專利名稱：一種鑒別牛分枝桿菌的pcr引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測鑒別技術(shù)，具體地說涉及對牛分枝桿菌進行PCR鑒別用引物及使用該引物的PCR鑒別方法。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病，該病可通過病畜或其產(chǎn)品傳染給人類或其他動物。感染牛結(jié)核分枝桿菌的大多數(shù)牛不呈顯性感染或僅到晚期才出現(xiàn)臨床癥狀，故早期臨床診斷不易獲得準確結(jié)果。病原學檢查是最確實的方法之一，病理學檢查可以根據(jù)特征病變確診，但必須在動物死亡或宰殺后進行且所需確診周期長，需3-8周，所以常常不被實際工作所采用。由于牛奶、牛肉等食品與人類生活息息相關(guān)， 結(jié)核桿菌可侵犯人和動物的全身各器官，以肺結(jié)核最常見。因此及時確定病原菌，合理進行牛結(jié)核病的防控有利于保障公共衛(wèi)生安全。結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)包括結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和II型、牛分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、caprae分枝桿菌以及canettii分枝桿菌。目前臨床上鑒別牛結(jié)核桿菌的方法最廣泛的是變態(tài)反應診斷，但該法存在著極強的非特異性反應，即在相當數(shù)量的結(jié)核變態(tài)反應陽性牛中，既找不出特征病變，又不能分離出結(jié)核桿菌，或僅僅分離出非典型的分枝桿菌，而且妊娠母牛仍然檢出率低，在重復檢疫時陽性率下降，因此在實際工作中用于診斷牛結(jié)核病并不十分理想。近年來，以聚合酶鏈式反應(PCR)和實時熒光PCR為代表的分子生物學技術(shù)在結(jié)核或副結(jié)核病原菌快速檢測鑒別方面發(fā)展較快，但均為針對結(jié)核分枝桿菌復合群，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌單獨菌種的方法，也有直接通過基因分型方法直接鑒別出分枝桿菌各種型的，然而這些方法有的只給出了鑒別單獨菌株的引物，有的給出了很多信息，卻沒有進行靈敏度試驗，這對于臨床運用是不夠完善的，有的不夠經(jīng)濟，成本較高，如熒光定量PCR。 例如2002年Richard C. Huard等建立了鑒別分枝桿菌復合群中各菌株的PCR方法，能特異性的鑒別出MTBC中的各種菌；2007年張鷺等根據(jù)牛分枝桿菌MPB70的特異性基因序列進 PCR擴增，檢測牛奶中的MTBC，陽性率達到40. 9%，靈敏度達到40ng/L ；2007年孟祥紅等人建立了多重PCR技術(shù)可以快速鑒別結(jié)核分枝桿菌和非分結(jié)核分枝桿菌，應用多重PCR法與 BACTEC培養(yǎng)的結(jié)果有很高的一致性，為臨床結(jié)核病和分枝桿菌病的鑒別診斷提供了有效的手段；2010年賈廣樂等根據(jù)IS1081序列設(shè)計熒光定量PCR引物及探針，建立了牛結(jié)核病 TaqMan熒光定量PCR檢測方法。上述方法，都只是單獨的給出了鑒別某一種菌的PCR相關(guān)方法，有的采用探針雜交，熒光定量等經(jīng)濟成本較高的方法，這些都不利于臨床檢測樣品， 目前還沒有系統(tǒng)地使用整套引物對分枝桿菌屬類的主要細菌進行鑒別的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別牛分枝桿菌的PCR用引物及PCR鑒別方法。本發(fā)明用于PCR鑒別牛分枝桿菌的特異性引物組合，用于鑒別分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌復合群、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG株。其分別能對分枝桿菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)域的 Rvl970,牛分枝桿菌pncA基因和RDl區(qū)基因進行擴增，生成特異性擴增片段。本發(fā)明提供的牛分枝桿菌PCR鑒別用引物組合，包括1 16SrRNA-F 5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，；16SrRNA-R 5’ -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’ ；2MTBC-F 5’ -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’ ；MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’ ；3MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’ ；MT-R 5’ -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3 ‘；4PncA-F 5， -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3，；PncA-R 5’ -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’ ；5RD1-F 5’ -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’ ；RDl-R 5’ -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3，。本發(fā)明提供一種牛分枝桿菌PCR鑒別方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物組合分別進行PCR擴增，反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。