的pSilenCircle載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提，測(cè)序鑒定；(3)NSC的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將NSCs傳代，將NSCs傳代，吹打制成密度為106-108個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取5mL該懸液置于60-mm的培養(yǎng)瓶中；將經(jīng)測(cè)序確定為shRNA的表達(dá)載體6.0μg-10.0μg稀釋在500μL無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM中；同時(shí)將20μL的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋在同樣體積的上述DMEM中，室溫下培養(yǎng)5分鐘后；然后將稀釋的shRNA表達(dá)載體同稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫培養(yǎng)20分鐘后，最后再將此混合物轉(zhuǎn)染到NSCs中；(4)膽堿能神經(jīng)元的鑒定。
上述的神經(jīng)干細(xì)胞是從胎鼠紋狀體分離得到。
上述的神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法是將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
上述的神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定采用免疫熒光法。
上述的NSC的轉(zhuǎn)染的時(shí)間為11天。
上述的膽堿能神經(jīng)元的鑒定采用RT-PCR定性分析法采用本發(fā)明的體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，從培養(yǎng)起第3天的(12±1.5)％膽堿能神經(jīng)元分化率增加到第11天的(80±3.1)％。RT-PCR分析結(jié)果表明，AF116909基因mRNA的表達(dá)量同對(duì)照組相比明顯減少。這說(shuō)明該方法對(duì)AF116909目的基因確實(shí)得到有效的抑制，同時(shí)顯示抑制該基因具有促使神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化的功能。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD孕鼠(14d)購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房。
神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)無(wú)菌條件下取出胎鼠的紋狀體，放入含有1％B27，20ng/mL EGF，10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃，5％CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每培養(yǎng)一周傳代一次。
神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定將細(xì)胞貼附在載玻片上生長(zhǎng)，2天后取出。吸出培養(yǎng)液，用PBS洗去殘余培養(yǎng)液，4％(m/m)多聚甲醛固定20min。PBS洗2次(每隔10分鐘1次)；10％正常山羊血清封閉1h；PBS洗3次；抗nestin抗體(v/v 1∶100，用antibodybuffer稀釋)4℃過(guò)夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用antibody buffer稀釋)32℃孵育1h，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，觀(guān)察熒光。
神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定Nestin蛋白是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，它是一種中間絲蛋白，分布在細(xì)胞質(zhì)中，用抗nestin免疫熒光染色檢測(cè)觀(guān)察到有綠色熒光，自動(dòng)聚集成團(tuán)是神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要特征。這就進(jìn)一步證明自胎鼠紋狀體中分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞方法的可靠性。
shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄shRNA的對(duì)應(yīng)于A(yíng)F116909基因的回文序列(各為57bp)，其序列為sense5’ACACCGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTGCTTGAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCT3’antisense5’AAAAAGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTCAAGCAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCG3’將兩條回文序列95℃退火合成雙鏈序列，再與線(xiàn)狀的pSilenCircle載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提，測(cè)序鑒定，經(jīng)連接后的序列為5’ACACCGACCCTCATTCCAGAGAGGGTTTGCTTGAAACCCTCTCTGGAATGAGGGTCT3’3’GCTGGGAGTAAGGTCTCTCCCAAACGAACTTTGGGAGAGACCTTACTCCCAGAAAAA5’NSC的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將NSCs傳代，吹打制成密度為4×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取5mL該懸液置于60-mm的培養(yǎng)瓶中，將將經(jīng)測(cè)序確定為shRNA的表達(dá)載體8.0μg稀釋在500μL無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM中，將20μL的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋在同樣體積的上述DMEM中，室溫下培養(yǎng)5分鐘后，再將稀釋的shRNA表達(dá)載體同稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫培養(yǎng)20分鐘后，最后再將此混合物轉(zhuǎn)染到NSCs中，同時(shí)設(shè)計(jì)對(duì)照，細(xì)胞在于37℃，50mL/L CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的分化情況，并作相關(guān)的實(shí)驗(yàn)記錄。
膽堿能神經(jīng)元的鑒定培養(yǎng)11天后，分別收集實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞，用Trizol分別抽提總RNA，純化，各取2μg RNA為模板進(jìn)行cDNA合成(其合成方法按照AMV FirstStrand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行)。再以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中AF116909基因mRNA表達(dá)量的定性分析。其PCR引物為5’CTGTGGACTCCTGGTCAG3’(Forward)和5’GTCTGTCCAGATGCTTCT3’(Reverse)，PCR產(chǎn)物大小為380bp。
NSCs轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察未轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染有shRNA表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組分別培養(yǎng)并計(jì)算培養(yǎng)不同天數(shù)的分化率(十個(gè)視野中分化的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)11天后對(duì)照組無(wú)明顯分化，分化率僅為(5±1.2)％，而實(shí)驗(yàn)組從培養(yǎng)第3天后就開(kāi)始分化，細(xì)胞分化的數(shù)量明顯增多并且分化率為(12±1.5)％，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞的分化率明顯增大，并且在培養(yǎng)第11天后細(xì)胞的分化率到達(dá)(80±3.1)％。
培養(yǎng)11天后，用Trizol抽提總RNA并純化總RNA，分別進(jìn)行RT-PCR來(lái)定性分析實(shí)驗(yàn)組(T)和對(duì)照組(C)細(xì)胞中的AF116909基因mRNA的表達(dá)量，結(jié)果對(duì)照組中AF116909基因mRNA的表達(dá)量明顯大于實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組中目的基因的表達(dá)得到有效的抑制。
權(quán)利要求
1.一種體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，包括以下步驟(1)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；(2)shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建按照SilenCircleTMRNAi Transcription Kit方法設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄shRNA的對(duì)應(yīng)于A(yíng)F116909基因的回文序列，將兩條回文序列在95℃退火合成雙鏈序列，再與線(xiàn)狀的pSilenCircle載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提，測(cè)序鑒定；(3)NSC的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將NSCs傳代，吹打制成密度為106-108個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取5mL該懸液置于60-mm的培養(yǎng)瓶中；將經(jīng)測(cè)序確定為shRNA的表達(dá)載體6.0μg-10.0μg稀釋在500μL無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM中；同時(shí)將20μL的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋在同樣體積的上述DMEM中，室溫下培養(yǎng)5分鐘后；然后將稀釋的shRNA表達(dá)載體同稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫培養(yǎng)20分鐘后，最后再將此混合物轉(zhuǎn)染到NSCs中；(4)膽堿能神經(jīng)元的鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，其特征在于所述的神經(jīng)干細(xì)胞是從胎鼠紋狀體分離得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，其特征在于所述神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法是將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，其特征在于所述神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定采用免疫熒光法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外抑制AF116909基因誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，其特征在于所述NSC的轉(zhuǎn)染的時(shí)間為11天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述膽堿能神經(jīng)元的鑒定采用RT-PCR定性分析法。
全文摘要
提供一種體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，包括神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定后，在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12－DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1775945SQ20051002586
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月17日
發(fā)明者任雯雯, 楊洋, 陳付學(xué) 申請(qǐng)人:上海大學(xué)