專利名稱：細胞內(nèi)生基因活性化的優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞內(nèi)基因表達的優(yōu)化方法，首先，本發(fā)明涉及一個改變內(nèi)生存于一個真核細胞內(nèi)的目標(biāo)基因的表達方法，其中借助于同源重組作用，把異源的表達控制序列或/和擴增標(biāo)記基因引入到細胞的基因組中，而且該方法中還包括插入的外來DNA的、部位特異重組酶介導(dǎo)的切除，以及用其他的異源表達控制序列或/和擴增標(biāo)記基因代替之。本發(fā)明還涉及把一個或多個結(jié)合到一個激活蛋白質(zhì)或激活蛋白復(fù)合物例如一個缺氧誘發(fā)因子(HIF)上的核酸序列通過同源重組，引入到一個真核細胞的基因組內(nèi)，以便修改目標(biāo)基因的表達。本發(fā)明還涉及一種方法，它通過確定報道基因的表達來測定在5’部位或3’部位上的未編碼的核酸片段對目標(biāo)基因表達的影響。此外，本發(fā)明還涉及含有重組酶-目標(biāo)序列的DHFR負(fù)真核細胞的制備，以及插入到該重組酶-目標(biāo)序列中的核酸序列的表達。
細胞中的基因表達可以決定性地，例如對所謂的持家基因，或調(diào)節(jié)性地進行。尤其是對于必須只在細胞的一個確定的發(fā)展階段中或在環(huán)境條件改變時必需進行調(diào)節(jié)表達。
通過與編碼的核酸序列結(jié)合的有效啟動子，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)該表達，并可通過阻遇物及激活劑來調(diào)節(jié)其活性。使阻遇物或激活劑結(jié)合到基因的未編碼的核酸序列上，就可以起到降低或提高啟動子活性的作用(L.Stryer，《生物化學(xué)》，第12章?？破粘霭嫔?、海德堡，1990年)。另一方面，又可以通過一些因素，例如環(huán)境條件來調(diào)節(jié)細胞中所含的阻遇物或激活劑的量。上述激活劑的實例包括缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)，它可以通過減少O2供給量誘導(dǎo)并導(dǎo)致促紅細胞生成素基因表達的提高(Blanchard K.L.等人，人類促紅細胞生成素基因的缺氧誘導(dǎo)啟動子與增強子之間的協(xié)同作用，它們各自含有甾類受體響應(yīng)要素，(1992年)，分子細胞生物學(xué)，12，5373-5385；Wang G.L.與Semenza G.L.缺氧誘導(dǎo)因子1的特性及因缺氧造成的對DNA結(jié)合活性的調(diào)節(jié)，(1993年)，《生物化學(xué)》雜志，268，21513-21518；Wang G.L.等人，缺氧誘導(dǎo)因子1是一個受細胞的O2張力調(diào)節(jié)的基本的螺旋-環(huán)-螺旋-PAS異源二聚體(1995年)，美國國家科學(xué)院院報，92，5510-5514)。
此外，表達蛋白質(zhì)的量取決于mRNA的穩(wěn)定性。用于分解mRNA的酶的識別序列定位于mRNA的3’部位區(qū)域中，它們影響mRNA的穩(wěn)定性及表達高度(Shaw G.與Kamen R.從GM-CSF mRNA的3’-未翻譯區(qū)域的保守All序列傳遞選擇性mRNA的降解，《細胞》(1986年)，659-667。mRNA的半衰期與蛋白質(zhì)的表達量有關(guān)。第三級表達調(diào)節(jié)就是轉(zhuǎn)譯。
基因的表達受到復(fù)雜調(diào)節(jié)機理的影響，在個別情況下，它們可以是極有區(qū)別的。
可以借助于重組DNA工藝獲得蛋白質(zhì)，其中利用了表達調(diào)節(jié)的識別(Sambrook等人。1989年《分子克隆》，實驗室手冊，Cold SpringHarbot)。在這里，使用了載體。它們包含在適合的啟動子控制下，給相應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，以及其他的用于表達蛋白質(zhì)與復(fù)制載體所需的序列?？梢愿鶕?jù)已知方法，將載體加入到宿主細胞中，接著培養(yǎng)該細胞，并從該細胞或培養(yǎng)介質(zhì)中獲得重組蛋白質(zhì)。
可以用原核細胞或真核細胞作為上述宿主細胞。原核細胞特別是大腸桿菌細胞在它們的操作中是不存在問題的，然而，在真核細胞蛋白質(zhì)的重組表達方面則存在一系列的缺陷。
原核細胞與真核細胞的區(qū)別在于表達后的加工方式，細胞培養(yǎng)條件，以及在表達加工時參與的陪伴蛋白不同，因此，在原核細胞中制備的真核細胞蛋白質(zhì)與相應(yīng)的原生蛋白質(zhì)相比較有很大的區(qū)別。例如，蛋白質(zhì)的縮并形式與蛋白質(zhì)的活性可以有所變化。在原核宿主細胞中的蛋白質(zhì)通常也不能糖基化。然而，在許多情況下，一個正確的糖基化形式，例如在制備用于醫(yī)藥藥劑的蛋白質(zhì)過程中，具有顯著的活性與相容性的特征。
因此，可以借用真核宿主細胞或細胞系，例如CHO(中國侖鼠卵巢)細胞，制備糖基化的蛋白質(zhì)。盡管在使用真核細胞時，由于物種的區(qū)別，例如在非人類細胞中表達一個人類蛋白質(zhì)時，可以在重組制備的蛋白質(zhì)中出現(xiàn)變化。但是在許多應(yīng)用方面卻是無用的。
在蛋白質(zhì)的重組制備過程中，可用表達載體瞬間地或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主細胞。其中，特別是在大規(guī)模制備方法中，采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞。
在宿主細胞的基因組中的表達載體序列的非特異性隨機整合，可以導(dǎo)致細胞生產(chǎn)率的減小或細胞的不穩(wěn)定性。例如，在生產(chǎn)過程中使生產(chǎn)率下降，或者使細胞表達重組蛋白質(zhì)的能力完全喪失。
提高基因表達的方法產(chǎn)生了基因的擴增。其中，用于編碼蛋白質(zhì)的核酸序列與擴增標(biāo)記基因相結(jié)合。通過一個選擇步驟，可以使兩個序列達到復(fù)制擴大，這會導(dǎo)致表達的提高(Schimke R.T.(Ed.)(1982年)，基因擴增。Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，NY)。
可以用為二氫葉酸酯還原酶(DHFR)編碼的核酸作為擴增標(biāo)記基因(Kaufmann R.J.Sharp P.A.(1982年)，與調(diào)節(jié)的二氫葉酸酯還原酶互補DNA基因共轉(zhuǎn)染序列的擴增與表達，分子生物學(xué)雜志159601頁)。
通過用氨甲喋呤實施的選擇步驟，可以得到對氨甲喋呤呈抗性的細胞，而且在該細胞基因組中，為DHFR編碼的，并與其相結(jié)合的核酸序列含有20-50倍的擴增(R.Knippers，1982年，分子遺傳學(xué)，Thieme，Stuffgarg)。
上述基因擴增的方法，可以最有效地用DHFR負(fù)細胞實施。日本專利文獻JP-62265992就描述過人體的DHFR負(fù)細胞?？墒菓?yīng)該指出，借助于在該細胞中的該序列的同源重組與擴增，卻沒有出現(xiàn)表達載體的部位特異的整合。
在實施基因擴增方法中，也會由于在該細胞的基因組中表達載體偶然整合，從而出現(xiàn)了上述的缺陷，例如細胞的不穩(wěn)定特性。
唯有在通過同源重組，使外來DNA特異部位整合在選定的基因座上時，它導(dǎo)致了內(nèi)生基因的活化，才有可能避免上述的缺陷。WO 90/11354與WO 91/09955公開了這種方法，并以基因目標(biāo)為特征。其中，用載體使細胞轉(zhuǎn)化，該載體中含有一個正的選擇標(biāo)志基因，并置于核酸序列的兩側(cè)，該序列與基因座上的序列是同源的。在該基因座上，該載體應(yīng)該整合到該細胞的基因組中。在同源的核酸序列之間，還有異源的表達控制序列，以便使細胞中的目標(biāo)基因的表達可得到提高。必要時，還可以有擴增標(biāo)記基因，以便增加目標(biāo)基因的復(fù)制數(shù)量。
迄今已知的基因目標(biāo)方法存在一個缺點，即當(dāng)以商業(yè)目的盡可能大批量制備所希望得到的高質(zhì)量的蛋白質(zhì)時，經(jīng)常是成本高耗費大。特別是，為了選定用于表達所希望的目標(biāo)蛋白質(zhì)基因，最佳的表達控制序列或/和擴增標(biāo)記基因，經(jīng)常需要進行大量的、同源重組的一系列試驗，由于進行昂貴的、用于實現(xiàn)所希望的重組作用的克隆(無性繁殖系)的分離工序，需要非常昂貴的耗費。
也可以采用同源的重組作用，以便在一個切除細胞的確定基因中進行表達及進行蛋白質(zhì)的功能研究。這里是由剔除老鼠產(chǎn)生的。其中，通過同源重組，使為欲試驗的蛋白質(zhì)編碼的、在胚胎干細胞中的基因被切除，經(jīng)其他的處理步驟以后，該老鼠可以得到，即該基因的兩個等位基因，由于失活，從無功能的蛋白質(zhì)的孵育一開始，就可以進行表達。(Thomas K.R.，Capeccki M.R.，(1987年)，在老鼠胚胎衍出的干細胞中的，通過基因目標(biāo)形成的定點誘變，《細胞》51503-512)。