本發(fā)明提供一種鑒別牛分枝桿菌的PCR方法，還包括當待測菌為未知菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第1 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為分枝桿菌屬細菌時，以樣品總DNA為模板，利用上述第2 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為結(jié)核分枝桿菌復合群細菌時，以樣品總DNA為模板，利用上述第3 5 對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為結(jié)核分枝桿菌時，以樣品總DNA為模板，利用上述第4 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為牛分枝桿菌細菌時，以樣品總DNA為模板，利用上述第5對引物，進行 PCR擴增；反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng) 94°〇變性4()8，601退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有MT引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C 退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有RDl引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C 退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。上述PCR擴增反應體系，其中20 μ 1反應液的具體配置為上游引物下游引物 Taq Mix ddH20
250ηΜ 0.5μ1 250ηΜ 0.5μ1 10μ1 8 μ
5ng 0.5μ1
DNA模板可以將本發(fā)明引物以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明的試劑盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個可以裝有本發(fā)明的引物，根據(jù)需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外， 本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于PCR反應的一種或多種酶/試劑，以及實施本發(fā)明所需要的其它成分及用具。使用本發(fā)明的引物以及方法進行鑒別的樣品來源包括分離的菌種資源或動物組織，但并不局限于此。本發(fā)明提供了上述5對引物在制備用于檢測及鑒別牛分枝桿菌的試劑中的用途。應用本發(fā)明的PCR鑒別方法能鑒別出減毒的牛結(jié)核分枝桿菌，如BCG，而減毒牛結(jié)核分枝桿菌常常作為制備預防結(jié)核病的疫苗的種子來源，因此本發(fā)明還提供了上述5種引物或本發(fā)明的PCR鑒別分枝桿菌的方法在制備預防結(jié)核病疫苗中的應用。本發(fā)明提供的5對引物是經(jīng)過篩選優(yōu)化獲得的，可以逐步縮小待檢分枝桿菌所屬范圍，獲得準確的相關(guān)檢測結(jié)果，一旦在整套反應方向上某對引物出現(xiàn)陰性結(jié)果，就立即可以確定待檢分枝桿菌所屬范圍，這是與分枝桿菌屬、種群分類復雜性相關(guān)的。分枝桿菌屬、 結(jié)核桿菌復合群MTBC、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株關(guān)系圖見圖17。通過使用本發(fā)明的5對引物，分別對所測菌種的DNA進行PCR擴增，生成特異擴增片段，從而能夠簡單且精確地對分枝桿菌進行鑒別。并且，本發(fā)明的引物僅針對目的片段特異擴增，不會擴增其它區(qū)域，并且，本研究建立了牛分枝桿菌的檢測方法，可以將臨床未知樣品從分枝桿菌屬開始進行鑒別，逐步鑒別出結(jié)核分枝桿菌復合群，結(jié)核桿菌，牛分枝桿菌以及牛分枝桿菌經(jīng)過傳代獲得的減毒株BCG株，形成一套鑒別牛分枝桿菌的完整的PCR方法。該方法簡便，操作簡單，一臺PCR儀就可以完成，實現(xiàn)快速、大通量診斷和檢測。比采用一對引物鑒別出單獨菌株的方法更可靠，降低了鑒別時易造成假陰性或假陽性結(jié)果的概率，也可以對實驗室保存的菌株進行監(jiān)測，確保菌株保存過程中沒有被別的雜菌污染。研究表明本研究建立的這一套PCR方法體系，特異性達到100%，靈敏度達到pg級。圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rRNA引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為 543bp ；M 分子量標準為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 =BCG ；4 恥垢分枝桿菌標準株cm2155 ；5 禽分枝桿菌參考株C68201 ；6 葡萄球菌(CAU0411) ；7 大腸桿菌(CAU0439) ；8 空白對照；圖2為1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測MTBC引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為786bp， Μ:分子量標準為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考


株C68001 ；3 =BCG ；4 恥垢分枝桿菌；5 禽分枝桿菌參考株C68201 ；6 空白對照；圖3為瓊脂糖凝膠電泳檢測MT引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小分別為 1116bp, M 分子量標準為I plus DNA marker, 1 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 =BCG ；4 空白對照；圖4為1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測pncA引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小為^4bp， M 分子量標準為2( plus DNA marker, 1 牛分枝桿菌參考株C68001 ；2 =BCG ；3 結(jié)核分枝桿菌參考株C68503 ；4 空白對照；圖5為瓊脂糖凝膠電泳檢測RDl引物PCR產(chǎn)物結(jié)果，產(chǎn)物條帶大小分別為 200bp, M 分子量標準為2K plus DNA marker, 1 :BCG ；2 牛分枝桿菌參考株C68001 ；3 空白對照；圖6 為 16S rRNA 引物敏感性檢測 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 陰性對照， M 分子量標準為2K plus DNAmarker ；圖7MTBC 引物敏感性檢測 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 :400fg，6 陰性對照 M 分子量標準為2K plus DNA marker ；圖8MT 引物敏感性檢測 1 :12ng,2 1. 