專利名稱：一種多肽——人蛋白激酶38和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——蛋白激酶38，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自真核生物中鑒別的一類最大的已知蛋白超家族由蛋白激酶組成(這兒使用超家族以區(qū)別于較小 較為密切相關(guān)通常已被歸為一個家族的亞型)，該家族成員都有一段保守的催化核心，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的保守催化核心相同。這些酶利用ATP(或GTP)的γ-磷酸酯以生成磷酸單酯，并把蛋白(絲氨酸及蘇氨酸上)的乙醇基團(tuán)與/或蛋白(酪氨酸上)的酚基作為磷酸酯受體。真核生物蛋白激酶可分為四大類1)ACG類，包括環(huán)核苷酸依賴家族(PKA與PKG)，蛋白激酶C(PKC)家族，β-腎上腺素能受體激酶(βARK)家族，核糖體S6激酶家族及其他密切相關(guān)的；2)CaMK類，包括由鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)控的蛋白激酶家族，Snfl/AMPK家族，及其他密切相關(guān)的；3)CMGC類，包括細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，Erk(MAP)激酶家族，糖原合成酶3(GSK3)家族，酪蛋白激酶II家族，Clk(類似Cdk的激酶)家族，及其他密切相關(guān)的；4)‘保守的’蛋白酪氨酸激酶(PTK)類。該超家族又可分為兩個主要的亞門蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。
真核生物蛋白激酶的激酶功能域傳遞催化活性。蛋白激酶因其同源激酶功能域(亦被稱為催化功能域)而相關(guān)，該區(qū)域有250-300個氨基酸殘基。激酶功能域的作用可分為三類1)結(jié)合并定向作為具有二價陽離子(通常是Mg2+或Mn2+)復(fù)合物的ATP(或GTP)磷酸酯供體；2)結(jié)合并定向蛋白(或肽)底物；以及3)轉(zhuǎn)移ATP(或GTP)的γ-磷酸酯至蛋白底物的受體羥基殘基(絲氨酸，蘇氨酸，或酪氨酸)。激酶功能域被進(jìn)一步分為12個更小的亞功能域，并定義為從未被大的氨基酸插入打斷并含有保守殘基特征序列模式的區(qū)域。有十二個功能域殘基因在超家族中被視為是恒定不變的，而明顯意味其在酶功能中具有重要作用，它們是亞功能域I中的甘氨酸50及甘氨酸52，亞功能域II中的賴氨酸72，亞功能域III中的谷氨酸91，亞功能域VIB中的天冬酰胺171及天冬氨酸166，亞功能域VII中的天冬氨酸184及甘氨酸186，亞功能域VIII中的谷氨酸208，亞功能域IX中的天冬氨酸220及甘氨酸225，亞功能域XI中的精氨酸280。在亞功能域VIB，VIH，及IX中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基特征序列模式在不同蛋白激酶家族的各成員中尤為高度保守。激酶功能域的同源性意味著它們都折疊成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似的3維核心結(jié)構(gòu)并根據(jù)一個普遍的機(jī)制傳遞磷酸轉(zhuǎn)移。
蛋白激酶催化核心結(jié)構(gòu)的一般拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以PKA-Cα類蛋白激酶為代表。PKA-Cα類蛋白激酶的激酶功能域折疊成兩部分結(jié)構(gòu)。較小的一部分，NH2-端部分，含有亞結(jié)構(gòu)域I-IV，主要參與核苷酸固定兼定向。這一部分具有顯著反向平行的β-片層結(jié)構(gòu)，這在核苷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)中是較為獨特的。較大的COOH-端部分，含有亞結(jié)構(gòu)域VIA-XI，主要對結(jié)合肽底物及啟動磷酸轉(zhuǎn)移起作用，其內(nèi)含物是顯著的α-螺旋。亞結(jié)構(gòu)域V殘基有兩片。兩片中間較深的裂縫作為催化位點被識別。另外四種真核蛋白激酶超家族成員-細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶2(Cdk2)，p42MAP激酶(Erk2)，顫動激酶，以及酪蛋白激酶I的激酶功能域被發(fā)現(xiàn)折疊成兩部分結(jié)構(gòu)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上與PKA-Cα催化核心極為相似。然而，在Cdk2及Erk2結(jié)構(gòu)中的亞結(jié)構(gòu)域VIII對應(yīng)的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了顯著差異，說明這些是非活性狀態(tài)的酶結(jié)構(gòu)。顫動結(jié)構(gòu)也屬于非活性酶，但它是因位于激酶功能域的COOH-端側(cè)的自身抑制肽序列的存在而失活，并向背面折疊到兩片之間的活性位點的裂縫中去。這條肽鏈迫使兩個片層幾乎朝對方旋轉(zhuǎn)30°，在這一構(gòu)像中，失活的顫動與無PKI的PKA-Cα的開放構(gòu)像更為相似。在顫動及Cdk2中亞功能域III中的α-螺旋C均采用一種不同于PKA-Cα中螺旋C的位置。
本模板是從蛋白激酶的催化區(qū)域的十二個亞功能域中選擇了兩段構(gòu)建特征序列模式，第一個區(qū)域位于催化域的N-端，亞功能域I，是一段富含甘氨酸的序列，在涉及ATP結(jié)合的賴氨酸殘基附近。它含有一共有序列的基序Gly-x-Gly-x-x-Gly-x-Val，激酶功能域NH2-端結(jié)合位點在基序中第一個甘氨酸上游的第七個位置，該位置上通?？烧业绞杷詺埢?。亞功能域I殘基折疊成β-鏈-轉(zhuǎn)角-β-鏈結(jié)構(gòu)圍繞β-鏈1與2，這一結(jié)構(gòu)作為可彎曲的片層或夾子覆蓋并定位ATP不可轉(zhuǎn)移的磷酸酯而作用。絲氨酸53，苯丙氨酸54，以及甘氨酸55的主鏈酰胺與ATPβ-磷酸氧形成氫鍵。亮氨酸49及纈氨酸57形成疏水袋，它把ATP的腺嘌呤環(huán)圍住。第二個區(qū)域位于催化域的中心，含有一保守的天冬氨酸殘基，對于酶的催化活性極為重要，即亞功能域VI。亞功能域VIA折疊成大的疏水性α-螺旋E，延伸穿過功能域兩部分中大的部分。螺旋E中沒有殘基直接與MgATP或肽底物作用；因而這部分分子主要作為支撐結(jié)構(gòu)來作用。亞功能域VIB折疊成帶間插環(huán)的小的疏水性β-鏈6與7。其中包括兩個不變的殘基(在PKA-Cα中為天冬氨酸166及天冬酰胺171)，它們位于相同的基序組氨酸-精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-賴氨酸-X-X-天冬酰胺之中(HRDLKxxN)。間插環(huán)被認(rèn)為是催化環(huán)，因為環(huán)中的天冬氨酸166作為催化基質(zhì)出現(xiàn)，接受磷酸轉(zhuǎn)移機(jī)制過程中底物的羥基基團(tuán)中的質(zhì)子。環(huán)中的賴氨酸168(在保守的蛋白酪氨酸激酶中由精氨酸取代)可能有助于通過中合轉(zhuǎn)移過程中的γ-磷酸酯負(fù)離子便于磷酸轉(zhuǎn)移。天冬酰胺171的側(cè)鏈通過與天冬氨酸的主鏈羰基形成氫鍵有助于穩(wěn)固催化環(huán)，它還螯合橋連ATP的α-及γ-磷酸酯的次級Mg2+離子。谷氨酸170的羰基與一個ATP核糖體羥基基團(tuán)形成氫鍵。谷氨酸170還通過與肽識別共有序列的第二個精氨酸形成離子對而參與結(jié)合底物。