為了對確定的基因進行組織特性及時間特性的切除與研究，可以加入Cre-Lox系統(tǒng)。其中，可以通過同源重組，把一個被兩個loxp序列置于兩側(cè)的核酸片段插入到細胞的基因組中，接著，可以通過在該細胞中表達的Cre重組酶，重新從該基因組中切除出去(Sauer B.，Henderson N(1989年)置于哺乳動物細胞的基因組中的、在loxp部位上的部位特異DNA的重組。核酸研究17147-161；Sauer B.，Henderson N.(1990)，通過Cre重組酶的作用，使外源DNA目標(biāo)插入到真核細胞的基因組中，New Biol 5441-449)。必須指出，在現(xiàn)有技術(shù)中，迄今沒有發(fā)現(xiàn)，可以用Cre-lox系統(tǒng)或其他任一的部位特異重組酶系統(tǒng)，形成在真核細胞的基因組中的擴增標(biāo)記基因或表達控制序列的部位特異整合，以達到內(nèi)生基因表達的變化。
本發(fā)明的目的在于提供一個新的、可以通過同源重組使得內(nèi)生基因活性化達到優(yōu)化的方法，其中，至少可以部分地克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷。
本發(fā)明的上述目的通過采用新的方法與載體結(jié)構(gòu)得以實現(xiàn)，它使在真核細胞內(nèi)的基因表達功能的優(yōu)化可非常容易實現(xiàn)。本發(fā)明的第一個方面涉及改變在真核細胞中內(nèi)生存在的核酸序列的表達的方法，其特征是，(a)將第一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)至少一個選自第一種異源表達控制序列和第一種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)用于部位特異重組酶的、至少兩個位于序列(i)與序列(ii)兩側(cè)的目標(biāo)序列，(iv)置于序列(i)、(ii)與(iii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，
(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，其中可形成載體的同源重組，(c)獲得根據(jù)步據(jù)(b)制得的細胞。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以制備一種細胞，它具有與一種異源表達控制序列和/或擴增標(biāo)記基因有效結(jié)合的內(nèi)生基因。其中，該序列被用于部位特異的重組酶，例如，Cre重組酶的目標(biāo)序列的兩側(cè)。這種細胞特別適用于試驗?zāi)繕?biāo)基因表達的優(yōu)化。因為由于該用于部位重組酶的目標(biāo)序列的存在，就有可能很容易地用第二種異源的表達控制序列和/或第二種擴增標(biāo)記基因代替第一種異源的表達控制序列和/或第一種擴增標(biāo)記基因。
按本發(fā)明術(shù)語“部位特異重組酶”是指這樣的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物，它們可促進DNA在特異的DNA目標(biāo)序列上的重分布，它們包括整合酶-或解離酶-轉(zhuǎn)化酶類的部位特異的重組酶(Stark等人，Trends Genet8(1992年)，432-439；Abremski與Hoess，《蛋白質(zhì)工程》5(1992年)，87-91；Khan等人，《核酸研究》19(1991年)，851-860)，以及通過內(nèi)含子編碼的內(nèi)核酶促進的部位重組酶(Perrin等人，EMBO J.12(1993)，2939-2947)。較佳的重組酶蛋白質(zhì)是選自釀酒酵母的2μ附加體的FLP重組酶(如，F(xiàn)alco等人，《細胞》(1982)，573-584；Cox，美國國家科學(xué)院院報，80(1983)，4223-4227；Konslaki等人，新生物學(xué)家4(1992)，551-557)，大腸桿菌噬菌體P1的Cre重組酶(如，Sauer與Henderson(1989).Supra)，由rouxii接合酵母質(zhì)粒pSR1制成的R重組酶(Matsuzaki等人，《細菌學(xué)》雜志172(1990)，610-618)。由果繩屬克魯維酵母菌屬質(zhì)粒pKD1制成的A重組酶(chen等人，《核酸研究》14(1986)，4471-4481)，由Waltii克魯維酵母菌屬質(zhì)粒pKW1制成的A重組酶(chen等人.《基因微生物》雜志138(1992)，337-345)，一種λ-Int-重組系的成分(Landy，生物化學(xué)年度綜述5(1989)，913-949)，以及一種噬菌體μ的Gin重組系的成分(Klippel等人，EMBO J.12(1993年)，1047-1057)。此外，還有歐洲專利文獻EP-B-0707599描述的由一種部位特異的重組酶與一種核受體或與其適應(yīng)的配位結(jié)合的結(jié)構(gòu)域所組成的融合蛋白。本發(fā)明的方法最好采用Cre重組酶的目標(biāo)序列，即loxP序列。
通過異源基因的部位特異整合，重組制備蛋白質(zhì)會帶來一些缺點。與此相反，根據(jù)本發(fā)明的方法，通過同源重組，會有利于部位特異的內(nèi)生的基因活化。通過對異源表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的相適應(yīng)重組的簡單選擇，我們就會有更大的可能性得到具有穩(wěn)定特性的最佳制備克隆，其中，可以制備一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)與活性方面與原蛋白質(zhì)一致。
所選擇的同源序列置于異源表達控制序列擴增標(biāo)記基因、正的選擇標(biāo)記基因與重組酶目標(biāo)序列的兩側(cè)，并可以據(jù)專利文獻WO90/11354與WO91/09955所述的方法獲得。
此外，在該同源序列中也可以含有改性因子，它們可在被表達的蛋白質(zhì)中引起突變，例如，引起個別氨基酸或整個氨基酸片段的插入或/和缺失，以及點突變。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以只在一個方法步驟上，不僅能改變內(nèi)生核酸序列的表達高度，而且同時還可以在內(nèi)生的核酸序列的編碼區(qū)域內(nèi)引起突變。為此，本發(fā)明的方法特別有利于制備用于醫(yī)藥的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)應(yīng)該顯示出，除了蛋白質(zhì)的效力提高的突變外，與原蛋白質(zhì)相比較，并沒有其他的變化。
本發(fā)明可以采用任一個真核細胞，特別是哺乳動物的，尤其是人體的細胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以用非無限增殖化細胞，例如成纖維細胞，或也可用無限增殖化細胞，如腫瘤細胞系加以實施。最好是用無限增殖化細胞實施。
在實施本發(fā)明方法中所選用的溶液與介質(zhì)最好是這樣選擇，它們使得在每一個方法步驟中都有最佳條件。用介質(zhì)完成對細胞的培養(yǎng)，該介質(zhì)中含有用于細胞充分生長所需的全部物質(zhì)，必要時是緩沖的。這些細胞最好是可在不含血清的介質(zhì)中培養(yǎng)。所用的上述細胞最好是Namalwa-，HT1080或Hela S3細胞。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使一種內(nèi)生存于細胞中的核酸序列的表達得到優(yōu)化。也就是說，通過選定一種最佳表達控制序列，一種最佳擴增標(biāo)記基因或/和通過選定一種表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的最佳結(jié)合，使一種目標(biāo)基因的表達得到優(yōu)化。
可用任一種核酸序列作為異源表達控制序列。在前者整合到細胞基因組中后，就會影響目標(biāo)基因的表達。它包括核酸序列，后者直接與轉(zhuǎn)錄成分相互作用，例如，可以接受轉(zhuǎn)錄引發(fā)因子或RNA聚合酶。而核酸序列，通過與激活劑或阻遇物的相互作用，將促進對轉(zhuǎn)錄的影響，該異源表達控制序列最好包括一個啟動子/增強子，特別是病毒性啟動子，最好是一個CMV啟動子。
上述異源表達控制序列也可以包括一個在其3’部位上未編碼的序列。上述在3’部位上未編碼的序列可以對mRNA起穩(wěn)定或不穩(wěn)定性的作用，并因此提高或降低其半衰期。通過加一種穩(wěn)定mRNA的序列，就會提高mRNA的半衰期，并為此提高被其編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。
根據(jù)一個較佳的實施方案，通過上述同源重組，可以去掉目標(biāo)基因的內(nèi)生表達控制序列。當(dāng)該內(nèi)生序列包括結(jié)合阻遇物的序列時，這就特別有利了。一種在3’部位上未編碼的序列也可以顯示降低該表達的作用。該序列對mRNA起不穩(wěn)定性的作用。由此可以使轉(zhuǎn)釋的蛋白質(zhì)量減少。
