專利名稱：一種檢測肺癌易感基因的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種檢測肺癌易感基因的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
易感基因是指和特定疾病具有一定關(guān)聯(lián)的基因或等位基因。對復(fù)雜疾病的易感基因進(jìn)行檢測，得到其具體的序列信息，然后結(jié)合后續(xù)進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)、臨床觀察以及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，建立一定的疾病模型，可以實(shí)現(xiàn)早期評估疾病的易感性并采取相應(yīng)預(yù)防措施降低疾病的發(fā)生幾率。大量研究證實(shí)遺傳因素在疾病的易感性中發(fā)揮重要作用，復(fù)雜疾病的遺傳因素己證實(shí)存在微效基因劑量效應(yīng)，即多個微效基因的作用相互累加進(jìn)而形成明顯的表型綜合效應(yīng)。因此，對疾病的多個易感基因及突變位點(diǎn) (特別是針對基因組中最主要的遺傳突變形式——單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)，它約占整個基因組中遺傳突變的92% )進(jìn)行檢測至關(guān)重要。肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮，亦稱支氣管肺癌。隨著工業(yè)發(fā)展，大氣污染加劇，在全球范圍內(nèi)肺癌發(fā)生率與死亡率每年都以4. 5%的速度快速遞增。肺癌成為死亡率最高的一種癌癥，一方面是目前仍沒有特別有藥物與治療方案，10-15%的低治愈率，另一方面是肺癌發(fā)現(xiàn)一般都是晚期，甚至癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。臨床表明，越早發(fā)現(xiàn)，肺癌患者生存率越高。肺癌易感基因?yàn)槌醪窖芯靠赡芘c肺癌有一定關(guān)聯(lián)的基因，其中各易感基因的關(guān)聯(lián)度有高有低。目前，檢測肺癌易感基因的方法最常見的是Sanger測序法，該方法能對肺癌易感基因進(jìn)行區(qū)域檢測，但Sanger測序法每次只能對一個樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測序，測序成本高，靈敏度低(20% )，無法得出各突變位點(diǎn)發(fā)生變異的精確數(shù)據(jù)。此外，雖然針對肺癌易感基因檢測以及SNP位點(diǎn)的研究成果已經(jīng)很多，但現(xiàn)有技術(shù)適用于針對單個SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測及分析，不適于對多SNP位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合檢測和分析，檢測結(jié)果均不夠準(zhǔn)確全面。因此需要一種檢測肺癌易感基因的新方法，能對肺癌易感基因的多個區(qū)域同時進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，包括已知突變和未知突變的各突變位點(diǎn)的變異情況，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步同時對大量樣品檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測肺癌易感基因的方法及相應(yīng)的試劑盒，能對肺癌易感基因的多個目標(biāo)區(qū)域同時進(jìn)行檢測，得出這些區(qū)域的準(zhǔn)確序列信息，包括已知突變和未知突變的各突變位點(diǎn)的變異情況，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步同時對大量樣品進(jìn)行檢測。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，一種檢測肺癌易感基因的方法，包括以下步驟A.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫；
B.對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；C.同時對所述多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測序，得到所述多個目標(biāo)區(qū)域的序列信息。其中，所述步驟A包括Al.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；A2.利用接頭元件，與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測序文庫；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。其中，步驟A2包括以下步驟A21.對與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得到片段化產(chǎn)物；A22.利用接頭元件，與片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測序文庫。其中，所述步驟A22包括以下步驟A221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物；A222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物；A223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；A224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測序文庫。其中，所述步驟A22包括以下步驟Α22Γ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；A222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；A223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測序文庫。其中，步驟A2所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫構(gòu)建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應(yīng)的標(biāo)記。所述第一標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，所述第一標(biāo)簽序列堿基數(shù)為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，步驟A所述的肺癌易感基因特異性引物與目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。進(jìn)一步的，與每個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的特異性引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端帶有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物做上相應(yīng)的標(biāo)記。所述第二標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，所述第二標(biāo)簽序列堿基數(shù)不限，優(yōu)選為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，所述肺癌易感基因包括APEl、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYPlAl、 CYP2E1、ERCCl、ERCC2、ERCC6、Exol、GSTPl、Hmlhl、IL-1 β、MDM2、ΜΡ0、MTHFR、NQOl、OGGl、 Ρ73、RASSFU TERT, TGFBl、ΤΡ53、ΤΡ63、XPC 和 XRCCl 中的至少一個。進(jìn)一步的，所述APEl的特異性引物為SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2 ；所述CASP7的特異性引物為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 ；所述CASP8的特異性引物為SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO 6 ；所述CASP9的特異性引物為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 ；所述CHEK2的特異性引物為SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10 ；所述C0X—2的特異性引物為SEQ ID NO 11禾口SEQ ID NO 12 ；所述 CYPlAl 的特異性引物包括 SEQ ID N0:13 禾口 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15和SEQ IDNO 16中的至少一對；所述CYP2E1的特異性引物為SEQ ID NO 17和SEQ IDNO 18 ；所述ERCCl的特異性引物為SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20 ；所述ERCC2的特異性引物包括 SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 中的至少一對；所述ERCC6的特異性引物為SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26 ；所述Exol的特異性引物為 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 ；所述 GSTPl 的特異性引物為 SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO 30 ；所述Hmlhl的特異性引物為SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32 ；所述IL-I β的特異性引物為SEQ IDNO 33和SEQ ID NO 34 ；所述MDM2的特異性引物為SEQ ID NO 35和SEQ IDNO 36 ；所述MPO的特異性引物為SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38 ；所述MTHFR的特異性引物為SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 40 ；所述NQOl的特異性引物為SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42 ；所述OGGl的特異性引物為SEQ IDNO :43和SEQ ID NO 44 ；所述Ρ73的特異性引物包括 SEQ ID NO 45 和 SEQ IDNO :46、SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO 48 中的至少一對；所述RASSFl的特異性引物為SEQ ID NO :49和SEQ ID NO 50 ；所述TERT的特異性引物為SEQ IDNO 51 和 SEQ ID NO 52 ；所述 TGFBl 的特異性引物為 SEQ ID NO 53 和 SEQ IDNO 54 ；所述ΤΡ53的特異性引物為SEQ ID NO 55和SEQ ID NO 56 ；所述ΤΡ63的特異性引物為SEQ ID NO 57 和 SEQ ID NO 58 ；所述 XPC 的特異性引物為 SEQ ID NO 59 和 SEQ ID NO 60 ；所述 XRCCl 的特異性引物包括 SEQ ID Ν0:61 禾口 SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63 禾口 SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO :65 和 SEQ IDNO :66、SEQ ID NO 67 和 SEQ ID NO 68 中的至少一對。其中，所述方法還可以包括步驟D.利用GSTMl及GSTTl的擴(kuò)增引物對待測樣品的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測GSTMl和GSTTl基因的缺失情況；步驟D與步驟A、B、C無先后關(guān)系。進(jìn)一步的，所述GSTMl 的擴(kuò)增引物包括 SEQ ID NO 69 禾口 SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71和SEQ ID NO -J2中的至少一對；所述GSTTl的擴(kuò)增引物為SEQID NO 73和SEQ ID NO :74。一種能夠用于本發(fā)明的任一種檢測肺癌易感基因方法的試劑盒，包括肺癌易感基因特異性引物，用于對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；接頭元件，用于與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合構(gòu)建測序文庫。其中，所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。其中，所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫構(gòu)建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應(yīng)的標(biāo)記。所述第一標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，所述第一標(biāo)簽序列堿基數(shù)為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，所述的待測易感基因有多個，與每個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的特異性引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端帶有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物做上相應(yīng)的標(biāo)記。所述第二標(biāo)簽序列優(yōu)選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限，優(yōu)選的， 第二標(biāo)簽序列的堿基數(shù)為3 20，更優(yōu)選為4 10。其中，所述肺癌易感基因包括APEl、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYPlAl、CYP2E1、ERCCl、ERCC2、ERCC6、Exol、GSTPl、Hmlhl、IL-1 β、MDM2、ΜΡ0、MTHFR、NQOl、OGGl、 Ρ73、RASSFU TERT, TGFBl、ΤΡ53、ΤΡ63、XPC 和 XRCCl 中的至少一個。進(jìn)一步的，所述肺癌易感基因還包括GSTM1、GSTTl中的至少一個。進(jìn)一步的，所述APEl的特異性引物為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；所述CASP7 的特異性引物為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 ；所述CASP8的特異性引物為SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO 6 ；所述CASP9的特異性引物為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 ；所述CHEK2的特異性引物為SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10 ；所述C0X-2的特異性引物為SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO :12 ；所述 CYPlAl 的特異性引物包括 SEQ ID Ν0:13 禾口 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15和SEQ IDNO 16中的至少一對；所述CYP2E1的特異性引物為SEQ ID NO 17和SEQ IDNO 18 ；所述ERCCl的特異性引物為SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20 ；所述ERCC2的特異性引物包括 SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 中的至少一對；所述ERCC6的特異性引物為SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26 ；所述Exol的特異性引物為 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 ；所述 GSTPl 的特異性引物為 SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO 30 ；所述Hmlhl的特異性引物為SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32 ；所述IL-I β的特異性引物為SEQ IDNO 33和SEQ ID NO 34 ；所述MDM2的特異性引物為SEQ ID NO 35和SEQ IDNO 36 ；所述MPO的特異性引物為SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38 ；所述MTHFR的特異性引物為SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 40 ；所述NQO 1的特異性引物為SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42 ；所述OGGl的特異性引物為SEQ IDNO 43和SEQ ID NO 44 ；所述Ρ73的特異性引物包括 SEQ ID NO 45 和 SEQ IDNO :46、SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO 48 中的至少一對； 所述RASSFl的特異性引物為SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 50 ；所述TERT的特異性引物為 SEQ IDNO 51 和 SEQ ID NO 52 ；所述 TGFBl 的特異性引物為 SEQ ID NO 53 和 SEQ IDNO 54 ；所述ΤΡ53的特異性引物為SEQ ID Ν0:55和SEQ ID NO 56 ；所述ΤΡ63的特異性引物為 SEQ ID Ν0:57 禾口 SEQ ID NO :58 ；所述 XPC 的特異性引物為 SEQ ID NO 59 禾口 SEQ ID NO: 60 ；所述 XRCC 1 的特異性引物包括 SEQ ID NO 61 和 SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63 和 SEQ ID NO 64,SEQ ID NO 65 和 SEQ IDNO 66,SEQ ID NO 67 和 SEQ ID NO 68 中的至少一對； 所述 GSTMl 的特異性引物包括 SEQ ID NO 69 和 SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 71 和 SEQ ID NO 72中的至少一對；所述GSTTl的特異性引物為SEQ ID NO 73和SEQ ID NO :74。由上可知，本發(fā)明提供的肺癌易感基因檢測方法及其試劑盒，能同時檢測肺癌易感基因的多個區(qū)域，準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，包括已知突變和未知突變的各突變位點(diǎn)的變異情況，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步同時對大量樣品檢測。