2ng,3 :240pg，4 :48pg，5 :9. 6pg，6 :1.92pg， 7 陰性對照M :分子量標準為2K plus DNAmarker ；圖9pncA 引物敏感性檢測 1 :4ng，2 :400pg，3 :40pg，4 :4pg，5 :400fg，6 陰性對照 M 分子量標準為2K plus DNA marker ；圖10RD1 引物敏感性檢測 1 :25ng，2 :4. 7ng，3 :470pg，4 :47pg，5 :4. 7pg，6 :470fg, 7 陰性對照M :分子量標準為2K plus DNAmarker ；圖1116S rRNA引物鑒別結(jié)果1 7 編號分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標準為2K plus DNA marker ；圖12MTBC引物鑒別結(jié)果1 7 編號分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標準為 2K plus DNA marker ；圖13MT引物鑒別結(jié)果1 7 編號分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標準為2K plus DNA marker ；+ 陽性對照；-陰性對照；圖14pncA引物鑒別結(jié)果1 7 編號分別為1，2，3，4，5，6，7，的保存菌株；M 分子量標準為2K plus DNA marker ；+ 陽性對照；-陰性對照；圖15RD1引物鑒別結(jié)果1 5 編號分別為1,2,4,6,7,的保存菌株；M 分子量標準為2K plus DNA marker ；+ 陽性對照；-陰性對照。圖16臨床上對疑似結(jié)核桿菌感染的貓皮膚結(jié)節(jié)組織液PCR鑒別；M 分子量標準為 2K plus DNA marker, 1 16SrRNA引物PCR結(jié)果；2 :MTBC弓丨物PCR 結(jié)果；3 =MT引物PCR結(jié)果；4 =PncA引物PCR結(jié)果；5 =RDl引物PCR結(jié)果；圖17本PCR鑒別方法可檢測的分枝桿菌屬、結(jié)核桿菌復合群MTBC、結(jié)核桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG株關(guān)系示意圖
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
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若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用菌株為牛分枝桿菌參考株C68001，結(jié)核分枝桿菌參考株C68503，牛分枝桿菌BCG參考株C68017，禽分枝桿菌參考株C68201購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；恥垢分枝桿菌標準株cm2155以及非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株C68203，由本實驗保存；葡萄球菌、 大腸桿菌，本實驗室保存，編號為CAU0411，CAU0439)。實施例IPCR特異性引物的設(shè)計16SrRNA所對應的16S rDNA基因在細菌基因組中具有高度保守性，可以鑒別屬的細菌的原理，首先根據(jù)分枝桿菌屬16Sr RNA保守區(qū)設(shè)計引物，目的片段大小為M3bp序列， 利用軟件和I^imer 3設(shè)計引物，引物序列為16SrRNA-F 5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，；16SrRNA-R 5’ -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’ ；Rv0577為MTBC限定基因，根據(jù)這段基因設(shè)計引物，PCR擴增的目的片段大小為 786bp。引物序列為MTBC-F 5’ -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’ ；MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’ ；由于缺失區(qū)7 (deleted region7，RD7)不存在于其他MTBC菌種中，只有結(jié)核分枝桿菌具有這個基因區(qū)，根據(jù)這段區(qū)域中的RV1970(lprM)設(shè)計引物，PCR擴增的目的片段大小為1116bp。引物序列為MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3，；MT-R 5' -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3‘；試驗證明，人結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌在吡喹酰胺編碼基因pncA上存在SNP現(xiàn)象，利用基因點突變的特點，設(shè)計引物，可以特異性的鑒別出牛分枝桿菌(包括BCG株)，牛分枝桿菌(以及BCG株)能特異性的擴增出^Sbp的條帶，而結(jié)核分枝桿菌沒有條帶。。引物序列為PncA-F 5’ -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3，；PncA-R 5’ -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’ ；NCBI基因分析結(jié)果表示，RDl區(qū)僅僅存在于致病性的分枝桿菌中，RDl區(qū)基因全長 9. 51Λ，共9個開放閱讀框(Rv3871-3879)，因此我們可以以此來區(qū)分牛分枝桿菌與BCG，BCG 株缺少基因RDl區(qū)，根據(jù)這段基因設(shè)計引物，對牛分枝桿菌而言，不能有效的擴增出全長為 9. 5kb的RDl序列，而BCG只能擴增出200bp的產(chǎn)物，故可以特異性的鑒別出這兩者。