由于如上所述蛋白激酶38蛋白在機(jī)體重要功能中起重要作用，而且相信這些調(diào)節(jié)過程中涉及大量的蛋白，因而本領(lǐng)域中一直需要鑒定更多參與這些過程的蛋白激酶38蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新蛋白激酶38蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎(chǔ)。這種蛋白可能構(gòu)成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥的基礎(chǔ)，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——人蛋白激酶38以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人蛋白激酶38的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人蛋白激酶38的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)人蛋白激酶38的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽——人蛋白激酶38的抗體。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收表達(dá)產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還涉及一種篩選的模擬、激活、拮抗或抑制人蛋白激酶38蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的化合物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明提供了一種多肽——人蛋白激酶38，其基本上是由<210>2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人蛋白激酶38的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的人蛋白激酶38相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括<210>1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與<210>1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有<210>2的蛋白質(zhì)或多肽，但與<210>1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與<210>2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人蛋白激酶38的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼人蛋白激酶38的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定人蛋白激酶38的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性，來檢測基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人蛋白激酶38基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進(jìn)行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人蛋白激酶38編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人蛋白激酶38的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動子的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起始點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼人蛋白激酶38的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中，編碼人蛋白激酶38的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的人蛋白激酶38(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人人蛋白激酶38的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、腎上腺缺乏癥、皮膚病、各類炎癥、HIV感染和免疫性疾病等。
真核生物中由蛋白激酶組成一類最大的已知蛋白超家族，該家族成員都有一段保守的催化核心，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的保守催化核心相同。該超家族又可分為兩個主要的亞門蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。本模板是從蛋白激酶的催化區(qū)域的十二個亞功能域中選擇了兩段構(gòu)建特征序列模式，第一個區(qū)域位于催化域的N-端，亞功能域I，是一段富含甘氨酸的序列，在涉及ATP結(jié)合的賴氨酸殘基附近。第二個區(qū)域位于催化域的中心，含有一保守的天冬氨酸殘基，對于酶的催化活性極為重要，即亞功能域VI。
由于胰島素受體、類胰島素生長因子受體、肝細(xì)胞生長因子受體、神經(jīng)生長因子受體、巨嗜細(xì)胞集落刺激因子受體、表皮生長因子受體、血小板生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子受體均屬酪氨酸蛋白激酶活性的受體，具有極重要的生理功能。絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的TGF-β效應(yīng)是通過抑制其它生長因子的效應(yīng)來抑制細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成、刺激骨髓形成、胚胎發(fā)育、趨化反應(yīng)等。