此外，本發(fā)明的方法還可以選擇一種最佳化的擴增標(biāo)記基因。該擴增標(biāo)記基因最好是以可表達形，即以與相應(yīng)的啟動子有效結(jié)合的形式插入的，并安置在載體上，以使得在把載體同源整合在真核細胞的基因組后，該擴增標(biāo)記基因就處于靠近目標(biāo)基因的空間位置上。實施上述擴增步驟，可以導(dǎo)致細胞中目標(biāo)基因復(fù)制數(shù)量的增加。由此，可以形成內(nèi)生的核酸序列的表達的進一步提高。上述擴增標(biāo)記基因可以包括二氫葉酸酯還原酶(DHFR)，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶以及該基因的突變蛋白。上述擴增標(biāo)記基因最好是一種DHFR基因或其突變物(Simonsen等人，《核酸研究》1998，16(5)2235-2246)，特別是含有內(nèi)生的DHFR基因的細胞。
可以用每個適用于真核細胞的抗性基因作為正的選擇標(biāo)記基因，它可導(dǎo)向一種可選擇的表現(xiàn)型，例如一種抗菌抗性。該正的選擇標(biāo)記基因最好是一個新霉素、卡那霉素、原生霉素或潮霉素的抗性基因。該正的選擇標(biāo)記基因最好是以可表達的形式，即與一個合適的啟動子有效結(jié)合的形式存在。
若使用一種負(fù)的選擇標(biāo)記基因，則通常除了上述的正的選擇步驟外，還輔加地實施一個第二個負(fù)的選擇步驟。這會帶來一個優(yōu)點，即在實施上述選擇步驟以后，這些鑒定的克隆就會含有更少的假的正克隆部分，即偶然地整合在基因組中的載體上。上述負(fù)的選擇標(biāo)記基因最好是一種胸苷激酶基因(TK)或/和次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(HGPRT)。
由于上述部位特異的重組酶的目標(biāo)序列的存在，可以使定位于該序列中間的核酸序列，在使用部位特異重組酶的情況下，從該細胞的基因組中切除出去。上述定位于目標(biāo)序列之間的核酸序列最好通過細胞中的相應(yīng)重組酶瞬間激活，而從該基因組中切除出去。通過下列步驟實現(xiàn)上述的重組酶的瞬間激活，(a)將第二種載體轉(zhuǎn)入細胞，其中包括為該重組酶編碼的、并與在該細胞中活化的或可活化的表達控制序列有效結(jié)合的核酸序列，和(b)在使該重組酶表達和活化的條件下，培養(yǎng)由此被轉(zhuǎn)入的細胞，(c)必要時，獲取該細胞。
在使用重組酶/核受體-融合蛋白質(zhì)時，可以通過有控制地加入用于核受體的配位體，實現(xiàn)細胞的瞬間激活。
在除去位于該目標(biāo)序列之間的DNA以后，可以把剩余的目標(biāo)序列，例如，loxP序列，再用于其他的方法步驟中。
在另一個較佳實施方案中，本發(fā)明方法的特征是，(a)將第三種載體轉(zhuǎn)入該細胞，包括(i)至少一種選自第二種異源表達控制序列與第二種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標(biāo)記基因不同，(iii)至少兩個位于序列(i)和(ii)兩側(cè)的重組酶-目標(biāo)序列，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，其中被目標(biāo)序列置于兩側(cè)的序列整合在細胞基因組的目標(biāo)序列上，(c)獲得步驟(b)的細胞，(d)必要時，可以各用改變的表達控制序列和/或擴增標(biāo)記基因至少重復(fù)一次(a)至(c)的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以容易與迅速地測試許多表達控制序列、擴增標(biāo)記基因或表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的結(jié)合物。因此，不必進行為調(diào)查每單個目標(biāo)基因的最佳表達/放大系統(tǒng)所進行的、為每單個異源表達控制序列或每單個擴增標(biāo)記基因的耗時耗費的部位特異整合。
在第三種載體中的正的選擇標(biāo)記基因最好區(qū)別于在第一種載體中的正的選擇標(biāo)記基因，以便能簡化選擇方法，并使假的正克隆的數(shù)量達到最少。
本發(fā)明所用的載體重組酶目標(biāo)因可以與天然存在的目標(biāo)基因相適應(yīng)，或者必要時呈現(xiàn)突變，其中不會削弱部位特異重組的效力。
本發(fā)明的另一個目的是得到一種用于同源重組的載體，特別是用于在一個細胞的基因組內(nèi)部位特異地引入重組酶目標(biāo)基因的載體，其中包括(i)至少一種選自一種表達控制序列與一種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)至少兩個置于序列(i)與(ii)兩側(cè)的、用于部位特異重組酶的目標(biāo)序列，(iv)該置于序列(i)、(ii)與(iii)兩側(cè)的DNA序列與細胞基因組中的核酸片段同源，并可形成一個同源的重組，(v)必要時，一個負(fù)的選擇標(biāo)記基因。
所有的本發(fā)明的載體最好還含有為在適宜的宿主細胞內(nèi)的繁殖和增加數(shù)量所需的序列成分，例如復(fù)制源，選擇標(biāo)記基因，等。
本發(fā)明的另一個目的是得到一種載體，特別是借助一個部位特異重組酶系統(tǒng)，旨在向細胞的基因組內(nèi)引入DNA的載體，其中包括(i)至少一種選自一種異源表達控制序列與一種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一種正的選擇標(biāo)記基因，(iii)至少兩種位于序列(i)與(ii)兩側(cè)的重組酶-目標(biāo)序列。
本發(fā)明的又一個目的是得到一種真核細胞，特別是人體的細胞，可以據(jù)上述的方法得到該細胞。該細胞，例如一種人體的細胞，具有一些特征，即(a)它含有至少一個與內(nèi)生存在的核酸序列有效連接的選自異源表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的染色體定位的序列，(b)重組酶-目標(biāo)序列置于該序列兩側(cè)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種改變內(nèi)生存在于真核細胞中的核酸序列表達的方法，其特征是，(a)將一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，包括(i)至少一個激活蛋白質(zhì)，例如能結(jié)合缺氧(Hypoxia)誘導(dǎo)因子(HIF)的核酸序列(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)置于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源重組，(b)在一定的條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，該條件可使載體進行同源重組，(c)獲得根據(jù)步驟(b)制得的細胞。
通過核酸序列的基因整合，其中結(jié)合一個或多個激活蛋白質(zhì)(通過在核酸序列上的結(jié)合提高基因表達的蛋白質(zhì))，在目標(biāo)基因表達控制序列區(qū)域內(nèi)，特別是在其調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)，令人驚奇地是不會降低目標(biāo)基因的表達，相反地，甚至在適宜的培養(yǎng)條件下，還會提高內(nèi)生存在的目標(biāo)基因的表達或者還會導(dǎo)誘未表達的、內(nèi)生存在的目標(biāo)基因的表達。
較適宜的激活蛋白質(zhì)包括缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與HIF-1β，以及干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)，其中，通過在干擾素交感序列(ICE)上的結(jié)合，可以提高轉(zhuǎn)錄(Tanaka.N.，Kawakami T.，Taniguchi T.，分子細胞生物學(xué)(1993)8月，13(8)4531-4538)。
經(jīng)過一個或多個的、結(jié)合HIF或其他激活蛋白質(zhì)的核酸序列與內(nèi)生存在目標(biāo)基因的有效結(jié)合，可以在選定的較適宜培養(yǎng)條件下，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達。這對大規(guī)模的制備是特別有利的。因為蛋白質(zhì)的表達會導(dǎo)致制備過程達到最佳化。這將有利地使合成產(chǎn)物在培養(yǎng)介質(zhì)上清液中的平均停留時間縮短。由此，也可以使不希望得到的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的量減少。這勢必會對后續(xù)的純化步驟產(chǎn)生積極的影響，即降低制造成本，并會使最終產(chǎn)品的質(zhì)量得到提高。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以滿足一個或多個結(jié)合激活劑的核酸序列與目標(biāo)基因有效結(jié)合的要求。最好是采用兩個結(jié)合HIF的核酸序列。特別是選自根據(jù)序列ID No.1的53bp序列，根據(jù)序列1D No.2的43bp序列，一種對該序列同源的序列，或一種在嚴(yán)格條件下與該序列雜交的序列的結(jié)合HIF的核酸序列。
使用兩種結(jié)合HIF的核酸序列，會令人驚奇地獲得協(xié)同作用。由此，正如只單獨使用單個序列一樣，會使內(nèi)生核酸的表達得到更大的提高。
