專利名稱：植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脫落酸(abscisic acid, ABA)是一種非常重要的天然植物生長激素，是最早得到確認(rèn)的五大類植物激素之一。脫落酸參與了許多植物生長和發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、幼苗生長、葉片氣孔開閉等，此外還是一種重要的抗逆誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)了植物對(duì)逆境如干旱、鹽堿、 低溫等的抵抗作用，因此脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究對(duì)植物生長發(fā)育調(diào)控的理解、作物品質(zhì)的提高具有十分重要的意義。轉(zhuǎn)錄調(diào)控在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，已經(jīng)有報(bào)道多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與到脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。Mediator復(fù)合體是一類以多蛋白的形式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)合體，目前的功能研究表明該類復(fù)合體有可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和RNA聚合酶II中間起到一個(gè)橋梁連接的作用，從而共同調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。Mediator復(fù)合體最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，且該類復(fù)合體在動(dòng)植物中均具有較強(qiáng)的保守性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，是如下(a)或(b)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物抗逆相關(guān)蛋白活性的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL 上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其 5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表的序列2所示的DNA分子(cDNA)；2)序列表的序列3所示的DNA分子(基因組DNA)；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、的DNA分子雜交且編碼植物抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子。4)與1)或2)的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼植物抗逆相關(guān)蛋白的DNA 分子。上述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表的序列3所示的DNA分子是由5596個(gè)核苷酸組成，自5'末端第 215-318位核苷酸為第一個(gè)外顯子，第319-823位核苷酸為第一個(gè)內(nèi)含子，第擬4_邪4 位核苷酸為第二個(gè)外顯子，第855-1046位核苷酸為第二個(gè)內(nèi)含子，第1047-1110位核苷酸為第三個(gè)外顯子，第1111-1231位核苷酸為第三個(gè)內(nèi)含子，第1232-1360位核苷酸為四個(gè)外顯子，第1361-1566位核苷酸為第四個(gè)內(nèi)含子，第1567-1770位核苷酸為第五個(gè)外顯子，第1771-1860位核苷酸為第五個(gè)內(nèi)含子，第1861-19 位核苷酸為第六個(gè)外顯子，第1929-2071位核苷酸為第六個(gè)內(nèi)含子，第2072-2288位核苷酸為第七個(gè)外顯子，第2觀9-對(duì)04位核苷酸為第七個(gè)內(nèi)含子，第2405-M72位核苷酸為第八個(gè)外顯子，第2473-2771位核苷酸為第八個(gè)內(nèi)含子，第2772-3569位核苷酸為第九個(gè)外顯子，第3570-3644位核苷酸為第九個(gè)內(nèi)含子，第3645-3698位核苷酸為第十個(gè)外顯子， 第3699-3844位核苷酸為第十個(gè)內(nèi)含子，第3845-3873位核苷酸為第i^一個(gè)外顯子， 第3874-4005位核苷酸為第i^一個(gè)內(nèi)含子，第4006-4074位核苷酸為第十二個(gè)外顯子， 第4075-4169位核苷酸為第十二個(gè)內(nèi)含子，第4170-42M位核苷酸為第十三個(gè)外顯子， 第4255-4595位核苷酸為第十三個(gè)內(nèi)含子，第4596-4682位核苷酸為第十四個(gè)外顯子，第 4683-4765位核苷酸為第十四個(gè)內(nèi)含子，第4766-5269位核苷酸為第十五個(gè)外顯子。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種培育抗逆性增強(qiáng)的植物的方法，是抑制目的植物中所述蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到抗逆性增強(qiáng)的植物；所述目的植物為基因組DNA中含有所述蛋白的編碼基因的植物。所述抗逆性為抗旱和/或抗鹽。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，具體可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育脫落酸敏感性增強(qiáng)的植物的方法，是抑制目的植物中所述蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到脫落酸敏感性增強(qiáng)的植物；所述目的植物為基因組DNA中含有所述蛋白的編碼基因的植物。本發(fā)明提供的植物抗逆性相關(guān)蛋白是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的mediator復(fù)合體中的一個(gè)亞基，對(duì)植物脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用，抑制所述蛋白的編碼基因在植株中的表達(dá)后， 植株的抗旱性及抗鹽性顯著增加，本發(fā)明在植物(特別是農(nóng)作物)品種的改良中將發(fā)揮巨大作用。