由此可見，本發(fā)明的蛋白激酶3 8的表達(dá)異常將產(chǎn)生各種疾病尤其是內(nèi)分泌疾病、胚胎發(fā)育紊亂、免疫系統(tǒng)疾病、各種腫瘤等，這些疾病包括但不限于內(nèi)分泌疾病尿崩癥，性早熟癥，巨人癥和肢端肥大癥，催乳素過高血癥(溢乳-閉經(jīng)綜合癥)，垂體性綜合征，成人垂體機(jī)能減退癥(Simmonds-Sheehan綜合癥)，垂體性侏儒癥，垂體瘤(泌乳素瘤)，單純性甲狀腺腫，甲狀腺炎，甲狀腺功能亢進(jìn)癥，甲狀腺功能減退癥，甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥，甲狀旁腺機(jī)能減退癥，腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)癥如皮質(zhì)醇增多癥(Cushing)、原發(fā)性醛固酮增多癥，腎上腺皮質(zhì)功能減退癥如急性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥，腎上腺腫瘤，糖尿病，胰島素瘤，胃泌素瘤，卵巢病經(jīng)前期緊張癥，經(jīng)絕期綜合征，卵巢發(fā)育不全，閉經(jīng)，男性性腺功能減退癥，男性性早熟胚胎發(fā)育紊亂腭裂、面斜裂、頸囊、頸瘺、肢體缺如、肢體分化障礙、消化管閉鎖或狹窄、回腸憩室、臍瘺、先天性臍疝、先天性無神經(jīng)節(jié)性巨結(jié)腸、喉氣管狹窄或閉鎖、氣管食管瘺、透明膜病、先天性肺囊腫、肺膨脹不全、多囊腎、異位腎、馬碲腎、雙輸尿管、臍尿瘺、隱、先天性腹股溝疝、雙子宮、陰道閉鎖、尿道下裂、兩性畸形、房間隔缺損、室間隔缺損、動脈干分隔異常、主動脈或肺動脈狹窄、肺動脈狹窄、動脈導(dǎo)管未閉、神經(jīng)管缺陷、先天性腦積水、虹膜缺損、先天性白內(nèi)障、先天性青光眼或白內(nèi)障免疫系統(tǒng)疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性活動性肝炎、急性前葡萄膜炎、淋球菌感染后關(guān)節(jié)炎、免疫復(fù)合物型腎小球腎炎、淋球菌感染后心肌炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、多發(fā)性肌炎、重癥肌無力、格林-巴利綜合癥、自身免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性間質(zhì)性腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性甲狀腺疾病、吞噬細(xì)胞缺乏的免疫缺陷病、補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷病，Down綜合癥，再生障礙性貧血，獲得性免疫缺陷綜合癥，支氣管哮喘、阿斯匹林哮喘、變應(yīng)性鼻炎、過敏性支氣管肺曲霉菌病、過敏性肺炎、彌漫性肺間質(zhì)纖維化、結(jié)節(jié)病、蕁麻疹、特異性皮炎各種腫瘤胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、甲狀腺腫瘤、子宮肌瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、室管膜瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、惡性組織細(xì)胞病、黑色素瘤、畸胎瘤、肉瘤、腎上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、骨髓瘤、骨髓癌、腦癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、膽囊癌、結(jié)腸癌、胸腺腫瘤鼻腔及鼻竇腫瘤、鼻咽癌、喉癌、氣管腫瘤、胸膜間皮瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤本發(fā)明的蛋白激酶38的表達(dá)異常還將產(chǎn)生某些遺傳性，血液性疾病等。本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療各種疾病尤其是內(nèi)分泌疾病、胚胎發(fā)育紊亂、免疫系統(tǒng)疾病、各種腫瘤，某些遺傳性，血液性疾病等。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人蛋白激酶38的藥劑的方法。激動劑提高人蛋白激酶38刺激細(xì)胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細(xì)胞過度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細(xì)胞或表達(dá)人蛋白激酶38的膜制劑與標(biāo)記的人蛋白激酶38一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人蛋白激酶38的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人蛋白激酶38的拮抗劑可以與人蛋白激酶38結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人蛋白激酶38加入生物分析測定中，通過測定化合物對人蛋白激酶38和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人蛋白激酶38結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，一般應(yīng)對人蛋白激酶38分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對人蛋白激酶38抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人蛋白激酶38直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人蛋白激酶38的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison etal，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人蛋白激酶38的單鏈抗體。
抗人蛋白激酶38的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人蛋白激酶38。