圖1是本發(fā)明一個實(shí)施例中檢測肺癌易感基因的方法流程圖；圖2是本發(fā)明一個實(shí)施例中的單突出末端接頭的接頭示意圖；圖3是本發(fā)明一個實(shí)施例中的雙突出末端接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明一個實(shí)施例中的帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是本發(fā)明一個實(shí)施例中的分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本發(fā)明一個實(shí)施例中的T末端分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖7是本發(fā)明另一個實(shí)施例中的分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖8是本發(fā)明一個實(shí)施例中的雙脫氧分叉接頭的結(jié)構(gòu)示意圖；圖9是本發(fā)明一個實(shí)施例中利用片段化產(chǎn)物和接頭元件構(gòu)建測序文庫的方法流程圖；圖10是本發(fā)明另一個實(shí)施例中利用片段化產(chǎn)物和接頭元件構(gòu)建測序文庫的方法流程圖；圖11是本發(fā)明另一個實(shí)施例中利用片段化產(chǎn)物和接頭元件構(gòu)建測序文庫的方法流程圖；圖12是本發(fā)明另一個實(shí)施例中檢測肺癌易感基因的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明所述的目標(biāo)區(qū)域，為肺癌易感基因上的任意序列，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，包括但不限于肺癌易感基因的內(nèi)部序列、肺癌易感基因的外部調(diào)控序列，所述肺癌易感基因的內(nèi)部序列，包括但不限于肺癌易感基因的內(nèi)含子區(qū)域、外顯子區(qū)域、同時含有內(nèi)含子與外顯子的區(qū)域。圖1示出了本發(fā)明的一種檢測肺癌易感基因的方法流程，該方法包括以下步驟Si.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫；S2.對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；S3.同時對所述多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測序，得到所述多個目標(biāo)區(qū)域的序列信息。本方法利用高通量測序技術(shù)對肺癌易感基因的多個區(qū)域同時進(jìn)行區(qū)域測序，能夠準(zhǔn)確得知這些區(qū)域的序列信息，包括已知突變和未知突變的各突變位點(diǎn)的變異情況，檢測靈敏度高，能夠準(zhǔn)確且全面得到肺癌易感基因的序列信息。通過本方法檢測得到的肺癌易感基因序列信息，可以結(jié)合后續(xù)進(jìn)一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)、臨床觀察以及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，并建立一定的肺癌疾病模型，實(shí)現(xiàn)早期評估肺癌的易感性。需要說明的是步驟Sl中所述待測樣品為能提取核酸的任意形式的樣品，包括但不限于全血、 血清、血漿和組織樣品；所述組織樣品包括但不限于石蠟包埋組織、新鮮組織和冰凍切片。步驟Sl中所述的多個目標(biāo)區(qū)域，它們可來源于同一個肺癌易感基因，也可來源于不同的肺癌易感基因。步驟Sl所得測序文庫中，存在多種測序文庫分子，對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增， 即是指，將測序文庫中的多種文庫分子，以極微量(甚至單分子)的形式在空間上隔離(但這些文庫分子整體上還是屬于同一個反應(yīng)體系)，并且在各自的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增?，F(xiàn)有技術(shù)中，Sanger測序技術(shù)每次只能對一個樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測序，要實(shí)
8現(xiàn)對多個目標(biāo)區(qū)域的測序，只能是通過多次反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。而在本發(fā)明中，測序文庫中的各個分子經(jīng)過單分子擴(kuò)增后，每個測序文庫分子均形成單分子拷貝陣列，各單分子拷貝陣列在進(jìn)行高通量基因測序時處于不同的位置，使得測序引物與單分子拷貝陣列之間的雜交，以及在酶作用下的延伸反應(yīng)可同時進(jìn)行，相互之間互不干擾。因此，可以同時對大量的(成百萬上千萬，甚至更多的)單分子拷貝陣列同時進(jìn)行測序反應(yīng)，然后通過采集相應(yīng)的信號， 進(jìn)而獲得所需的序列信息，且測序的靈敏度較Sanger更高。其中，步驟Sl所述的特異性引物與目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。進(jìn)一步的，與每個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)， 且該引物的5’端帶有第二標(biāo)簽序列。該第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物做上相應(yīng)的標(biāo)記。該第二標(biāo)簽序列，優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。該第二標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20，更優(yōu)選為4 10。此外，所述特異性引物還可帶有其它標(biāo)記物，包括但不限于生物素標(biāo)記、多聚組氨酸標(biāo)記、抗原、抗體，從而使得目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的純化極為方便。另外，同一待測樣品的不同目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增可同時進(jìn)行或分別獨(dú)立進(jìn)行或部分同時進(jìn)行。在具體的實(shí)驗(yàn)過程中，可根據(jù)需要選用上述任一種方案進(jìn)行。如果分別對各目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分別擴(kuò)增的話，能夠通過測定擴(kuò)增產(chǎn)物的量來確保步驟Sl中用于構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域測序文庫的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)保持一致，不會因?yàn)閿U(kuò)增步驟而導(dǎo)致同一待測樣品的不同目標(biāo)區(qū)域拷貝數(shù)不同，進(jìn)而影響后續(xù)的測序反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)然，當(dāng)各目標(biāo)區(qū)域的大小相近，GC含量也相近的時候，通過合理的設(shè)計引物，利用多重PCR技術(shù)，步驟Sl可對多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行同時擴(kuò)增，且保證各目標(biāo)區(qū)域之間的擴(kuò)增效率保持基本一致，這樣就能夠有效的提高實(shí)驗(yàn)效率，降低反應(yīng)的成本。當(dāng)待測樣品有多個時，不同樣品的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增必須分別進(jìn)行。其中，步驟Sl所述的肺癌易感基因包括APEl、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、 CYPIA1、CYP2E1、ERCC1、ERCC2、ERCC6、Exo1、GSTP1、Hmlh1、IL-1 β、MDM2、MPO、MTHFR、NQO1、 OGGl、Ρ73、RASSFU TERT, TGFBl、ΤΡ53、ΤΡ63、XPC 和 XRCCl 中的至少一種。進(jìn)一步的，所述APEl的特異性引物為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；所述CASP7 的特異性引物為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4 ；所述CASP8的特異性引物為SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO 6 ；所述CASP9的特異性引物為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 ；所述CHEK2的特異性引物為SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10 ；所述C0X-2的特異性引物為SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO :12 ；所述 CYPlAl 的特異性引物包括 SEQ ID Ν0:13 禾口 SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15和SEQ IDNO 16中的至少一對；所述CYP2E1的特異性引物為SEQ ID NO 17和SEQ IDNO 18 ；所述ERCCl的特異性引物為SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20 ；所述ERCC2的特異性引物包括 SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 中的至少一對；所述ERCC6的特異性引物為SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26 ；所述Exol的特異性引物為 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 ；所述 GSTPl 的特異性引物為 SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO 30 ；所述Hmlhl的特異性引物為SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32 ；所述IL-I β的特異性引物為SEQ IDNO 33和SEQ ID NO 34 ；所述MDM2的特異性引物為SEQ ID NO 35和SEQ IDNO 36 ；所述MPO的特異性引物為SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38 ；所述MTHFR的特異性引物為SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 40 ；所述NQOl的特異性引物為SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42 ；所述OGGl的特異性引物為SEQ IDNO 43和SEQ ID NO 44 ；所述P73的特異性引物包括 SEQ ID NO 45 和 SEQ IDNO :46、SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO 48 中的至少一對； 所述RASSFl的特異性引物為SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 50 ；所述TERT的特異性引物為 SEQ IDNO 51 和 SEQ ID NO 52 ；所述 TGFB 1 的特異性引物為 SEQ ID NO 53 和 SEQ IDNO 54 ；所述TP53的特異性引物為SEQ ID N0:55和SEQ ID NO :56 ；所述TP63的特異性引物為 SEQ ID NO 57 和 SEQ ID NO 58 ；所述 XPC 的特異性引物為 SEQ ID NO 59 和 SEQ ID NO 60 ；所述 XRCC 1 的特異性引物包括 SEQ ID NO 61 和 SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63 和 SEQ ID NO 64,SEQ ID NO :65 禾口 SEQ IDNO 66、SEQ ID NO :67 禾口 SEQ ID NO :68 中的至少一對。在一個實(shí)施例中，步驟Sl的具體實(shí)現(xiàn)過程是Sll.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；S12.利用接頭元件，與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測序文庫；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。需要說明的是步驟Sll中，對同一待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增，可同時進(jìn)行或分別獨(dú)立進(jìn)行或部分同時進(jìn)行。可根據(jù)實(shí)際情況，如擴(kuò)增所用的肺癌易感基因特異性引物的退火溫度，擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域的大小、GC含量，擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域的數(shù)量等，進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增必須分別進(jìn)行。步驟S12中，所述接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物的連接方式，可以采用多種方式實(shí)現(xiàn)，包括接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接，或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理之后再進(jìn)行連接。步驟S12所述接頭元件，用于構(gòu)建測序文庫，可包括一種或多種接頭。其中，步驟S12所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標(biāo)簽序列，該第一標(biāo)簽序列，用于在文庫構(gòu)建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應(yīng)的標(biāo)記。這樣，在分別獲得目標(biāo)區(qū)域測序文庫后，不同的待測樣品的目標(biāo)區(qū)域測序文庫可以混合在同一個反應(yīng)體系中，進(jìn)行單分子擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)而同時進(jìn)行高通量測序。提高測序反應(yīng)的效率，降低了樣品檢測的成本。該第一標(biāo)簽序列優(yōu)選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數(shù)不限。進(jìn)一步的，所述第一標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為3 20，這樣，每次至少能夠?qū)?3個樣品進(jìn)行同時檢測。在綜合考慮各種情況后，如標(biāo)簽的特異性、接頭的成本、接頭的長度等，第一標(biāo)簽序列的堿基數(shù)優(yōu)選為4 10。通過第二標(biāo)簽和第一標(biāo)簽的結(jié)合，本發(fā)明的發(fā)明每次能夠檢測至少43X43個樣品，即4096個樣品。接頭的修飾方式有多種，包括但不限于被生物素化或甲基化，或同時被生物素化和甲基化。在一個實(shí)施例中，該接頭被生物素化，并與未生物素化的片段化產(chǎn)物連接，生物素的存在有利于構(gòu)建的測序文庫的分離純化。在另一個實(shí)施例中，該接頭被甲基化，并與未甲基化的片段化產(chǎn)物連接，然后用僅切割甲基化DNA的限制性內(nèi)切酶消化成功連接的連接產(chǎn)物，從而確保酶切產(chǎn)物的單一性。
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接頭的結(jié)構(gòu)形式也有多種，包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭。構(gòu)建測序文庫過程中可以使用一種或多種接頭。其中，突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭均能夠有效防止在連接過程中，多個接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。針對接頭的上述結(jié)構(gòu)形式，以下將提供多個實(shí)施例。在第一實(shí)施例中，接頭元件采用平末端接頭，該接頭是雙鏈完全互補(bǔ)的核酸分子。在第二實(shí)施例中，接頭元件采用突出末端接頭，該接頭是雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子至少包括一突出末端。該突出末端的堿基數(shù)無具體限制，優(yōu)選為1 10個堿基。根據(jù)該雙鏈核酸分子的結(jié)構(gòu)，突出末端接頭可分成兩類，分別是單突出末端接頭、雙突出末端接頭。如圖2所示的單突出末端接頭，其一端為平末端，另一端為突出末端。其中帶有分叉接頭的單突出末端接頭能夠防止接頭自連。為了防止一端為平末端的單突出末端接頭自連，可對平末端上的3’ OH進(jìn)行修飾(包括但不限于用氨基封閉羥基)，或?qū)⑵侥┒松系?’ 磷酸基團(tuán)去除。如圖3所示的雙突出末端接頭，其含有兩個突出末端，這兩個突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖3a)或在不同的核苷酸鏈上(圖北)。當(dāng)這兩個突出末端在不同的核酸鏈上時，他們相互之間不互補(bǔ)，以防在連接時出現(xiàn)接頭自連。在第三實(shí)施例中，接頭元件采用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，如圖4所示。該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子包括第一互補(bǔ)配對區(qū)1、莖環(huán)區(qū)2和第二互補(bǔ)配對區(qū)3(圖如)，第一互補(bǔ)配對區(qū)1能夠與第二互補(bǔ)配對區(qū)3互補(bǔ)配對，且它們形成的互補(bǔ)配對區(qū)包括至少一個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，而通過該酶切識別位點(diǎn)，特定的酶能夠?qū)⑶o環(huán)區(qū)切開或切除，從而將單鏈核酸分子變成雙鏈核酸分子，以便于后續(xù)的操作。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，如圖 4b所示，帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭還可帶有突出末端4，該突出末端可位于單鏈核酸分子的5’端或3’端。突出末端4的存在能夠進(jìn)一步的防止接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。該突出末端優(yōu)選為 T。在第四實(shí)施例中，接頭元件采用分叉接頭，如圖5所示，是雙鏈核酸分子，包括互補(bǔ)區(qū)和分叉區(qū)，所述分叉區(qū)的兩條單鏈各包含至少一個擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述分叉接頭的互補(bǔ)區(qū)包括至少一個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，該酶切識別位點(diǎn)可以在建庫過程中酶切形成末端，以便于進(jìn)行后續(xù)的操作。該分叉接頭的分叉設(shè)計能夠在建庫過程避免多個接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)；所述分叉區(qū)上包含的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，可以直接用于結(jié)合擴(kuò)增引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)其中，所述分叉接頭的分叉區(qū)的每條鏈各含有N個核苷酸；優(yōu)選的，9 < NS 30。 其中，所述分叉接頭的配對區(qū)互補(bǔ)配對的核苷酸對數(shù)不限；優(yōu)選的，互補(bǔ)配對的核苷酸對數(shù)為7 15，更優(yōu)選的，互補(bǔ)配對的核苷酸對數(shù)為9 13。其中，所述分叉接頭的配對區(qū)的3’末端為突出末端或平末端。優(yōu)選的，所述分叉接頭的配對區(qū)的3’末端為突出末端，該突出末端可與所述片段化產(chǎn)物的粘性末端互補(bǔ)配對， 提高了連接效率，以利于構(gòu)建測序文庫反應(yīng)的順利進(jìn)行。更優(yōu)選的，所述分叉接頭為T末端分叉接頭，該接頭的配對區(qū)的3’末端為突出末端，且突出末端最后一個堿基為T ；例如圖6所示的T末端分叉接頭，圖中N為A、T、C、G堿基中的任一種。