圖1為擬南芥ber6及其等位突變體中BER6基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)；1 =Col-O ；2 ber6 突變體；3 突變體 salk_1295550圖2為擬南芥ber6及其等位突變體中BER6基因翻譯水平的檢測(cè)；1 =Col-O ；2 ber6 突變體；3 突變體 salk_1295550圖3為擬南芥ber6及其等位突變體對(duì)脫落酸的敏感性(以種子萌發(fā)率衡量)。圖4為擬南芥ber6及其等位突變體對(duì)脫落酸的敏感性(以子葉轉(zhuǎn)綠衡量)。圖5為擬南芥ber6及其等位突變體的抗旱實(shí)驗(yàn)。圖6為擬南芥ber6及其等位突變體的抗鹽實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-O)公眾可網(wǎng)上購買www, arabidopsis. org。實(shí)施例1、ber6突變體分析一、擬南芥ber6突變體的獲得及鑒定以ABA敏感程度作為篩選指標(biāo)，通過遺傳篩選EMS誘變?nèi)后w獲得了 ber6突變體， ber6突變體表現(xiàn)為種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠和對(duì)ABA超敏感。遺傳雜交發(fā)現(xiàn)ber6突變位點(diǎn)為隱性單基因突變，圖位克隆并結(jié)合測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在ber6中BER6基因的第5個(gè)內(nèi)含子處的可變剪輯位點(diǎn)發(fā)生了一個(gè)鳥嘌呤(guanine G)到腺嘌呤(adenine Α)的轉(zhuǎn)變，突變位點(diǎn)鑒定引物如下引物 1 :5，-TCCTTCAGGCCAAGCTCAA-3，引物 2 5，-GAAGCTGCTTTGGACATACAA-3，擴(kuò)增得到大小326bp的產(chǎn)物。經(jīng)測(cè)序表明該片段具有自序列表中序列1的5’端 1578-1902位核苷酸序列，第1771位核苷酸在ber6突變體中由G突變成了 A，使得原本的可變剪輯終止并將第5個(gè)內(nèi)含子中的前沈個(gè)堿基轉(zhuǎn)化為外顯子，并最終導(dǎo)致編碼蛋白的移碼，喪失了蛋白的功能域。二、擬南芥ber6突變體及其等位突變體轉(zhuǎn)錄水平的分析從擬南芥網(wǎng)站的種子資源庫(公眾可網(wǎng)上購買:www. arabidopsis. org)獲得一個(gè)T-DNA插入突變體(T-DNA插入在BER6基因第5個(gè)外顯子處的一個(gè)突變體)，即突變體 salk_12955501、通過PCR方法鑒定了突變體salk_129555的純合性。引物 3 :5，-TGGAACTGGTCCAACAGAAAC-3，；
引物 4 :5，-TGCATTGGCTTTCTTCCATAC-3，；引物 5 5，-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3，。(引物5為salk系列T-DNA插入突變體鑒定通用引物)引物3和引物4組成的引物對(duì)的靶序列為組合序列表中序列3自5’末端第 1280-2454位核苷酸，引物3和引物5組成的引物對(duì)可以判定T-DNA的插入。如果采用引物4和引物5組成的引物對(duì)能夠擴(kuò)增得到約SOObp的條帶，并且采用引物3和引物4組成的引物對(duì)不能得到擴(kuò)增條帶，表明突變體salk_129555是純合的T-DNA插入突變體。結(jié)果表明，突變體salk_129555是純合的T-DNA插入突變體。2、BER6基因表達(dá)量的檢測(cè)(1)分別提取生長14天的Col-0，ber6突變體和突變體salk_129555幼苗的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。(2)以步驟(1)的cDNA為模板，用引物6和引物7組成的引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，檢測(cè)BER6基因的表達(dá)量。引物 6 :5，-CCGCCGCTTTGGGTCCTTATT-3，；引物 7 5，-CCCTTCAGCTGTGGCAACCTCAT-3，。靶序列為序列表中序列2自5’末端第44-312位核苷酸Q69bp)。(3)以步驟(1)的cDNA為模板，用引物8和引物9組成的引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，檢測(cè)ACT7基因(一個(gè)組成型表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白的編碼基因，常作為內(nèi)參基因)的表達(dá)量。引物 8 :5，-CCATTCAGGCCGTTCTTTC-3，；引物 9 5，-CGTTCTGCGGTAGTGGTGA-3，。將BER6基因的表達(dá)量除以ACT7基因的表達(dá)量，作為BER6基因的相對(duì)表達(dá)量，見圖1。與Co 1 -0相比ber6突變體中BER6基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，這和 ber6突變體的突變性質(zhì)相符合。突變體aslk_129555中BER6基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于 Col-Ο，說明T-DNA的插入導(dǎo)致了突變體salk_129555中BER6基因表達(dá)量的下調(diào)，突變體 salk_129555為一個(gè)缺失突變體。三、擬南芥ber6突變體及其等位突變體翻譯水平的分析將序列表的序列1所示的BER6蛋白作為抗原，得到BER6的抗體。分別檢測(cè)Col_0， ber6突變體，突變體salk_129555中BER6蛋白的翻譯情況。結(jié)果見圖2，ber6突變體和突變體salk_129555中均檢測(cè)不到BER6蛋白的存在。這說明ber6突變體中，BER6基因突變影響了蛋白的正確翻譯，為功能缺失型的突變體。突變體salk_129555中蛋白翻譯水平因?yàn)檗D(zhuǎn)錄水平下調(diào)而相應(yīng)地受到影響。上述結(jié)果表明，ber6突變體和突變體salk_129555均為功能缺失型的突變體。實(shí)施例2、ber6及其等位突變體植株的表型分析一、ber6及其等位突變體植株對(duì)脫落酸(ABA)的敏感性將Col-0，ber6突變體和突變體salk_129555的種子分別分成兩組，每組約100 粒；第一組播種在MS培養(yǎng)基上，第二組播種在含有0. 5 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上，第三組播種在含有1 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上，第四組播種在含有2 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上，第五組播種在含有3 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上；4°C暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至22°C光照條件(1 光照/8h 黑暗)下培養(yǎng)5天，拍照并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。