與人蛋白激酶38結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人蛋白激酶38高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人蛋白激酶38陽性的細(xì)胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人蛋白激酶38相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人蛋白激酶38的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人蛋白激酶38水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人蛋白激酶38水平，可以用作解釋人蛋白激酶38在各種疾病中的重要性和用于診斷人蛋白激酶38起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進(jìn)行質(zhì)譜分析。
編碼人蛋白激酶38的多核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于人蛋白激酶38的無表達(dá)或異常/無活性表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計用于表達(dá)變異的人蛋白激酶38，以抑制內(nèi)源性的人蛋白激酶38活性。例如，一種變異的人蛋白激酶38可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的人蛋白激酶38，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人蛋白激酶38表達(dá)或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將編碼人蛋白激酶38的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶編碼人蛋白激酶38的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組編碼人蛋白激酶38的多核苷酸可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
抑制人蛋白激酶38mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人蛋白激酶38的多核苷酸可用于與人蛋白激酶38的相關(guān)疾病的診斷。編碼人蛋白激酶38的多核苷酸可用于檢測人蛋白激酶38的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下人蛋白激酶38的異常表達(dá)。如編碼人蛋白激酶38的DNA序列可用于對活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷人蛋白激酶38的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用人蛋白激酶38特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測人蛋白激酶38的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測人蛋白激酶38基因的突變也可用于診斷人蛋白激酶38相關(guān)的疾病。人蛋白激酶38突變的形式包括與正常野生型人蛋白激酶38 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點?，F(xiàn)在，只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記物可用于標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合細(xì)胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進(jìn)行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應(yīng)于一個基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人蛋白激酶38以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的人蛋白激酶38的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明蛋白激酶38在140-200共60個氨基酸和結(jié)構(gòu)域蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是蛋白激酶38，下方序列是結(jié)構(gòu)域蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人蛋白激酶38的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。38kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人蛋白激酶38的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆0498F06的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測定。結(jié)果表明，0498F06克隆所含的全長cDNA為2215bp(如<210>1所示)，從第288bp至1313bp有一個1026bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如<210>2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0498F06，編碼的蛋白質(zhì)命名為人蛋白激酶38。
實施例2cDNA克隆的結(jié)構(gòu)域分析將本發(fā)明的蛋白激酶38的序列及其編碼的蛋白序列，用GCG中的profile scan程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在prosite等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。本發(fā)明的蛋白激酶38在140-200與結(jié)構(gòu)域蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶有同源，同源結(jié)果示于圖1，同源率為21％，得分為12.67；閾值為10.30。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼人蛋白激酶38的基因用胎腦細(xì)胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer15’-GGCAGCGGAGGCGCGAGCTGCCCG-3’Primer25’-CAGAATAATCCTGTATTCAGATTT-3’Primer1為位于<210>1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為<210>1的中的3’端反向序列。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個周期94℃30sec；55℃30sec；72℃2min。在RT-PCR時同時設(shè)β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與<210>1所示的1-2215bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析人蛋白激酶38基因的表達(dá)