更優(yōu)選的，所述分叉接頭的配對區(qū)的3’末端為突出末端，且突出末端的核苷酸包括通用堿基。其中，突出末端的堿基數(shù)無特殊限制，優(yōu)選在1至4之間。例如圖7所示的分叉接頭，圖中N為A、T、C、G堿基中的任一種，X為通用堿基。優(yōu)選的，所述分叉接頭為雙脫氧接頭，該接頭的配對區(qū)的3’末端為平末端，且3’ 末端最后一個核苷酸為帶有雙脫氧堿基的核苷酸；例如圖8所示的雙脫氧分叉接頭，圖中N 為A、T、C、G堿基中的任一種，dd表示該3’末端最后一個核苷酸為帶有雙脫氧堿基的胞嘧啶核苷酸。應(yīng)當(dāng)說明的是，上述接頭元件只是部分實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。關(guān)于步驟S12的實(shí)現(xiàn)方式在一個實(shí)施例中，步驟S12采用接頭元件與擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接的方式，構(gòu)建出測序文庫。在另一個實(shí)施例中，根據(jù)高通量測序技術(shù)的需要，當(dāng)目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物較大時或者需要構(gòu)建的目標(biāo)區(qū)域測序文庫較小時，則對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化處理之后，再與接頭元件進(jìn)行連接，構(gòu)建測序文庫，如圖9所示，步驟S12包括以下步驟S121.對與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得到片段化產(chǎn)物；S122.利用接頭元件，與片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測序文庫。該步驟通過片段化處理，將不同的擴(kuò)增產(chǎn)物變成長短相似的片段化產(chǎn)物，能夠有助于后續(xù)的統(tǒng)一測序。需要說明的是步驟S121中，所述片段化擴(kuò)增產(chǎn)物的方法有多種，可以根據(jù)需要選擇采用現(xiàn)有技術(shù)，包括但不限于霧化、超聲破碎、機(jī)械剪切破碎片段化、酶切片段化、化學(xué)以及熱誘導(dǎo)片段化。所述片段化處理之后還可包括片段化產(chǎn)物的分離純化以及末端修飾的步驟。根據(jù)測序的片段長度需要，對于片段化得到的核酸片段，進(jìn)行目的核酸片段的分離純化，分離方法可以采用常用方法，如凝膠電泳、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離等。根據(jù)所使用的片段化方法，對所得的目的核酸片段進(jìn)一步的末端修飾，包括但不限于磷酸化或去磷酸化、末端補(bǔ)平和末端加A，以便于后續(xù)的接頭元件連接。上述目的核酸片段長短不限，優(yōu)選為25bp 500bp，更優(yōu)選為30bp 200bp，更優(yōu)選為40 lOObp。步驟S121所述片段化產(chǎn)物的長度不限，優(yōu)選在25bp至500bp之間，更優(yōu)選在30bp 至200bp之間，更優(yōu)選在40bp至IOObp之間。在實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)區(qū)域的測序的前提下，隨著目標(biāo)區(qū)域測序文庫分子中含有的目標(biāo)區(qū)域片段長度的減短，高通量測序技術(shù)的對目標(biāo)區(qū)域的測序深度加深；而測序深度越深，即對目標(biāo)區(qū)域的每一個堿基位置的測序次數(shù)越多，測序結(jié)果越準(zhǔn)確，對樣品中的少量突變的檢測就越靈敏；這樣就能夠有效防止因?yàn)闃悠分袔в型蛔兊哪繕?biāo)區(qū)域的比例偏低，而導(dǎo)致該突變的測序信號的絕對值偏低，發(fā)生測序結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象。根據(jù)上述接頭元件，針對步驟S122，本發(fā)明給出不同實(shí)施例，下面將通過多個實(shí)施例和附圖對本步驟進(jìn)行進(jìn)一步的說明。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，直接在片段化產(chǎn)物的兩端接上接頭形成測序文庫。所述接頭可采用上述的平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。 在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，直接在片段化產(chǎn)物兩端接上分叉接頭，形成測序文庫。本技術(shù)方案可以利用分叉接頭的特性，防止多個接頭之間自連現(xiàn)象的發(fā)生。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，如圖10所示，步驟S122具體可由以下步驟實(shí)現(xiàn)S1221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物；S1222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物；S1223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物；S1224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測序文庫。步驟S1221中，所述第一接頭可采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，所述第一接頭包含有II S型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)；所述的 II s型限制性內(nèi)切酶為切割位點(diǎn)在識別序列之外的限制性內(nèi)切酶，包括但不限于Acu I、 Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15I、Fau I,Fok I,Hga I,Hph I、HpyAV、Mbo II,Mly I,Mme I,Mnl I,NmeAIII,Ple I、Sap I、SfaN I 禾口 TspDT I，優(yōu)選為 Acu I、Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。當(dāng)所述第一接頭為分叉接頭時，該II s型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)位于互補(bǔ)區(qū)；當(dāng)所述第一接頭為帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭時，限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離，較II S型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離近。若片段化產(chǎn)物經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，以及末端加A反應(yīng)，所述第一接頭優(yōu)選為帶T 末端的分叉接頭。若片段化產(chǎn)物只是經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，將片段化產(chǎn)物的末端補(bǔ)平，則所述第一接頭優(yōu)選雙脫氧接頭。在步驟S1222中，環(huán)化第一連接產(chǎn)物有多種實(shí)現(xiàn)方式。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，步驟S1222包括以下步驟S12221.利用酶切引物對第一連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；S12222.對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使得擴(kuò)增產(chǎn)物形成粘性末端，并自身環(huán)化成環(huán)化產(chǎn)物。所述酶切引物的3’端分別與第一連接產(chǎn)物的兩個末端部分互補(bǔ)，5’端均含有限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。經(jīng)過步驟S12221的擴(kuò)增形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，其兩個末端均含有限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，然后在相應(yīng)的酶的作用下，使擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端形成粘性末端，且這兩個粘性末端互補(bǔ)，能夠進(jìn)行自身環(huán)化。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述第一接頭包含有2個酶切識別位點(diǎn)，其中一個為限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，用于使步驟S1222形成的第一連接產(chǎn)物的兩端在相應(yīng)的酶的作用下，形成粘性末端，且它們之間互補(bǔ)，能夠進(jìn)行自身環(huán)化。