一旦需要，與在目標(biāo)基因區(qū)域內(nèi)引入的激活序列相結(jié)合的激活蛋白質(zhì)的表達，可以誘導(dǎo)到該細胞中或/和得到提高。這可以通過用一種載體轉(zhuǎn)化該細胞來實現(xiàn)，其中包括(i)一種用于編碼激活蛋白質(zhì)的核酸序列，它們與在這個細胞中活性的表達控制序列操縱結(jié)合，(ii)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因。
我們可以使用每種為激活蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，其表達產(chǎn)物可以結(jié)合到在該基因組內(nèi)整合的結(jié)合激活劑的核酸序列。該激活蛋白質(zhì)最好是一種HIF-1α或/和HIF-1β蛋白質(zhì)。當(dāng)該內(nèi)生存在的核酸序列已經(jīng)含有結(jié)合激活劑或結(jié)合HIF的核酸序列時，只要在該細胞內(nèi)加入一種載體，即可滿足要求。其中包括為激活蛋白質(zhì)或HIF蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，后者可以與在細胞內(nèi)活化的表達控制序列有效地結(jié)合，以及，必要時一個正的選擇標(biāo)記基因。
上述與為激活蛋白質(zhì)編碼的核酸序列有效結(jié)合的表達控制序列可以是可誘導(dǎo)的，以致于通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，例如加入激素或重金屬，可以達到附加的激活作用。由此，可以使內(nèi)生目標(biāo)基因的表達可以誘導(dǎo)出對制備過程最佳化的時刻。
使用一種結(jié)構(gòu)上活性的表達控制序列有利于使該激活蛋白質(zhì)不依賴于加入到培養(yǎng)介質(zhì)中的激活劑，就可以得到結(jié)構(gòu)上的表達。
當(dāng)上述結(jié)合激活蛋白質(zhì)的核酸序列是一種結(jié)合HIF的核酸序列時，就可以通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，如0.1-2％的O2濃度，誘導(dǎo)出該目標(biāo)基因的表達。
本發(fā)明的另一個目的是得到一種用于同源重組的載體，其中包括，(i)至少一種結(jié)合激活蛋白質(zhì)的核酸序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)位于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與一個細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源重組。
本發(fā)明的另一個目的是得到一個真核細胞，特別是人體細胞，可根據(jù)上述方法制得該細胞。該細胞的特點是，至少含有異源的、染色體定位的、結(jié)合激活蛋白質(zhì)/復(fù)合物的、并與內(nèi)生存在于細胞內(nèi)的基因有效結(jié)合的核酸片段。借助于上述部位特異的重組系統(tǒng)，可以替換基因組內(nèi)的結(jié)合激活蛋白質(zhì)的核酸片段。以致于可以容易地鑒別針對一個確定的目標(biāo)基因的最佳化的激活劑序列。
因此，本發(fā)明的另一個方面還涉及一種方法，即一種測驗在真核細胞中內(nèi)生存在的目標(biāo)基因范圍的、未編碼的核酸序列對該表達的影響的方法，其特征是，(a)將一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括，
(i)一種異源的、在細胞中活性的或可能激活的、并與報道基因操縱結(jié)合的表達控制序列，(ii)目標(biāo)基因范圍內(nèi)的、在5’部位或3’部位上未編碼的核酸片段，(b)在一定條件下培養(yǎng)該細胞，在該條件下該表達控制序列是活性的，(c)測定報道基因的表達。
用本發(fā)明的方法可以容易地確定，為什么必須使異源的表達控制序列安置于基因組內(nèi)的目標(biāo)基因區(qū)域內(nèi)，以便使目標(biāo)基因達到一個最佳的表達率，而且在目標(biāo)基因區(qū)域的、在5’部位或/和3’部位上未編碼的序列的存在或不存在對表達有什么樣的影響。上述試驗載體最好瞬間轉(zhuǎn)入到細胞中，并確定報道基因的表達。為此，可以迅速并費用適中地測試許多的異源表達控制序列與目標(biāo)基因的組合試驗，以及許多不同的表達控制序列試驗。上述異源的表達控制序列包括可以與轉(zhuǎn)錄成分、例如轉(zhuǎn)錄起始因子或RNA聚合酶、直接相互作用的核酸序列、以及通過與激活劑或阻遏物的相互作用可以影響轉(zhuǎn)錄的核酸序列。該異源的表達控制序列宜為一個啟動子/增強子，尤其是一個病毒性啟動子，而最好是一個CMV啟動子。特別是在具有昂貴的制備步驟的方法中，本發(fā)明的方法有助于大大降低成本。例如，在制備動物，例如老鼠、羊或牛的轉(zhuǎn)化基因時，其中，應(yīng)該提高在確定細胞型中的確定的內(nèi)生核酸序列的表達。
從目標(biāo)基因區(qū)域選出的、在5’部位或3’部位上未編碼的核酸片段最好是安置于載體內(nèi)的相應(yīng)于其基因組布置的、報道基因的5’部位或3’部位上。
我們可以采用一般技術(shù)人員熟悉的報道基因，它可以在細胞中表達。最好采用為氯酶素-乙酰基-轉(zhuǎn)移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ編碼的報道基因。另一方面，也可以采用用于編碼相關(guān)蛋白質(zhì)如EPO的報道基因。并用免疫方法，如ELISA，證實其表達。
在一個較佳實施方案中，至少兩個載體-它們彼此含有不同的在5’部位或/和3’部位上未編碼的目標(biāo)基因的核酸片段-向各自不同的細胞中轉(zhuǎn)入，而且可用一般技術(shù)人員已知的方法，證實不同細胞的報道基因的表達。用本發(fā)明的方法可以輕松地證實，什么樣的異源表達控制序列的配置可對一個確定的宿主細胞提供一個最佳化的表達。
另一方面，本發(fā)明還涉及DHFR-負(fù)的真核細胞，最好是哺乳動物細胞或人體細胞的制備方法，其特征是，(a)將第一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)至少一種用于部位特異重組酶的目標(biāo)序列，(ii)置于序列(i)兩側(cè)的DNA序列，它們與內(nèi)生存在于該細胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重組，(iii)必要時，一種正的選擇標(biāo)記基因，以及一種負(fù)的選擇標(biāo)記基因，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，其中可使載體實現(xiàn)同源重組，(c)獲得根據(jù)步驟(b)的細胞。
在本發(fā)明方法中，根據(jù)上文描述來選擇與使用上述重組酶-目標(biāo)基因與同源序列。
該正的選擇標(biāo)記基因被置于與DHFR基因同源的序列之間。上述負(fù)的選擇標(biāo)記基因被置于上述同源序列之外。
在DHFR-基因座上實現(xiàn)同源重組后，合成沒有功能的細胞中的DHFR蛋白質(zhì)。該載體序列可以如此安置，以使DHFR基因的啟動子失活，或/和由于在DHFR基因的編碼序列中的插入或缺失，再次合成沒有功能的DHFR蛋白質(zhì)。
為了使DHFR基因的兩個等位基因失活，首先，用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化、選擇和獲得該細胞。該細胞中的DHFR基因的一個等位基因失活，也就是說，它們對于DHFR基因而言是異合子的(+/-)。然后，可以再次用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化該細胞。該載體最好含有與第一種載體的不同的正的選擇標(biāo)記基因。經(jīng)選擇步驟后獲得該細胞。其中的兩個DHFR等位基因已失活?；蛘哌x擇壓力的提高導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)變，并使兩個等位基因失活(參照，Mortensen等人，分子細胞生物學(xué)，12(1992)，2391-2395)。
本發(fā)明的方法可提供一種DHFR負(fù)的細胞，其應(yīng)用有利于基因擴增方法。它沒有合成內(nèi)生的DHFR蛋白質(zhì)。在實施用于擴增異源的核酸序列的選擇步驟中，該序列與用于編碼DHFR蛋白質(zhì)的核酸序列相結(jié)合，而且對內(nèi)生的DHFR基因的表達產(chǎn)物沒有產(chǎn)生不利影響。因此，使基因擴增的效率提高了。
可以用每種適合的選擇標(biāo)記基因作為正的選擇標(biāo)記基因，它可以導(dǎo)致可選擇的表現(xiàn)型。例如抗菌素抗性。這個為該正的選擇標(biāo)記基因編碼的核酸序列最好是新霉素、卡那霉素、原生霉素或潮霉素的抗性基因。
我們可以使用一般技術(shù)人員公知的每種負(fù)的選擇標(biāo)記基因。用來編碼負(fù)的選擇標(biāo)記基因的核酸序列最好是胸苷激酶基因(TK)，或/和次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(HGPRT)。