用一步法提取總RNA[Ana1.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進(jìn)行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32p dATP通過隨機(jī)引物法制備32P-標(biāo)記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴(kuò)增的人蛋白激酶38編碼區(qū)序列(14bp至970bp)。將32P-標(biāo)記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進(jìn)行分析和定量。
實施例5重組人蛋白激酶38的體外表達(dá)、分離和純化根據(jù)<210>1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計出一對特異性擴(kuò)增引物，序列如下Primer35’-CATGCTAGCATGGTGAGTAGCCAGCCAAAGTACG-3’Primer45’-CATGGATCCTCACGTTTCCCAGCTGCTATCTTTA-3’此兩段引物的5’端分別含有NheI和BamHI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NheI和BamHI酶切位點相應(yīng)于表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0498F06質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-0498F06質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25個循環(huán)。用NheI和BamHI分別對擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0498F06)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0498F06)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進(jìn)行層析，得到了純化的目的蛋白人蛋白激酶38。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在38kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與<210>2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6抗人蛋白激酶38抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述人蛋白激酶38特異性的多肽NH2-Met-Val-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Tyr-Asp-Leu-Ile-Arg-Glu-Val-Gly-COOH將該多肽分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔；15天后再用血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于澳化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人蛋白激酶38結(jié)合。
序列表<110>上海博德基因開發(fā)有限公司<120>一種新的多肽-人蛋白激酶38和編碼這種多肽的多核苷酸<130>0498F06<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2215<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(288)..(1313)<223>
<400>1ggcagcggag gcgcgagctg cccgataatg gcggcctgca gagcccatga gagggagaag 60cggcagcgtc taccctgagg aaggtgctct tccccatggg gactgtacca ggctggagag120gacatggcac tgcttcagag acacgaacca ccttgagtgg atgtgattgg cgatccccgt180agagcaggaa agctcgtctg ctgtgcagcc ggcgcagagg attctgtggc aggaaattag240acactaggaa attcagtagc gatttgaagg aaacctcgac cttgaag atg gtg agt 296Met Val Ser1agc cag cca aag tac gat cta ata cgg gag gta ggc cga ggt agt tac 344Ser Gln Pro Lys Tyr Asp Leu Ile Arg Glu Val Gly Arg Gly Ser Tyr5 10 15ggt gtt gtg tat gaa gca gtc atc aga aag acc tct gca cgg gtg gca 392Gly Val Val Tyr Glu Ala Val Ile Arg Lys Thr Ser Ala Arg Val Ala20 25 30 35gtg aag aaa att cga tgt cac gca cct gaa aat gtt gaa cta gcc ctt440Val Lys Lys Ile Arg Cys His Ala Pro Glu Asn Val Glu Leu Ala Leu40 45 50