另一個為II s型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)，用于在步驟S1223中，利用識別該酶切位點(diǎn)的酶識別環(huán)化產(chǎn)物，進(jìn)行酶切， 進(jìn)而得到酶切產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)說明，以上兩個實(shí)施例僅為本發(fā)明中的兩種實(shí)現(xiàn)環(huán)化第一連接產(chǎn)物的實(shí)施方案，對于本發(fā)明的保護(hù)范圍不做任何具體的限制。在步驟S1223中，利用能夠識別第一接頭上的酶切識別位點(diǎn)，并切割環(huán)化產(chǎn)物 (DNA)但不切割第一接頭的酶進(jìn)行酶切。所述第一接頭上的酶切識別位點(diǎn)包括但不限于Mme I酶切識別位點(diǎn)、Acu I酶切識別位點(diǎn)、Bsg I酶切識別位點(diǎn)。在步驟S1224中，所述第二接頭可為平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，可帶有生物素標(biāo)記。所述第三接頭可為平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種。第二接頭與第三接頭可相同或不同。優(yōu)選的， 所述第二接頭和第三接頭相同，均為分叉接頭。更優(yōu)選的，所述分叉接頭為T末端分叉接頭或雙脫氧分叉接頭。需要特別說明的是，步驟S1222與S1223之間還可包括步驟S1222A 滾環(huán)擴(kuò)增環(huán)化產(chǎn)物，得滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過步驟S1222A，能夠保證后續(xù)的酶切步驟S1223有足夠的原材料。又或者，在步驟S1221與S1222之間還可包括步驟S1221A 利用擴(kuò)增引物對第一連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物。所述擴(kuò)增引物分別與第一連接產(chǎn)物兩端的接頭序列互補(bǔ)。 通過步驟S1221A，能夠保證后續(xù)的環(huán)化步驟有足夠的原材料。本方案可避免在步驟S1222之后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，而用步驟S1222之前的步驟 S1221A進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增代替，可有效減少后續(xù)酶切步驟中，II s型限制性內(nèi)切酶的用量。其中，所述第一接頭優(yōu)選為分叉接頭。其中，所述分叉接頭的互補(bǔ)區(qū)可包含至少一個酶切識別位點(diǎn)。所述酶切識別位點(diǎn)可為普通的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，也可為II S型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)。其中，步驟S1221A所述擴(kuò)增引物優(yōu)選為生物素化引物，有利于擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化。其中，步驟S1221A所述擴(kuò)增引物帶有至少一個特異性酶切識別位點(diǎn)。若擴(kuò)增引物上所帶的特異性酶切識別位點(diǎn)是尿嘧啶堿基，則步驟S1222中利用尿嘧啶特異性切除試劑進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行連接環(huán)化；若擴(kuò)增引物所帶特異性酶切識別位點(diǎn)為限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，則步驟S1222中利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行連接環(huán)化。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，如圖11所示，步驟S122具體可由以下步驟實(shí)現(xiàn)S1221’ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；S1222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；S1223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測序文庫。在步驟S1221’中，所述第四接頭可采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，所述第四接頭包含有II S型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)；當(dāng)所述第四接頭為分叉接頭時，該Π s型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)位于互補(bǔ)區(qū)；當(dāng)所述第四接頭為帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭時，限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離，較II s型限制性內(nèi)切酶酶切識別位點(diǎn)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)之間的距離近。若片段化產(chǎn)物經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，以及末端加A反應(yīng)，所述第四接頭優(yōu)選為帶T 末端的分叉接頭。若片段化產(chǎn)物只是經(jīng)過末端修復(fù)酶修復(fù)，將片段產(chǎn)物的末端補(bǔ)平，則所述第四接頭優(yōu)選雙脫氧接頭。在步驟S1222’中，利用能夠識別第四接頭上的酶切識別位點(diǎn)，并切割環(huán)化產(chǎn)物 (DNA)但不切割第四接頭的酶進(jìn)行酶切。所述第四接頭上的酶切識別位點(diǎn)包括但不限于Mme I酶切識別位點(diǎn)、Acu I酶切識別位點(diǎn)、Bsg I酶切識別位點(diǎn)。在步驟S1223’中，所述第五接頭可為平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的一種，可帶有生物素標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，步驟S122具體包括以下步驟S1221”.直接在片段化產(chǎn)物的兩端接上帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，形成帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的片段化產(chǎn)物；S1222”.利用限制性內(nèi)切酶，將帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的片段化產(chǎn)物的莖環(huán)區(qū)切開或切除，從而形成測序文庫。本技術(shù)方案利用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，防止了多個接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生。應(yīng)當(dāng)說明，以上實(shí)施例僅為步驟S122的其中幾種具體實(shí)施方案，并不用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，步驟S2所述的單分子擴(kuò)增是指對測序文庫中的每個分子進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增， 以提升各種分子在后續(xù)測序反應(yīng)中的信號。所述單分子擴(kuò)增的方法包括但不限于乳液 PCR(Emulsion PCR，EPCR)、橋式 PCR。所述EPCR將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。 理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板(測序文庫分子)和一個磁珠，磁珠上含有與測序文庫分子的共有序列(由接頭元件引入)互補(bǔ)的引物，在PCR反應(yīng)后，磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。EPCR具體步驟可參考文獻(xiàn)=BEAMing single-molecule PCR on microparticles in water—in—oil emulsions, Frank Diehl, Meng Li, Yiping He, nature methods, Vol. 3, No. 7,July 2006。所述橋式PCR的基本原理是，橋式PCR的引物被固定在固相載體上，PCR過程中 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物會被固定在固相載體上，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠與固相載體上的引物互補(bǔ)配對，成橋狀，然后互補(bǔ)配對的引物以與其成橋的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。通過控制初始模板加入的量，橋式PCR反應(yīng)完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物在固相載體上以一簇簇的形式存在，且每一簇的擴(kuò)增產(chǎn)物為同來源的DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。其具體的原理和實(shí)施方案可參考以下文獻(xiàn) CN20061009879. X、US6227604。如前所述，現(xiàn)有技術(shù)中，Sanger測序技術(shù)由于自身的技術(shù)限制，每次只能對一個樣品的某一段區(qū)域進(jìn)行測序。為了一次性實(shí)現(xiàn)對樣品中多個區(qū)域的同時檢測，本發(fā)明在測序方法上采取高通量基因測序方法。高通量基因測序相對Sanger測序法檢測序列信息更為方便靈敏，測序文庫中的各個分子經(jīng)過單分子擴(kuò)增后，每個測序文庫分子均形成單分子拷貝陣列，各單分子拷貝陣列在進(jìn)行高通量基因測序時處于不同的位置，使得測序引物與單分子拷貝陣列之間的雜交，以及在酶作用下的延伸反應(yīng)可同時進(jìn)行，相互之間互不干擾。因此，可以同時對大量的(成百萬上千萬，甚至更多的)單分子拷貝陣列同時進(jìn)行測序反應(yīng)， 然后通過采集相應(yīng)的信號，進(jìn)而準(zhǔn)確的獲得所需的序列信息，且測序的靈敏度較Sanger更高。尤其是對多個目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了片段化處理，相當(dāng)于對相同序列的目標(biāo)區(qū)域分子的每個堿基的測序次數(shù)增加了，能夠進(jìn)一步提高測序的靈敏度。其中，步驟S3所述高通量測序技術(shù)包括但不限于基于聚合酶的合成測序法和基于連接酶的連接測序法。