種子萌發(fā)率結(jié)果(三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值)見圖3。在沒有脫落酸的情況下， Col-0, ber6突變體和突變體salk_129555的萌發(fā)率均為100%。在存在脫落酸的情況下， ber6突變體和突變體salk_129555的萌發(fā)率顯著低于Col-O的萌發(fā)率。結(jié)果表明，相對(duì)于 Col-O來說，ber6突變體和突變體salk_129555對(duì)ABA的敏感性大大提高。照片見圖4，A為MS培養(yǎng)基上植株的照片，B為含有1 μ M ABA的MS培養(yǎng)基上植株的照片。在沒有脫落酸存在的情況下，Col-0, ber6突變體和突變體salk_129555的表型沒有顯著差異。在存在脫落酸的情況下，ber6突變體和突變體salk_129555的生長能力以及子葉變綠程度顯著低于Col-Ο。結(jié)果表明，相對(duì)于Col-O來說，ber6突變體和突變體 salk_129555對(duì)ABA的敏感性大大提高。二、ber6及其等位突變體植株的抗旱性將Col-0，ber6突變體和突變體salk_129555的種子(各50粒)分別播種在MS 培養(yǎng)基上，4°C暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至22°C光照條件(1 光照/ 黑暗)下培養(yǎng)14天 ’然后將幼苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土和蛭石為2 1(質(zhì)量比)的混合土里培養(yǎng)，連續(xù)30天不澆水(干旱處理)，干旱處理第30天拍照；然后恢復(fù)正常澆水(復(fù)水)，復(fù)水2天后拍照并統(tǒng)計(jì)存活率。結(jié)果見圖5，A為干旱處理30天的照片，B為復(fù)水2天后的照片。相對(duì)于Col-O來說，ber6突變體和突變體salk_129555的抗旱適應(yīng)性大大提高。干旱處理30天后，Col-O 葉片發(fā)生失水萎焉時(shí)，ber6突變體和突變體salk_129555的葉片還沒完全萎焉。復(fù)水2天后，Col-O的存活率為0%，ber6突變體和突變體salk_129555的存活率均為80%以上。結(jié)果表明，BER6基因突變能明顯提高植物對(duì)干旱的抗性。三、ber6突變體植株的抗鹽性將Col-O，ber6突變體和突變體salk_129555的種子(各50粒)分別播種在MS 培養(yǎng)基上，4°C暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至22°C光照條件(1 光照/8h黑暗)下培養(yǎng)14天； 然后將幼苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土和蛭石為2 1(質(zhì)量比)的混合土里培養(yǎng)33天，用水正常澆灌； 然后將植株隨機(jī)等分為兩組，一組繼續(xù)用水澆灌，另一組用200mM NaCl水溶液澆灌，15天后拍照。照片見圖6，A為用水澆灌的植株的照片，B為用200mM NaCl水溶液澆灌的植株的照片。在用水澆灌的情況下，Col-0、ber6突變體和突變體salk_129555的表型沒有顯著差異。在用200mM NaCl水溶液澆灌的情況下，Col-O出現(xiàn)明顯的萎焉白化表型，ber6突變體和突變體salk_129555的莖稈保持直立生長，葉片青綠。結(jié)果表明，相對(duì)于Col_0，ber6突變體和突變體salk_129555的抗鹽能力明顯增強(qiáng)，BER6基因突變能明顯提高植物的抗鹽性。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物抗逆相關(guān)蛋白活性的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或幻的DNA分子雜交且編碼植物抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子。4)與1)或2)的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼植物抗逆相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種培育抗逆性增強(qiáng)的植物的方法，是抑制目的植物中權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到抗逆性增強(qiáng)的植物；所述目的植物為基因組DNA中含有權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的植物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述編碼基因?yàn)闄?quán)利要求3所述的基因。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗旱和/或抗鹽。
8.如權(quán)利要求5或6或7所述的方法，其特征在于所述植物為擬南芥。
9.一種培育脫落酸敏感性增強(qiáng)的植物的方法，是抑制目的植物中的權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到脫落酸敏感性增強(qiáng)的植物；所述目的植物為基因組DNA中含有權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述編碼基因?yàn)闄?quán)利要求3所述的基因； 所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)；(b)將序列表的序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物抗逆相關(guān)蛋白活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)一種培育抗逆性增強(qiáng)的植物的方法，是抑制目的植物中所述蛋白的編碼基因的表達(dá)，得到抗逆性增強(qiáng)的植物。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的mediator復(fù)合體中的一個(gè)亞基，對(duì)植物脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用，抑制所述蛋白的編碼基因在植株中的表達(dá)后，植株的抗旱性及抗鹽性顯著增加，本發(fā)明在植物(特別是農(nóng)作物)品種的改良中將發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102391367SQ20111039372
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者李傳友, 李紅美, 蔣紅玲, 陳蓉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所