這個被重組酶目標(biāo)基因置于兩側(cè)的序列，可以通過相應(yīng)重組酶的瞬間激活，從細胞基因組中切除出去，例如，通過(a)將一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括一種用來編碼重組酶、并與在該細胞中活性的表達控制序列有效結(jié)合的核酸序列，(b)在一定條件下培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)入的細胞，其中該重組酶被表達，而且是活性的，(c)必要時，獲取該細胞。
用本發(fā)明的方法，不僅可以使DHFR基因失激活，而且通過重組酶參與的反應(yīng)，使置于重組酶-目標(biāo)基因之間的DHFR基因的序列、以及加入的選擇標(biāo)記基因從細胞基因組中切除。
當(dāng)上述被重組酶-目標(biāo)基因置于兩側(cè)的序列含有正的選擇標(biāo)記基因時，含有該序列的細胞是抗生素抗性的。它可以容易地根據(jù)一般技術(shù)人員公知的方法，進行選擇。
本發(fā)明方法制備DHFR-負(fù)細胞的另一個優(yōu)點在于，可以用一般技術(shù)人員已知的方法識別其特性，而且該細胞還可以被用于其他方法中。此外，可以通過在DHFR基因座上引入的重組酶-目標(biāo)序列，把部位特異的核酸序列整合在該基因組中。
本發(fā)明的另一個較佳實施方案涉及向真核細胞引入異源DHFR基因的方法，其特征是，把按上述方法制得的DHFR負(fù)細胞，(a)將第三種載體轉(zhuǎn)入，其中該載體包括(i)必要時，一種正的選擇標(biāo)記基因，它最好可被第一種載體的正的選擇標(biāo)記基因所識別，(ii)一種用來編碼DHFR的核酸序列，(iii)一種待擴增的、用來編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，其中，來自部分序列(i)、(ii)與(iii)的核酸序列在5’部位與3’部位上各自被至少一個重組酶-目標(biāo)序列置于兩側(cè)，
(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下上述被重組酶-目標(biāo)序列置于兩側(cè)的核酸序列被整合到已經(jīng)在細胞的基因組中存在的重組酶-目標(biāo)細胞上，(c)獲取根據(jù)(b)步驟得到的細胞。
上述正的選擇標(biāo)記基因、DHFR基因、以及為所希望的蛋白質(zhì)編碼的目標(biāo)基因，最好各自與一種在該細胞中活性的或可激活的表達控制序列有效地結(jié)合。原則上也可以是一種具有內(nèi)部核糖核蛋白體的結(jié)合部位的多順反子結(jié)構(gòu)。然而，上述目標(biāo)基因待擴增的核酸序列應(yīng)該被分離的啟動子所驅(qū)動。上述表達控制序列最好是病毒的啟動子/增強子。最好是用于表達蛋白質(zhì)的CMV啟動子。
本發(fā)明的在一個細胞基因組中的異源序列的整合最好是部分特異地進行。因此，排除了異源序列對基因組序列的干擾。所以，由此產(chǎn)生的上述缺點，例如不穩(wěn)定的制備克隆，就可以得到避免。
為了提高異源的用來編碼蛋白質(zhì)的核酸序列的表達率，可以在已知的方法步驟之后，再實施一個用氨甲碟呤的擴增步驟。
本發(fā)明的目的還涉及一種載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因，(ii)一種為DHFR編碼的核酸序列，(iii)一種為所希望的蛋白質(zhì)編碼的，可表達的核酸序列，其中來自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5’部位和3’部位上各自被至少一種重組酸-目標(biāo)序列置于兩側(cè)。
本發(fā)明的目的還涉及一種用于同源重組的載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因，(ii)至少一種重組酶-目標(biāo)序列，它被放置于該序列(i)的兩側(cè)，(iii)置于序列(i)和(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與內(nèi)生存在于細胞中的DHFR一核酸序列同源，以便能形成同源的重組，(iv)必要時，一個置于同源序列(iii)之外的負(fù)的選擇標(biāo)記基因。
本發(fā)明還涉及一種真核細胞，最好是人體細胞，可根據(jù)上述方法制備該細胞。該細胞的特征在于，(a)至少一種內(nèi)生的、為DHFR編碼的核酸序列是失活的，最好是兩個內(nèi)生的等位基因，
(b)在為DHFR編碼的核酸序列區(qū)域內(nèi)，至少一種重組酶-目標(biāo)序列整合在該基因組中。
本發(fā)明的另一個目的是一種真核細胞，最好是人體細胞，其特征是，在內(nèi)生的DHFR基因座范圍中的異源核酸序列，其中包括(i)一種為DHFR編碼的核酸序列，(ii)一種為希望的蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，(iii)至少一種重組酶-目標(biāo)序列。
用下列實施例，附圖與序列記錄進一步詳述本發(fā)明。
附圖描述

圖1(A)示出了一種用于同源重組的載體，它被用作第一種載體。HR同源序列，Seq1第一個異源表達控制序列，R1正的選擇標(biāo)記基因，LoxP帶定位的LoxP序列，(B)顯示基因組的序列(a)經(jīng)過有效的同源重組以后，(b)經(jīng)過一個被LoxP序列置于兩側(cè)的序列的一個Cre重組酶催化切除以后，(C)顯示一種用于Cre重組酶參與的整合的載體，它包括一個放置于LoxP序列之間的序列，(c)顯示在一種第二種載體整合在LoxP序列后的基因組序列。R2正的選擇標(biāo)記基因，它必要時不同于R1，Seq2第二個異源表達控制序列。
圖2(A)顯示一種用于同源重組的載體，HR同源序列，R-box正的和，及必要時，負(fù)的選擇標(biāo)記基因，LoxP具有定位的LoxP序列，HSV-tk疤疹單純胸苷激酶。
(B)顯示一種為同源重組的、具有單側(cè)面同源序列的載體。
圖3顯示CMV啟動子/HIF控制的、HeLa S3細胞的促紅細胞生成素(EPO)表達，用載體pHYG、pHIF-1α與pARNT(pHIF-1β)轉(zhuǎn)化該細胞，在轉(zhuǎn)染第3，4與5天后，測定在細胞上清液中的EPO表達(促紅細胞生成素濃度是以μg/ml計)。
pHYG控制載體，pHIF-1α受一個SRα啟動子控制的HIF-1αcDNA，pARNT受一個CMV啟動子控制的HIF-βcDNA。
圖4顯示4種不同的載體，它們各自含有一個CMV啟動子(C)與報道基因β-半乳糖苷酶(B)。其中，在這些序列之間，插入了目標(biāo)基因(S)的不同長度的未編碼的核酸片段。上述未編碼的核酸片段的長度計為在A3-178載體中是Okb，在A3-177載體中2.5kb，在A3-175載體中是3.7kb，而在A3-181載體中是5.7kb。上述控制載體pNASSβ含有報道基因β-半乳糖苷酶，不含有CMV啟動子。
圖示5顯示經(jīng)過用圖4的載體(稀釋系列為1∶2-1∶128)對HeLa S3細胞的轉(zhuǎn)染后，對報道基因β-半乳糖苷酶表達的測定。
圖6(A)顯示在DHFR基因座中同源重組的pNDI載體。一個正的選擇標(biāo)記基因(Neo)被兩個LoxP序列置于兩側(cè)。一個LoxP序列的5’部位或另一個Loxp序列的3’部位上有與一個DHFR基因同源的序列(5’-，3’-DHFR區(qū)域)。
(B)顯示在DHFR基因座中同源重組的pHDI載體，一個正的選擇標(biāo)記基因(Hyg)被兩個LoxP序列置于兩側(cè)。一個LoxP序列的5’部位或另一個LoxP序列的3’部位上有與一個DHFR基因同源的序列(5’-，3’-DHFR區(qū)域)。
圖7(A)顯示具有Exonl，Exon2及Exon3(Exon即外顯子)的一個DHFR基因的基因組結(jié)構(gòu)，以及置于其間的內(nèi)含子，(B)圖示顯示一個與圖6相應(yīng)的載體、目標(biāo)結(jié)構(gòu)，(C)顯示用于在DHFR基因中同源重組的載體的有效同源重組后的基因組結(jié)構(gòu)。在EcoR1切除部位之間的距離是，當(dāng)使用pNDI載體時為2.9kb，當(dāng)使用pHDI載體時為3.7kb。Neo新霉素，Hyg潮霉素，Kb千堿基圖8顯示一種載體，它包括用于蛋白質(zhì)x編碼的核酸序列與用于DHFR蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，各自包括調(diào)節(jié)序列。它們被兩個LoxP序列置于兩側(cè)。這種載體可用于使Cre重組酶催化整合到一個LoxP序列的基因組中。
SEQ ID NO.1顯示第一個能結(jié)合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.2顯示第二個能結(jié)合HIF的核苷酸序列，SEQ ID NO.3顯示一個LoxP序列實施例實例1 由CMV啟動子控制的促紅細胞生長素基因的表達與HIF過表達將pHYG、pHIF-1α與pARNT載體(見圖3)轉(zhuǎn)入到基因改變了的HeLa-S3細胞中。在該細胞中，把CMV(巨細胞病毒)啟動子插入到EPO同位基因的促紅細胞生長素基因轉(zhuǎn)譯起始點近端，該啟動子控制EPO表達。通常該細胞是每24小時，每107細胞生產(chǎn)1μg的促紅細胞生長素。在轉(zhuǎn)染前24個小時，向每個6孔板中通入濃度為6×104的細胞。在轉(zhuǎn)染那天，用一種DNA-DOTAP混合物培育該細胞。該混合物含有1.25μg的各種載體，10μl的DOTAP(Boehringer Mannheim 1202375)，及75μl的20mM的N-2-羥乙基-N’-2-乙基磺酸緩沖液(每孔)。將上述混合物在室溫下預(yù)培育10-15分鐘。用DNA-DOTAP將該細胞在每孔3ml介質(zhì)中培育6個小時。接著用PBS緩沖液洗滌該細胞兩次。然后，在全介質(zhì)中培育5天。在第3，4與5天時，分別取100μl的上清液樣，并用促紅細胞生長素ELISA分析。第5天時結(jié)束上述試驗，并確定細胞數(shù)量。每孔的促紅細胞生長素的量按相同的細胞數(shù)量計算(參見圖3)。