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合成測序法是基于帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的，在每次合成反應(yīng)中，每個模板鏈至多只能延伸一次。一種合成測序法的大致流程如下a.測序引物通過互補(bǔ)配對結(jié)合在單分子擴(kuò)增產(chǎn)物共有的已知序列上(該單分子擴(kuò)增產(chǎn)物固定在引物-固相載體復(fù)合物上)，在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集該次加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’ 最末端堿基互補(bǔ)的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物(固定在引物-固相載體復(fù)合物上)的下一位的堿基序列信息。b.切除可去除標(biāo)記，然后在DNA聚合酶的作用下，以帶可去除標(biāo)記的核苷酸繼續(xù)進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)，收集加入核苷酸的標(biāo)記信號，即可得到與測序引物3’末端堿基互補(bǔ)的單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的下兩位的堿基序列信息。重復(fù)b步驟，直至不能繼續(xù)進(jìn)行合成反應(yīng)為止，從而獲得單分子擴(kuò)增產(chǎn)物的全部序列信息。連接測序法是基于帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行的，該寡核苷酸探針帶有η 個堿基，分為h(h ^ η)組，同一組寡核苷酸探針的不同熒光標(biāo)記對應(yīng)同一特定位置的不同堿基序列，不同組之間的區(qū)別在于不同熒光標(biāo)記對應(yīng)的特定位置不同，因?yàn)樵摴押塑账崽结樀?’端進(jìn)行了特定的修飾，寡核苷酸探針之間不能直接相互連接，每次連接反應(yīng)，每個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物只能連接一個寡核苷酸探針。該連接測序法的的原理和具體實(shí)施方案可參考 CN200710170507. 1。此外，GSTMl和GSTTl基因都屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族，在體內(nèi)起分解代謝有毒有害物質(zhì)的作用。GSTMl或GSTTl基因缺失的個體較易受吸煙的影響，發(fā)生肺癌的危險性增加。因此，為了肺癌易感基因序列信息的進(jìn)一步準(zhǔn)確與全面，本發(fā)明給出另一種更為準(zhǔn)確和全面的檢測肺癌易感基因的方法流程，如圖12所示，該方法在圖1所示方法的基礎(chǔ)上增加了檢測GSTMl或GSTTl基因缺失的步驟，具體包含以下步驟Si，.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫；S2’.對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；S3’.同時對所述多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測序，得到所述多個目標(biāo)區(qū)域的序列信息，S4’.利用GSTMl及GSTTl的擴(kuò)增引物對待測樣品的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測GSTMl和GSTTl基因的缺失情況。步驟S4，與步驟S3，、S2，、Si，無先后關(guān)系。本技術(shù)方案通過檢測待測肺癌易感基因，確認(rèn)已知和未知突變位點(diǎn)，進(jìn)行基因分型，同時還進(jìn)行GSTMl和GSTTl基因的缺失情況檢測，能夠得到更加準(zhǔn)確而全面的易感基因序列信息。需要說明的是，在本技術(shù)方案中，步驟Si’至S3’可參見之前實(shí)施例中的步驟Sl 到S3，在此不作贅述。優(yōu)選的，步驟S4中所述GSTMl的擴(kuò)增引物包括SEQ ID Ν0:69和SEQ IDNO 70、SEQ ID NO 71和SEQ ID NO 72中的至少一對；所述GSTTl的擴(kuò)增引物為SEQ ID NO 73和SEQID NO :74。更進(jìn)一步的，步驟S4還包括對內(nèi)參基因目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增，所述內(nèi)參基因的特異性引物為 SEQ ID NO 75 和 SEQ ID NO :76。本發(fā)明提出的一個實(shí)施例中，同時檢測肺癌易感基因中的C0X-2、CYPlAU ERCC2、 GSTP1、TP53、XRCCl以及GSTMl、GSTTl等待測肺癌易感基因。針對C0X-2、CYPlAU ERCC2、GSTPU TP53、XRCCl的熱點(diǎn)突變區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的特異性引物C1F(SEQ ID NO :11)禾口 ClR(SEQ ID NO 12)、C2F(SEQ ID NO :13)禾口 C2R(SEQ ID NO :14)、ElF (SEQ ID NO :21) ^P ElR (SEQ ID NO :22)、GIF (SEQ ID NO :29) ^P GlR (SEQ ID NO :30)、TlF(SEQ ID NO :55) ^P TlR(SEQ ID NO :56)、XlF(SEQ ID NO :63) ^P XlR(SEQ ID NO :64)；同時設(shè)計檢測GSTM1、GSTTl基因缺失的特異性引物G2F(SEQ ID NO :69)禾口 G2R(SEQ ID NO :70)、G3F(SEQ ID NO :73)和 G3R(SEQID NO :74)，以及內(nèi)參基因的特異性引物 M1F(SEQ ID NO :75)和 M1R(SEQID NO :76)。一、待測樣品中DNA的提取利用市場上常見的核酸提取試劑盒分別提取全血樣品(1至10)、血清樣品(11至 20)、石蠟組織樣品(21至30)的DNA，并分別做上相應(yīng)的標(biāo)記。二、待測肺癌易感基因多個目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增利用上述待測易感基因的特異性引物，對肺癌易感基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。上述待測易感基因的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增分別進(jìn)行，反應(yīng)體系如下
0187]上游引物(10μ Μ)2μ L ；
0188]下游引物(10μ Μ)2μ L ；
0189]dNTP(各 2.5mM)4μ L ；
0190]待測樣品DNA20ng ；
0191]Ex Taq(5U/yL)0. 25 μ L ；
0192]IOXEx Taq Buffer5μ L ；
0193]ddH20 力口至 50μ L。
0194]PCR反應(yīng)條件如下
0195]95 °C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s，72°C 30s ；重復(fù) 25 個循環(huán)；72 °C 7min。利用PCR回收試劑盒，分別對各樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，除去未擴(kuò)增的引物和 dNTP，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。三、利用擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫根據(jù)之前所述，本步驟可由多種方式實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，采用在片段化產(chǎn)物兩端直接連上接頭元件的方法構(gòu)建測序文庫，具體包括1.擴(kuò)增產(chǎn)物的片段化本實(shí)施例中采用超聲破碎法進(jìn)行片段化處理，具體操作為測定回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，按等摩爾數(shù)將相同樣品的不同肺癌易感基因目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混合，得混合液，并標(biāo)記加以區(qū)別。將每個樣品的混合液50 μ L加入至400 μ L的TE buffer中，430W功率條件下超聲4s,間隔10s，反復(fù)5次，得到片段混合物。利用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離純化，選擇40-100bp 大小的片段切膠回收，得到片段化產(chǎn)物。2.利用片段化產(chǎn)物與接頭元件構(gòu)建測序文庫為便于進(jìn)行接頭元件的連接，對片段化產(chǎn)物進(jìn)行末端修飾。本實(shí)施例中，分別進(jìn)行磷酸化、末端補(bǔ)平及加A尾反應(yīng)，具體操作如下1)磷酸化以及末端補(bǔ)平反應(yīng)體系為片段化產(chǎn)物約2000ng ；IOmMdNTP1. 5μ L ；