cgt gag ttc tgg gca cta agc agt atc aag agc caa cat cca aat gtg 488Arg Glu Phe Trp Ala Leu Ser Ser Ile Lys Ser Gln His Pro Asn Val55 60 65att cac ttg gag gaa tgc atc cta caa aag gat ggg atg gtg caa aag 536Ile His Leu Glu Glu Cys Ile Leu Gln Lys Asp Gly Met Val Gln Lys70 75 80atg tcc cac ggc tct aat tct tcc ctt tat tta cag ctt gta gaa act 584Met Ser His Gly Ser Asn Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Leu Val Glu Thr85 90 95tca tta aaa gga gaa att gcc ttt gat ccc aga agc gcc tat tat ttg 632Set Leu Lys Gly Glu Ile Ala Phe Asp Pro Arg Ser Ala Tyr Tyr Leu100 105 110 115tgg ttt gtg atg gat ttt tgt gac gga gga gat atg aat gag tat ctg 680Trp Phe Val Met Asp Phe Cys Asp Gly Gly Asp Met Asn Glu Tyr Leu120 125 130ttg tcc agg aaa ccc aat cgt aaa act aac acc agc ttc atg ctt cag 728Leu Ser Arg Lys Pro Asn Arg Lys Thr Asn Thr Ser Phe Met Leu Gln135 140 145ctg agc agt gcc ctg gct ttc ttg cat aaa aac cag atc atc cac cga 776Leu Ser Ser Ala Leu Ala Phe Leu His Lys ASn Gln Ile Ile His Arg150 155 160gat ctt aag cct gat aac atc ctg att tct caa acc agg ttg gat acc 824Asp Leu Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Ser Gln Thr Arg Leu Asp Thr165 170 175agt gac ttg gaa cct acc ctc aaa gtg gct gat ttt ggt cta agt aaa 872Ser Asp Leu Glu Pro Thr Leu Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys180 185 190 195gtt tgt tca gcc tct ggg cag aac cca gaa gaa cct gtc agt gta aac 920Val Cys Ser Ala Ser Gly Gln Asn Pro Glu Glu Pro Val Ser Val Asn200 205 210aag tgt ttc ctt tcc aca gca tgt gga aca gat ttt tac atg gct cct 968Lys Cys Phe Leu Ser Thr Ala Cys Gly Thr Asp Phe Tyr Met Ala Pro
215 220 225gaa gtt tgg gaa gga cat tac aca gca aaa get gac atc ttt gct ctg 1016Glu Val Trp Glu Gly His Tyr Thr Ala Lys Ala Asp Ile Phe Ala Leu230 235 240ggg att atc atc tgg gca atg ctg gaa agg atc aca tte ata gac aca 1064Gly Ile Ile Ile Trp Ala Met Leu Glu Arg Ile Thr Phe Ile Asp Thr245 250 255gag aca aag aag gaa ctc ttg ggg agt tat gta aaa caa gga act gag 1112Glu Thr Lys Lys Glu Leu Leu Gly Ser Tyr Val Lys Gln Gly Thr Glu260 265 270 275att gtg cct gtt ggg gag gca ctt ctg gaa aat ccc aaa atg gaa ctt 1160Ile Val Pro Val Gly Glu Ala Leu Leu Glu Ash Pro Lys Met Glu Leu280 285 290ctc att cct gtg aag aaa aaa tct atg aat ggg cga atg aaa caa ctg 1208Leu Ile Pro Val Lys Lys Lys Ser Met Asn Gly Arg Met Lys Gln Leu295 300 305att aag gaa atg ctg gct gca aac cct cag gat cgt cca gat gct ttt 1256Ile Lys Glu Met Leu Ala Ala Asn Pro Gln Asp Arg Pro Asp Ala Phe310 315 320gaa cta gaa ctc aga tta gta caa att gca ttt aaa gat agc agc tgg 1304Glu Leu Glu Leu Arg Leu Val Gln Ile Ala Phe Lys Asp Ser Ser Trp325 330 335gaa acg tga cacatattat ttgcaaatac catggatgat atgctgcttc 1353Glu Thr340tgtttaacag tgatgcaaca ttatgtggct gaaaaagaat ataaaaagct agactctacc 1413ctctaagggt ttagattttt tgtgggattt ttttttttcc tcatttttct taaatccaag 1473ttggccgttt tattagtatg tttcaaatgt gtattaccaa tgtgggtgta aatttttaaa 1533aaatgattat tgatagaagt ttggcaggaa aattctttaa gagctaacaa gagaagagag 1593tccagttttc tggaaatatg tctttaagta ttttagacat tcctcgtcag tattaggaat 1653ttccatggga aaagaggttt gcatgctggt aatgcaacct ttgaaacttt gtaaaggaaa 1713catatatgta tatatttatg tatatgtaag tatgtgaatg tgcgcatttt gcattccata 1773