該實例表明，用HIF誘導(dǎo)促紅細胞生長素基因總是可能的。雖然，會有異源的表達控制序列(CMV啟動子)進入到該促紅細胞生長素基的同位基因的啟動子區(qū)域中，所測得的促紅細胞生長素濃度的提高意味著單個缺氧誘導(dǎo)因子或多個缺氧誘導(dǎo)因子對兩個同位基因的協(xié)同作用。
由此明顯看出，通過加入異源的表達控制序列，可以提高內(nèi)生的核酸序列的表達。當(dāng)在細胞中表達激活結(jié)合劑(HIF)時，則使其存在于結(jié)合表達控制序列的核酸序列中，使得該基因的表達可以進一步提高。如果相關(guān)的序列并不存在該基因座時，它們可以通過本發(fā)明的方法，借助于同源重組加入到基因組中。
實例2 表達控制序列的最佳布置以提高內(nèi)生核酸的表達內(nèi)生基因的5’部位序列不僅能夠顯示刺激特性，而且也能顯示阻礙特性。當(dāng)在目標(biāo)基因的5’部位上將異源的表達控制序列加入到該基因組時，該表達高度將受到該內(nèi)生的5’部位序列的影響。這樣借助于一個異源的表達控制序列應(yīng)該達到目標(biāo)基因的最佳表達。為此，必須這樣布置，即通過目標(biāo)基因的5’部位未編碼的序列，可以使異源表達控制序列的活性不會降低，最好是做到有目標(biāo)的布置，以便達到各個序列的協(xié)同效應(yīng)。以便能試驗該異源表達控制序列的不同布置。以便確定，例如，該細胞的基因組中的異源表達控制序列必須以多大距離整合到目標(biāo)基因的編碼序列的轉(zhuǎn)譯起始點。為此，用不同的目標(biāo)基因的5’部位未編碼的核酸片段測試不同的載體(參見圖4)。圖4中的載體被轉(zhuǎn)入到HeLaS3細胞中，并測試報道基因β-半乳糖苷酶的表達(參見圖5)。
在試驗前24個小時，向每10厘米的北特利平皿中通入濃度為1×106細胞的細胞，在轉(zhuǎn)錄的當(dāng)天，用一種DNA-DOTAP混合物培育該細胞，該混合物含有1pmol的各種載體(A3-178，A3-177，A3-175，A3-181或PNASSβ，參見圖4)，60μl DOTAP(Boehringer Mannheim 1202375)，以及300μl的20mM HEPES緩沖液。在室溫中培育該混合物10-15分鐘。每個平皿中的細胞在6ml無血清介質(zhì)中用DNA-DOTAP預(yù)培育6個小時，然后用PBS緩沖液洗滌該細胞兩次，并在全介質(zhì)中培育22個小時，為了測定上述β-半乳糖苷酶表達，獲取在200μl PBS中的細胞，冷卻至-20℃，進行溶胞作用，并把10μl的溶胞產(chǎn)物用底物以1∶10稀釋(3.29mM氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃糖苷(Boehringer Mannheim 884308)，100mM HEPES，150mM NaCl，2mM MgCl2，1％BSA，0.1％Triton X-100，0.1％疊氮化合物，PH＝7。在1:2步驟中稀釋試樣，并放入一個96孔板中，在37℃中培育，這時發(fā)現(xiàn)形成暗紅色，然后，在570/580nm或550nm中測試該試樣。
由圖5可看出細胞中報道基因的表達最高，用載體A3-178轉(zhuǎn)化該細胞，該異源的表達控制序列出現(xiàn)在該載體中編碼序列的轉(zhuǎn)譯起始點近端。
用本方法可以容易與迅速地確定，必須選擇什么樣的異源表達控制序列在一個宿主細胞的基因組中的位置，才能達到內(nèi)生目標(biāo)基因的最佳化表達。
實例3 DHFR-負(fù)細胞的制備在第一步驟中，制備本發(fā)明的用于重組的載體。在第二步驟中，將該載體轉(zhuǎn)入到人體的細胞系中，并篩分在同源的重組事件上，據(jù)這方法可以首先將一個、然后將第二個用于DHFR基因的同位基因失活。
用于同源重組的DHFR-載體該人體的DHFR基因定位于染色體5上，并包含分成6個外顯子的30kb。一個1.8kb大的EcoR1片段(其中含有部分啟動子，部分外顯子2與完整的外顯子1)可以被用以制備用于同源重組的載體，可以用一個Aapl消化物除去外顯子，并在形成的空隙(0.45kb)中，通過接頭加入Neo-(1.4kb)-或Hyg-(2.2kb)抗性基因，該接頭除了接合體核苷酸外，還含有最小的序列TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTF CAA TA(loxP-序列)。該接頭序列以相同的方法定向，即該抗性基因最好與DHFR基因抗性布置。在加入抗性基因后，該同源區(qū)域就擴大了，為此會使圍繞EcoR1片段的載體從3’區(qū)域(6.0kb)擴展(圖6)。這樣就可以獲得本發(fā)明的目標(biāo)結(jié)構(gòu)物pNDI(11.5kb)與pHDI(12.3kb)。
經(jīng)過有效的同源重組以后，就可除去完整的外顯子1(氨基酸1-28)與部分的DHFR基因的啟動子。現(xiàn)在，該細胞就不再能表達功能的DHFR蛋白質(zhì)。
細胞的轉(zhuǎn)染上述所用的人體的細胞系不應(yīng)該對染色體5呈多倍體，而且不能保持在MTX選樣下。在上述兩種情況下，有兩個以上的同位基因失活。
HeLa S3-細胞(ATCC CCL-2.2)把該細胞放入裝有RPMI 1640介質(zhì)，其中含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺與1mM MEN(非基本的氨基酸)的細胞組織瓶中培育，并在37℃溫度與5％CO2氣氛中溫育。該電泳緩沖液含有20mM Hepes(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸)，138mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM D-葡糖-單水化物，PH7.0。把10μg的線性載體DNA(pNDI)在960μF與250V的1×107細胞中電泳(多孔基因脈沖發(fā)生器)，經(jīng)電泳后，采集在含有600μg/ml G418(原生霉素Boehringer Mannheim)介質(zhì)中的該細胞中，并進行培育。經(jīng)過10天的選擇后(每2天更換介質(zhì))，離析其中的正克隆，并使其膨脹。
HT1080細胞(ATCC CCL-121)本細胞的培育與選擇過程與上述HeLa S3細胞類同，采用了DMEM介質(zhì)，其中含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺與1mM丙酮酸鈉。
Namalwa細胞(ATCC CRL-1432)
這種細胞系是懸浮液細胞系，而且必須進行相應(yīng)培養(yǎng)，所用的介質(zhì)相對應(yīng)于用于Hela S3細胞的介質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)染后，將細胞分布到40個96孔盤皿上，正的克隆是在48-，24-，12-與6-孔盤皿中膨脹。用1mg/ml G418進行選樣。
DHFR-負(fù)(+/1)細胞的證實借用Southern Blot分析儀或PCR證實載體的插入，在正確有效的同源重組中，通過EcoR1-消化物證實，除了一個代表未受損傷的DHFR基因的1.8kb帶以外，還有一個2.9kb的帶，它是通過插入Neo基因形成的(圖7C)?；旌峡寺?在Southern Blot中顯出不同比例的帶區(qū)強度)通過在FACS的單細胞沉積進行分離，亞克隆且隨后膨脹。其中，一個作為正的識別克隆的DHFR基因的同位基因失活。
DHR-角(+/-)細胞的制備細胞克隆(其中的DHFR-同位基因(+/-)失活)可以再進行同源重組，為此，如上述可用10μg的載體pHDI的線性DNA轉(zhuǎn)化，并在含有500μg/ml潮霉素B(Boehringer Mannheim)的介質(zhì)中進行選樣。
通過提高介質(zhì)中的G418濃度，可以提高在DHFR+/-細胞上的選擇壓力，并得到DHFR-/-細胞，基因轉(zhuǎn)換導(dǎo)致了染色體間的重組，其中使第二個DHFR-同位基因失活。
該DHFR-/-細胞含有兩個失活的DHFR同位基因，并且不能再合成四氫葉酸鹽。為此，必須加入介質(zhì)胸苷、甘氨酸與嘌呤(互補)，必要時，該細胞可以在α-介質(zhì)(Gibco BRL)中培養(yǎng)。
如上述可以證實了DHFR-/-細胞。對于純合子的DHFR-負(fù)細胞的情況，不能證實為野生區(qū)帶(1.8kb)。用pHDI轉(zhuǎn)化的細胞，經(jīng)過同源重組后，在EcoRI Southern Blot中顯示為一個新的3.7kb區(qū)帶(圖7C)。
DHFR-負(fù)細胞(-/-)的用途本發(fā)明的細胞可用于高產(chǎn)率地制備蛋白質(zhì)。其中，把本發(fā)明的載體(據(jù)圖8)和編碼Gre-重組酶的表達載體轉(zhuǎn)入到該DHFR-/-細胞中。該Cre重組酶將抗菌素抗性從該DHFR基因部位中除去，并整合到本發(fā)明的載體的DHFR-/-細胞的基因組中的LoxP序列中。該細胞將重新具有抗菌素過敏性，而且不依賴于胸苷、甘氨酸與嘌呤互補體。