引物序列為RDl-F 5’ -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’ ；RDl-R 5 ’ -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3 ’。實施例2PCR擴增方法的建立1、PCR反應體系以細菌總DNA為模板，進行PCR反應，20 μ L反應體系為上游引物250ηΜ 0.5μ1下游引物250ηΜ 0.5μ1Taq Mix10μ1ddH208 μ DNA模板5ng 0.5μ1。2、PCR反應條件含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng) 94°〇變性4()8，601退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；含有MT引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C 退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；含有RDl引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C 退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。反應結(jié)束后擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。實施例3PCR方法的特異性檢驗分別以結(jié)核分枝桿菌C68503、牛分枝桿菌C68001、牛分枝桿菌BCGC68017、恥垢分枝桿菌cm2155、禽分枝桿菌C68201、葡萄球菌CAU0411、大腸桿菌CAU0439的DNA為模板，以水為空白對照，分別用本發(fā)明的5對引物，通過本發(fā)明建立的PCR方法進行檢驗，PCR反應結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳的特異性擴增條帶判定結(jié)果。試驗結(jié)果IBSrRNA引物的PCR結(jié)果分枝桿菌屬的PCR擴增產(chǎn)物出現(xiàn)陽性擴增，而其它菌株和空白對照均沒有目的擴增片段出現(xiàn)，結(jié)果見圖1。MTBC引物的PCR結(jié)果結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和BCG出現(xiàn)陽性擴增，恥垢分枝桿菌、禽分枝桿菌和空白對照沒有目的擴增片段出現(xiàn)，結(jié)果見圖2。MT引物的PCR結(jié)果結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)陽性擴增，牛分枝桿菌、BCG和空白對照沒有目的擴增片段出現(xiàn)，結(jié)果見圖3。pncA引物的PCR結(jié)果牛分枝桿菌和BCG出現(xiàn)陽性擴增，結(jié)核分枝桿菌和空白對照沒有目的擴增片段出現(xiàn)，結(jié)果見圖4。RDl引物的PCR結(jié)果BCG出現(xiàn)陽性擴增，牛分枝桿菌和空白對照沒有目的擴增片段出現(xiàn)，結(jié)果見圖5。反應產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后，與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細胞；再用OMEGA的質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，送測序公司測序。結(jié)果表明本發(fā)明設(shè)計的5對引物具有很好的特異性，能特異性的鑒別出分枝桿菌屬，結(jié)核分枝桿菌復合群，結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌及BCG。實施例4PCR方法的靈敏度檢驗以牛分枝桿菌參考株，人結(jié)核分枝桿菌參考菌株，牛分枝桿菌BCG參考株為模板， 分別檢測其DNA濃度為^g/ μ 1，12ng/ μ 1和47ng/ μ 1，并進行梯度稀釋，最后牛分枝桿菌參考株每個稀釋度含400fg、4pg、40pg、400pg、4ng的DNA ；人結(jié)核分枝桿菌參考菌株每個稀釋度含1. 2pg、9. 6pg、48pg、240pg、l. 2ngU2ng的DNA ；牛分枝桿菌BCG參考株每個稀釋度含470fg、4. 7pg、47pg、470pg、4. 7ng、25ng的DNA ；按照上述PCR體系和條件分別進行擴增， 檢驗其敏感性。PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳(見圖6，7，8，9，10)。結(jié)果表明， 16S rRNA引物、MTBC引物、pncA引物靈敏度可以檢測到40pg的DNA ；MT引物靈敏度可以檢測到9. 6pg的DNA ；ET引物靈敏度可以檢測到470fg的DNA，說明本發(fā)明PCR方法具有很好的靈敏度。 實施例5PCR方法的應用使用所建立的PCR方法，對實驗室保存的7株分枝桿菌進行鑒別。這7株分枝桿菌分別是1 :C68021，牛分枝桿菌，來自英國中央獸醫(yī)實驗室，AN5 ；2 :C68004，牛分枝桿菌，來自哈爾濱獸研所，北京系；3 :C68501，結(jié)核分枝桿菌，保存于中國農(nóng)業(yè)大學國家動物海綿狀腦病實驗室；4 :C68006，牛分枝桿菌，分離于結(jié)核病牛，北京，1953，保存于中國農(nóng)業(yè)大學國家動物海綿狀腦病實驗室；5 :C68203，鳥分枝桿菌，分離于結(jié)核病雞，保存于中國農(nóng)業(yè)大學國家動物海綿狀腦
病實驗室；6 :C68017，來自衛(wèi)生部檢定所的BCG ；7 :3003-13，來自中國疾病預防控制中心的BCG。首先將7株分枝桿菌進行增菌培養(yǎng)，提取細菌DNA，以該DNA為模板，分別用上述5 對引物以及PCR體系和條件，對7株分枝桿菌進行擴增，PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳(見圖11，12，13，14，15)。結(jié)果如表1所示。表1實驗室保存菌株鑒別結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于PCR鑒別牛分枝桿菌的特異性引物組合，其特征在于，其分別能對分枝桿菌屬細菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復合群MTBC的Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7 區(qū)域的Rvl970，牛分枝桿菌pncA基因和RDl區(qū)基因進行擴增，生成特異性擴增片段。