tgaaaaaaat gccacgtctg tttaaattat ttgatgtagg tttgggtttt tgagatttgc 1833tggtgaagtc agtgacgaaa aataaacctt cccttatctt cctactctgc ccctccccct 1893aatgaaatca tattaagttg tttttttttt tttttgtaat atacagcttt ttttttaagg 1953catcattttc gagggtctaa aattatctgg taaaacaaat gaaattaagt gatccaaagc 2013tgctgaagta tgtttgaact ctccagtgcc ctatagctgc gagagttgaa ttagtcatgc 2073agtcatatgg cagcaggttg gtgattcagt ccgaccttct ttaggtaacc gagcatttat 2133ttaaccaact ataccactgc attgggacgt ctgcacttga gcttctacaa tctgatataa 2193atctgaatac aggattattc tg2215<210>2<211>341<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Val Ser Ser Gln Pro Lys Tyr Asp Leu Ile Arg Glu Val Gly Arg1 5 10 15Gly Ser Tyr Gly Val Val Tyr Glu Ala Val Ile Arg Lys Thr Ser Ala20 25 30Arg Val Ala Val Lys Lys Ile Arg Cys His Ala Pro Glu Asn Val Glu35 40 45Leu Ala Leu Arg Glu Phe Trp Ala Leu Ser Ser Ile Lys Ser Gln His50 55 60Pro Asn Val Ile His Leu Glu Glu Cys Ile Leu Gln Lys Asp Gly Met65 70 75 80Val Gln Lys Met Ser His Gly Ser Ash Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Leu85 90 95Val Glu Thr Ser Leu Lys Gly Glu Ile Ala Phe Asp Pro Arg Ser Ala100 105 110Tyr Tyr Leu Trp Phe Val Met Asp Phe Cys Asp Gly Gly Asp Met Asn115 120 125Glu Tyr Leu Leu Ser Arg Lys Pro Asn Arg Lys Thr Asn Thr Ser Phe130 135 140Met Leu Gln Leu Ser Ser Ala Leu Ala Phe Leu His Lys Asn Gln Ile
145 150 155 160Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Ser Gln Thr Arg165 170 175Leu Asp Thr Ser Asp Leu Glu Pro Thr Leu Lys Val Ala Asp Phe Gly180 185 190Leu Ser Lys Val Cys Ser Ala Ser Gly Gln Asn Pro Glu Glu Pro Val195 200 205Ser Val Asn Lys Cys Phe Leu Ser Thr Ala Cys Gly Thr Asp Phe Tyr210 215 220Met Ala Pro Glu Val Trp Glu Gly His Tyr Thr Ala Lys Ala Asp Ile225 230 235 240Phe Ala Leu Gly Ile Ile Ile Trp Ala Met Leu Glu Arg Ile Thr Phe245 250 255Ile Asp Thr Glu Thr Lys Lys Glu Leu Leu Gly Ser Tyr Val Lys Gln260 265 270Gly Thr Glu Ile Val Pro Val Gly Glu Ala Leu Leu Glu Asn Pro Lys275 280 285Met Glu Leu Leu Ile Pro Val Lys Lys Lys Ser Met Asn Gly Arg Met290 295 300Lys Gln Leu Ile Lys Glu Met Leu Ala Ala Asn Pro Gln Asp Arg Pro305 310 315 320Asp Ala Phe Glu Leu Glu Leu Arg Leu Val Gln Ile Ala Phe Lys Asp325 330 335Ser Ser Trp Glu Thr340
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽-人蛋白激酶38，其特征在于它包含有<210>2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與<210>2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有<210>2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有<210>1中288-1313位的序列或<210>1中1-2215位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；或(b)用權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.一種具有人蛋白激酶38活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達(dá)人蛋白激酶38條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人蛋白激酶38活性的多肽。
10.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人蛋白激酶38特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的多肽——人蛋白激酶38，編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法，如惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類炎癥等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的蛋白激酶38的多核苷酸的用途。
文檔編號C12P21/02GK1510133SQ0215776
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發(fā)有限公司