通過使用不含互補體的介質(zhì)，或通過向培養(yǎng)介質(zhì)中加入適當(dāng)?shù)目咕剡M行選擇。為此，該抗菌素適應(yīng)抗性基因，它是通過Cre重組酶從細胞的基因組中除去。上述整合在LoxP序列中的載體含有一個正的選擇標(biāo)記基因。通過向介質(zhì)中加入該抗菌素進行上述選擇。
通過基因放大提高生產(chǎn)效率為了提高用于重組蛋白質(zhì)的細胞的生產(chǎn)效率，需進行氨甲喋呤(MTX)選擇。其中，使引入到細胞中的DHFR基因與異源的、為蛋白質(zhì)編碼的核酸序列放大。
為了實現(xiàn)放大，應(yīng)使上述細胞在有其濃度不斷提高(100-1000mM)的MTX的參與下，進行培養(yǎng)。相對比較用的Southern Blots(在加入MTX之前，期間與之后)，通過密度測定法測評出上述放大的程度。
經(jīng)過上述放大步驟后獲得的本發(fā)明的細胞，在LoxP基因座上，含有多個引入的DHFR基因與引入的異源核酸序列的復(fù)制物。它們的特征是可以提高上述異源核酸的生產(chǎn)率。
下面是作為本發(fā)明說明的要素的本發(fā)明實施方案1、改變內(nèi)生于真核細胞中的核酸序列的表達的方法，其特征是，(a)將第一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)至少一種選自第一種異源表達控制序列與第一種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)用于部位特異重組酶的、至少兩個位于序列(i)與序列(ii)兩側(cè)的目標(biāo)序列，(iv)在序列(i)、(ii)與(iii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下可形成載體的同源重組，(c)獲得按步驟(b)制得的細胞。
2、根據(jù)第1點的方法，其特征是，使用LoxP-序列作為重組酶-目標(biāo)序列。
3、根據(jù)第1或2點的方法，其特征是，該細胞是人體細胞。
4、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特征是，該細胞是無限增殖化了的細胞。
5、根據(jù)第4點的方法，其特征是，該細胞是HT1080細胞，Namalwa細胞，或Hela S3細胞。
6、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特征是，該異源表達控制序列優(yōu)選啟動子/增強子，最好是病毒啟動子，特別是CMV啟動子。
7、根據(jù)第1-6點中之一的方法，其特點是，該異源表達控制序列是3’-部位編碼的序列。
8、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特點是，該同源序列是這樣選擇的，即通過同源重組，除去內(nèi)生存在的核酸序列的內(nèi)生表達控制序列。
9、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特點是，該正的選擇標(biāo)記基因是新霉素、原生霉素或潮霉素抗性基因。
10、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特點是，該載體還包括負(fù)的選擇標(biāo)記基因，其中根據(jù)權(quán)利要求1的(a)(iv)安置于同源序列的外部。
11、根據(jù)前述幾點中之一的方法，其特點是，該定位于重組酶-目標(biāo)序列之間的核酸序列通過一個識別目標(biāo)序列的部位特異重組酶的瞬時激活，從細胞基因組切除。
12、根據(jù)第11點的方法，其特點是，(a)將第二種載體轉(zhuǎn)入該細胞，包括(i)至少一種選自第二種異源表達控制序列與第二種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標(biāo)記基因不同，(iii)至少兩個位于序列(i)和(ii)兩側(cè)的重組酶-目標(biāo)序列，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下能將目標(biāo)序列置于其兩側(cè)的序列整合在細胞基因組的目標(biāo)序列上，(c)獲得按步驟(b)制得的細胞，(d)必要時，可以用各種改變的表達控制序列和/或擴增標(biāo)記基因，至少重復(fù)一次(a)至(c)的步驟。
13、用于同源重組的載體，其中包括(i)至少一種選自一種表達控制序列與一種擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)至少兩個置于序列(i)與(ii)兩側(cè)的、用于部位特異重組酶的目標(biāo)序列，(iv)置于該序列(i)、(ii)與(iii)兩側(cè)的DNA序列，它與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(v)必要時，一個負(fù)的選擇標(biāo)記基因。
14、載體，其中包括(i)至少一種選自異源表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)至少兩個位于序列(i)與(ii)兩側(cè)的重組酶-目標(biāo)序列，和(iv)必要時，一個負(fù)的選擇標(biāo)記基因。
15、真核細胞，最好是人體細胞，可根據(jù)第1-12點中之一的方法獲得。
16、真核細胞，最好是人體細胞，其特征在于，(a)它含有至少一個與內(nèi)生存在的核酸序列有效連接的選自異源表達控制序列與擴增標(biāo)記基因的染色體定位的序列，且其中(b)重組酶-目標(biāo)序列置于該序列兩側(cè)。
17、一種改變內(nèi)生存在于真核細胞中的核酸序列的表達的方法，其特征是，(a)將一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，包括(i)至少一種能結(jié)合激活蛋白質(zhì)的核酸序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)置于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的一個核酸片段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定的條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下可使載體進行同源重組，(c)獲得按步驟(b)制得的細胞。
18、根據(jù)第17點的方法，其特征是，使用至少一種可結(jié)合缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的核酸序列。
19、根據(jù)第18點的方法，其特征是，該可結(jié)合HIV的核酸序列是選自根據(jù)序列ID NO.1的53bp序列，根據(jù)序列ID NO.2的43bp序列，一種與該序列同源的序列或一種在嚴(yán)格條件下與該序列雜交的序列。
20、根據(jù)第17-19點中之一的方法，它還包括用一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)一種能為激活蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，它與在這種細胞中活性的表達控制序列操縱結(jié)合，(ii)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因。
21、根據(jù)第20點的方法，其特征是，上述激活蛋白質(zhì)是HIF-1α或/和HIF-1β蛋白質(zhì)。
22、根據(jù)第18-21點中之一的方法，其特征是，該細胞在0.1-2％的氧濃度下培養(yǎng)。
23、用于同源重組的載體，其中包括(i)至少一種能連接激活蛋白質(zhì)的核酸序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)位于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸片段同源，以便可形成一種同源重組。
24、真核細胞，最好是人體細胞，可根據(jù)第17-21點中之一的方法制得。
25、真核細胞，最好是人體細胞，其特征是，它至少含有一個異源的、染色體定位的、與一個存在于細胞中的內(nèi)生基因操縱結(jié)合的、并能與一個激活蛋白質(zhì)/復(fù)合物結(jié)合的核酸片段。
26、一種測驗在真核細胞中內(nèi)生存在的目標(biāo)基因范圍未編碼的核酸序列對該表達影響的方法，其特征是，(a)將一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)一種異源的、在細胞中活性的或可激活的、并與報道基因操縱結(jié)合的表達控制序列，(ii)來自目標(biāo)基因范圍的、在5’部位或/和3’部位上未編碼的核酸片段，(b)在一定條件下培養(yǎng)該細胞，在該條件下該表達控制序列是活性的，(c)測定報道基因的表達。
27、根據(jù)第26點的方法，其特征是，該報道基因為氯霉素-乙?；?轉(zhuǎn)移酶-(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或LacZ編碼。