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR鑒別用引物組合，包括 116SrRNA-F 5' -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGT T TC-3'； 16SrRNA-R 5' -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3‘； 2MTBC-F 5' -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3‘； MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3‘； 3MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3，；MT-R 5' -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3‘； 4PncA-F 5’ -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’ ； PncA-R 5' -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3‘； 5RD1-F 5' -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3‘； RDl-R 5' -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。
3.一種鑒別牛分枝桿菌的PCR方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求 1或2所述的引物分別進行PCR擴增，反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括當待測菌為未知菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第1 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為分枝桿菌屬細菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第2 5 對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為結(jié)核分枝桿菌復合群細菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第3 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為結(jié)核分枝桿菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第4 5對引物組合，分別進行PCR擴增；或當待測菌為牛分枝桿菌細菌時，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的第5對引物，進行PCR擴增；反應結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
5.如權(quán)利要求3或4所述的PCR方法，其特征在于，含有16SrRNA、MTBC, PncA引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C 變性40s，60°C退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有MT引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，61°C退火 40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；或含有RDl引物對的PCR的反應程序為預變性94°C、5min，再經(jīng)94°C變性40s，62°C退火40s，72°C延伸40s，31個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
6.如權(quán)利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR擴增反應體系，其中20μ1反應液的具體配置為上游引物下游引物 Taq Mix ddH20250nM 0.5 μ 250ηΜ 0.5 μ 10μ1 8 μ 5ng 0.5μ1。DNA模板
7.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，樣品總DNA來自分離的菌種資源或動物組織。
8.一種鑒別牛分枝桿菌的試劑盒，其包括，權(quán)利要求1或2所述的引物組合。
9.權(quán)利要求1或2所述的引物對在制備用于檢測及鑒別牛分枝桿菌試劑中的用途。
10.權(quán)利要求1 2所述的引物或權(quán)利要求3 4所述的方法在制備預防結(jié)核病疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了牛分枝桿菌PCR鑒別用5對引物及鑒別方法，5對引物分別針對分枝桿菌屬細菌的16SrRNA保守區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)Rv0577基因，結(jié)核分枝桿菌RD7區(qū)域的Rv1970，牛分枝桿菌pncA基因和RD1區(qū)基因進行擴增，生成特異擴增片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1～5所示。本發(fā)明的鑒別方法是以樣品總DNA為模板，利用上述5對引物分別進行PCR擴增，根據(jù)擴增條帶的大小判定結(jié)果。本發(fā)明引物能特異性地鑒別出分枝桿菌屬，MTBC，結(jié)核分枝桿菌，牛分枝桿菌及牛分枝桿菌BCG，檢測方法靈敏度好，方法簡便，操作簡單，能實現(xiàn)牛分枝桿菌快速、大通量的檢測。
文檔編號C12N15/11GK102409102SQ20111039192
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者周向梅, 尹曉敏, 李華, 楊利峰, 楊春華, 林敬鈞, 趙德明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學