T4DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L ；Klenow DNA 聚合酶0. 1 μ L ；Τ4 多核苷酸激酶(10U/yL)0. 5uL；IOm MATP1. 5μ L ；T4DNA 連接緩沖液IOyL;力口 ddH20 至 100 μ L。20°C孵育20min，反應(yīng)結(jié)束后利用回收試劑盒進(jìn)行純化回收。2)末端加A尾反應(yīng)體系為磷酸化以及末端補(bǔ)平后的回收產(chǎn)物Klenow 緩沖液(NEB Buffer2)IOmM dATPKlenow 酶(3，to 5，exo minus, IOU力口 ddH20 至 100μ L。37°C孵育30min，反應(yīng)結(jié)束后利用純化試劑盒純化回收。3)連接接頭1本實(shí)施例中采用如圖6所示T末端分叉接頭作為接頭1，同一樣品使用相同T末端分叉接頭，不同樣品對應(yīng)不同T末端分叉接頭，根據(jù)其上所帶第一標(biāo)簽序列進(jìn)行區(qū)分，不同樣品對應(yīng)的標(biāo)簽序列如下表1所示。表1.第一標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)表
約 IOOOng ；
權(quán)利要求
1.一種檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫；B.對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；C.同時對所述多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測序，得到所述多個目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述步驟A包括 Al.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；A2.利用接頭元件，與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到測序文庫；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述步驟A2包括以下步驟A21.對與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段化，得到片段化產(chǎn)物； A22.利用接頭元件，與所述片段化產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建測序文庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述步驟A22包括以下步驟A221.利用第一接頭與片段化產(chǎn)物的兩端連接，得第一連接產(chǎn)物； A222.環(huán)化第一連接產(chǎn)物，得環(huán)化產(chǎn)物； A223. II s型限制性內(nèi)切酶酶切環(huán)化產(chǎn)物，得酶切產(chǎn)物； A224.在酶切產(chǎn)物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測序文庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述步驟A22包括以下步驟Α22Γ .利用第四接頭與片段化產(chǎn)物連接，得第二連接產(chǎn)物；A222’ . II s型限制性內(nèi)切酶酶切第二連接產(chǎn)物，得帶有第四接頭的酶切片段；A223’ .帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測序文庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5任一項所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，步驟A2 所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫構(gòu)建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應(yīng)的標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，步驟A與每個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的特異性引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’ 端帶有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物做上相應(yīng)的標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述肺癌易感基因包括 APE1、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYP1A1、CYP2E1、ERCC1、ERCC2、 ERCC6、Exo1、GSTP1、Hmlh1、IL-1 β、MDM2、MPO、MTHFR、NQO1、OGG1、Ρ73、RASSF1、TERT、TGFB1、 TP53、TP63、XPC 和 XRCCl 中的至少一個。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肺癌易感基因的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟D.利用GSTMl及GSTTl的擴(kuò)增引物對待測樣品的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測 GSTMl和GSTTl基因的缺失情況；步驟D與步驟A、B、C無先后關(guān)系。
10.一種肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括肺癌易感基因特異性引物，用于對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；接頭元件，用于與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合構(gòu)建測序文庫。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭和分叉接頭中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標(biāo)簽序列，用于在文庫構(gòu)建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應(yīng)的標(biāo)記。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述待測肺癌易感基因有多個，與每個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的特異性引物中，至少有一條引物與目標(biāo)區(qū)域部分互補(bǔ)，且該引物的5’端帶有第二標(biāo)簽序列，用于在擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域過程中，對不同待測樣品的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物做上相應(yīng)的標(biāo)記。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項所述的肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于， 所述肺癌易感基因包括 APE1、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYPlAl、CYP2E1、ERCCl、 ERCC2、ERCC6,ExoUGSTPUHmlhU IL-I β ,MDM2、MPO、MTHFR、NQO1、OGG1、Ρ73、RASSF1、TERT、 TGFBl、ΤΡ53、ΤΡ63、XPC 和 XRCCl 中的至少一個。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的肺癌易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述肺癌易感基因還包括GSTMl、GSTTl中的至少一個。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，提供一種檢測肺癌易感基因的方法及相應(yīng)的試劑盒。所述檢測肺癌易感基因的方法包括以下步驟A.利用肺癌易感基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并基于擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫；B.對測序文庫進(jìn)行單分子擴(kuò)增，得到與所述多個目標(biāo)區(qū)域?qū)?yīng)的多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物；C.同時對所述多個單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量基因測序，得到所述多個目標(biāo)區(qū)域的序列信息。該方法及其相應(yīng)的試劑盒利用高通量測序技術(shù)對肺癌易感基因的多個區(qū)域同時進(jìn)行區(qū)域測序，能準(zhǔn)確得出這些區(qū)域的序列信息，包括已知突變和未知突變位點(diǎn)的變異情況，檢測靈敏度高，并能進(jìn)一步同時對大量樣品進(jìn)行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102373287SQ20111039196
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