28、根據(jù)第26或27點中之一的方法，其特征是，(a)至少兩個載體，它們含有相互不同的在5’部位或和3’部位上未編碼的目標(biāo)基因的核酸片段，被轉(zhuǎn)入到各不同的細胞中，和(b)確定在不同的細胞中報道基因的表達。
29、一種DHFR負(fù)的真核細胞的制備方法，其特征是，(a)將第一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，其中包括(i)至少一種用于部位特異重組酶的目標(biāo)序列，(ii)置于序列(i)兩側(cè)的DNA序列，它們與內(nèi)生存在于該細胞中的DHFR核酸序列同源，以便可形成同源的重組，和(iii)必要時一個正的選擇標(biāo)記基因，以及必要時一個負(fù)的選擇標(biāo)記基因，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下可使載體實現(xiàn)同源重組，(c)獲得根據(jù)步驟(b)的細胞。
30、根據(jù)第29點的方法，其特征是，使用Lox-P序列作為重組酶目標(biāo)序列。
31、根據(jù)第29點或30點中之一的方法，其特征是，上述能為該正的選擇標(biāo)記基因編碼的核酸序列是新霉素-、卡那霉素-、原生霉素-或潮霉素抗性基因。
32、根據(jù)第29-31點中之一的方法，其特征是，上述能為負(fù)的選擇標(biāo)記基因編碼的核酸序列是一個胸苷激酶基因(TK)和/或次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(HGPRT)。
33、根據(jù)第29-32點中之一的方法，其特征是，上述被重組酶-目標(biāo)序列置于兩側(cè)的序列，通過相關(guān)的重組酶的瞬時激活作用，從基因組中切除。
34、向真核細胞中引入異源DHFR基因的方法，其特征是，把根據(jù)第33點的方法制得的細胞，(a)將第三種載體轉(zhuǎn)入，其中該載體包括(i)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因，它最好與第一種載體的正的選擇標(biāo)記基因不同，(ii)一種能為DHF編碼的核酸序列，(iii)一種待擴增的、可為蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，其中，來自部分序列(i)、(ii)與(iii)的核酸序列在5’部位與3’部位上各自被至少一個重組酶-目標(biāo)序列置于兩側(cè)，(b)在一定條件下培養(yǎng)該被轉(zhuǎn)入的細胞，在該條件下上述被重組酶-目標(biāo)序列置于兩側(cè)的核酸序列被整合到已經(jīng)在細胞的基因組中存在的重組酶-目標(biāo)序列上，(c)獲取根據(jù)第(b)步驟得到的細胞。
35、載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因，(ii)一種能為DHFR編碼的核酸序列，(iii)一種能為所希望的蛋白質(zhì)編碼的、處于可表達形式的核酸序列，其中來自部分序列(i)、(ii)和(iii)的核酸序列在5’部位和3’部位上各自被至少一個重組酸一目標(biāo)序列置于兩側(cè)。
36、用于同源重組的載體，其中包括(i)必要時，一個正的選擇標(biāo)記基因，(ii)至少各一種重組酶-目標(biāo)序列，它被置于該序列(i)的兩側(cè)，(iii)置于序列(i)和(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與內(nèi)生存在于一個細胞中的DHFR-核酸序列同源，以便能形成同源的重組，(iv)必要時，一個置于同源序列(iii))之外的負(fù)的選擇標(biāo)記基因。
37、真核細胞，最好是人體細胞，可通過根據(jù)第29-34點中之一的方法獲得。
38、真核細胞，最好是人體細胞，其特征是，(a)至少一個內(nèi)生的能為DHFR編碼的核酸序列是失活的，(b)在上述能為DHFR編碼的核酸序列范圍內(nèi)，至少一種重組酶-目標(biāo)序列被整合到基因組內(nèi)。
39、真核細胞，最好是人體細胞，其特征是，在內(nèi)生DHFR基因座范圍中的異源核酸序列，其中包括(i)一種能為DHFR編碼的核酸序列，(ii)一個能為希望的蛋白質(zhì)編碼的核酸序列和(iii)至少一個重組酶-目標(biāo)序列。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名字Boehringer Mannheim Gmbh(B)街號Sandhofer街112-132(C)地區(qū)Mannheim(E)國別德國(F)郵政編碼D-68305(ii)發(fā)明名稱“用于細胞中內(nèi)生基因活化的最佳化方法”(iii)序列數(shù)量3個(iv)計算機可辨認(rèn)的框架(A)數(shù)據(jù)載體軟盤(B)計算機IBM相容型PC機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)序列SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度53堿基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1CCTCTCCTCT AGGCCCGTGG GGCTGGCCCT GCACCGCCGA GCTTCCCGGG ATG(2)序列SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度43堿基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型
(xi)序列描述SEQ ID NO2CTACGTGCTG TCTCACACAG CCTGTCTGAC CTCTCGACCC TAC(2)序列SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)種類核苷酸(C)繩狀雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA
權(quán)利要求
1.一種改變內(nèi)生存在于真核細胞中的核酸序列表達的方法，其特征是，(a)使一種載體轉(zhuǎn)入該細胞，包括(i)至少一種能結(jié)合激活蛋白質(zhì)的核酸序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)置于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的一個核酸截段同源，以便可形成同源的重組，(b)在一定的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)入了的細胞，在該條件下可使載體進行同源的重組，(c)獲得按步驟(b)制得的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是，使用至少一種能連接缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的核酸序列。
3.用于同源重組的載體，其中包括(i)至少一種能連接激活蛋白質(zhì)的核酸序列，(ii)一個正的選擇標(biāo)記基因，(iii)位于序列(i)與(ii)兩側(cè)的DNA序列，它們與細胞基因組中的核酸截段同源，以便可形成一種同源重組。
4.真核細胞，最好是人體細胞，可根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法獲得。
5.真核細胞，最好是人體細胞，其特征是，它至少含有異源的、染色體定位的、與存在于細胞中的內(nèi)生基因操縱結(jié)合的、并可與一個激活蛋白質(zhì)/復(fù)合物結(jié)合的核酸片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞內(nèi)生基因表達的優(yōu)化方法。首先，涉及一種改變內(nèi)生存在于真核細胞中的目標(biāo)基因的表達的方法，其中，借助于同源重組作用，把一種異源表達控制序列引入到細胞的基因組中，而且該方法中還包括使插入的外來DNA的、部位特異重組酶介導(dǎo)的切除，以及用其他的異源表達控制序列或/和擴增標(biāo)記基因代替之；本發(fā)明還涉及把一個或多個在其上結(jié)合存在一個激活因子蛋白質(zhì)或一個激活蛋白質(zhì)復(fù)合物例如一個缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)上的核酸序列通過同源重組引入到一個真核細胞的基因組內(nèi)，以便改變目標(biāo)基因的表達。本發(fā)明還涉及一個通過對報道基因表達的確定，測定在5’部位或3’部位上未編碼的核酸片段對目標(biāo)基因表達的影響的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種含有重組酶－目標(biāo)序列的、DHFR－負(fù)真核細胞的制備方法，以及插入在該重組酶－目標(biāo)序列中的核酸序列的表達。
文檔編號C12N15/79GK1590551SQ20041006387
公開日2005年3月9日 申請日期1998年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月1日
發(fā)明者K·豪諾德, T·浩特史克, A·斯特恩 申請人:羅切診斷學(xué)有限公司