專利名稱：一種用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系的制備方法。
背景技術(shù)：
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))作為分子生物學(xué)里程碑式的技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科。與此同時(shí)，由于新的目的與要求，這項(xiàng)傳統(tǒng)的技術(shù)也在日新月異的發(fā)展之中。在高通量測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，已經(jīng)出現(xiàn)乳液PCR(emulsion PCR, ePCR)技術(shù)，通過各自獨(dú)立的油包水液滴反應(yīng)空間，能夠在大規(guī)模擴(kuò)增基因的同時(shí)，保持?jǐn)U增產(chǎn)物的各自分離，而進(jìn)行ePCR反應(yīng)的關(guān)鍵在于乳濁液體系的制備。隨著高通量測(cè)序中對(duì)通量的要求越來越高， 對(duì)測(cè)序片段的長度也要求越來越高。目前乳濁液體系的制備出現(xiàn)由于液滴數(shù)量較少、體積過小而制約擴(kuò)增片段的擴(kuò)增長度的問題，這嚴(yán)重限制高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。針對(duì)上述缺陷，急需一種能夠用于擴(kuò)增長片段且含有更多液滴數(shù)量的乳濁液體系制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于擴(kuò)增長片段并且含有更多液滴數(shù)量的乳濁液體系制備的技術(shù)方法，旨在解決乳濁液體系中擴(kuò)增長度短、液滴數(shù)量少和/或體積小的問題。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法步驟如下所示A.制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的固相載體的水相體系；B.制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系；C.將水相與油相體系混合，制備乳濁液體系；其中，步驟A和步驟B無先后順序。其中，步驟A中包括Al.將目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的引物連接到固相載體，得到帶引物的固相載體；A2.將其他擴(kuò)增體系試劑與帶引物的固相載體混合，制備水相體系。其中，上述固相載體可以選用微珠或者磁球，其表面可以采用聚丙烯酰胺修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；相應(yīng)的，結(jié)合的引物則采用丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。其中，上述水相體系，包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的固相載體，包含擴(kuò)增反應(yīng)所必需的其他試劑，同時(shí)還加入能加快擴(kuò)增反應(yīng)啟動(dòng)的一對(duì)小引物。其中，上述步驟B中選擇用于制備油相體系的各種油脂在熱穩(wěn)定性以及密度上具有一定的要求，它們按照一定比例混合之后要使得形成的油相體系的熱穩(wěn)定性可以保證制備出來的乳濁液體系在反應(yīng)過程中不會(huì)破裂，而且它們的混合密度要能使之后放入的輔助微固體材料如鋼珠等可以在其中自由移動(dòng)，具體的油相組成將會(huì)在實(shí)施例中給出。其中，所述步驟C包括Cl.將水相加入到油相體系中混合，得到水油混合體系；C2.水油混合體系中加入輔助微固體，得到乳濁液混合物；C3.將乳濁液混合物放置于乳濁液制備儀上，振蕩打勻形成乳濁液體系。其中，上述步驟Cl中水、油兩相的混合順序可以調(diào)整，采取不同的方式。其中，上述步驟C2中輔助微固體可以采用鋼珠、玻璃珠或塑料珠的至少一種。其中，上述步驟C3中利用乳濁液制備儀制備乳濁液的條件根據(jù)待測(cè)模板長度和固相載體的大小變化，可以選擇不同的振蕩頻率。其中，上述步驟C之后還可包括步驟D.利用制備的乳濁液體系進(jìn)行ePCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中，根據(jù)連接在固相表面的引物的不同，可以進(jìn)行不同的PCR擴(kuò)增反應(yīng)若只固定了一條引物，則可以進(jìn)行單引物擴(kuò)增反應(yīng)；若分別固定了上、下游兩端引物，則可以進(jìn)行雙引物擴(kuò)增反應(yīng)，由此可以進(jìn)一步延長擴(kuò)增片段的長度。由上可知，本發(fā)明通過控制水油兩相體系的混合比例以及制備時(shí)的振蕩頻率和時(shí)間，對(duì)乳濁液的制備進(jìn)行控制，使其能夠得到更多的液滴數(shù)量，同時(shí)在保證穩(wěn)定的前提下， 增大液滴的體積，使其能夠應(yīng)用于更長片段的擴(kuò)增反應(yīng)體系中。


圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的固相載體的水相體系的方法流程圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中水油兩相混合制備乳濁液體系的方法流程圖。圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于制備好的擴(kuò)增長片段的乳濁液體系進(jìn)行橋式 ePCR擴(kuò)增反應(yīng)的方法流程圖。圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于制備好的擴(kuò)增長片段的乳濁液體系進(jìn)行橋式 ePCR擴(kuò)增反應(yīng)的示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備的方法流程圖。該方法包括步驟SlOl中，制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的微珠在內(nèi)的PCR mix水相體系。本步驟將在后續(xù)圖示中做詳細(xì)闡述，在此不再贅述。步驟S102中，制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系。制備油相體系的過程中， 對(duì)于油脂的要求是熱穩(wěn)定性好、密度低。其中，步驟SlOl與S102的順序可以互換，也可以同時(shí)進(jìn)行。步驟S103中，將水相與油相體系混合，制備乳濁液體系。輔助微固體材料優(yōu)選鋼珠，水相體系注入到油相體系，放置于乳濁液制備儀上振蕩混勻。圖2示出了步驟SlOl制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的微珠在內(nèi)的PCR mix 水相體系的方法流程。其中包括步驟SlOll中，首先對(duì)微珠表面和引物分別進(jìn)行相應(yīng)的修飾，修飾后的微珠與引物結(jié)合得到帶引物的微珠。微珠表面可以采用聚丙烯酰胺修飾、醛基修飾或鏈霉親和素修飾；相應(yīng)的，所要結(jié)合的引物可以進(jìn)行丙烯酰胺修飾、氨基修飾或生物素修飾。本實(shí)施例中選擇采用鏈霉親和素以及相應(yīng)的生物素進(jìn)行修飾。將經(jīng)鏈霉親和素修飾的微珠與生物素修飾的引物放入連接緩沖液(binding buffer)混合均勻，放置于旋轉(zhuǎn)儀上，孵育Ih即可使二者通過鏈霉親和作用結(jié)合。在步驟S1012中，將步驟SlOll中得到帶引物的微珠與其他擴(kuò)增試劑混合，制備水相體系。制備的水相體系如下(1) 10XPCR buffer, 15 μ L ； (2)dNTP，3 μ L ； (3) DNA模板， 2 μ L ； (4)引物結(jié)合后的微珠，5 μ L ； (5) Taq 酶，9 μ L ； (6) Mg2+，3 μ L ； (7) ddH20,114 μ L ； (8) 在水相體系中優(yōu)選加入能夠加速反應(yīng)啟動(dòng)速度的一對(duì)小引物，上、下游兩端各0. 75 μ L0圖3示出了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中將水相與油相體系混合制備乳濁液體系的方法流程。其中包括步驟S1031中，水相體系與油相體系進(jìn)行混合得到水、油混合體系。兩者混合的順序一般為水相注入到油相中，然后混合。但也可按照由少注入多的原則，兩者混合順序可以調(diào)換。本實(shí)施例中優(yōu)選水相注入到油相中，兩者混合的比例為水相150 μ L，油相600 μ L0步驟S1032中，水、油混合體系中加入輔助微固體材料，得到乳濁液混合物。水、油兩相混合之后，往其中加入輔助微固體材料。加入的輔助微固體材料，必須與之前建立的水、油混合體系相匹配，能夠懸浮于其中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的不同，可以選擇加入鋼珠、玻璃珠或塑料珠等。本實(shí)施例中優(yōu)選加入鋼珠。步驟S1033中，將上述乳濁液混合物振蕩打勻形成乳濁液體系。乳濁液制備儀的振蕩條件直接關(guān)系到乳濁液體系中液滴的多少及其體積的大小，因此需要合適的振蕩條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明根據(jù)待測(cè)模板長度和固相載體的大小變化，可以選擇不同的振
蕩頻率。其中，本實(shí)施例中制備乳濁液體系的條件為乳濁液制備儀的振蕩頻率13ΗΖ，時(shí)間為 13s。圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系進(jìn)行片段擴(kuò)增的方法，該實(shí)施例是在一個(gè)具體的應(yīng)用場(chǎng)景中，基于乳濁液體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增的過程。步驟S201中，制備包含連接引物之后的微珠在內(nèi)的水相體系。水相體系中包含有連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的微珠，包含目的擴(kuò)增片段以及擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑，同時(shí)還加入能加快擴(kuò)增反應(yīng)啟動(dòng)的小引物。其中微珠上結(jié)合的引物為目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的上、 下游兩端雙引物。步驟S202中，制備多種油脂混合在內(nèi)的油相體系。制備的油相體系與之后加入的輔助固體材料鋼珠相匹配，與水相混合之后可以使得鋼珠能自由移動(dòng)于混合液中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用兩種油脂及制備的油相體系為EmA，300yL;EmB，72mg ；EmC, 200 μ L0在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，利用五種油脂及制備的油相體系為ΕπιΑ，200μ L ；EmB, 50mg ；EmC, 100 μ L ；EmD, 300 μ L ；EmE, 200 μ L0
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步驟S203中，制備乳濁液體系。輔助微固體材料優(yōu)選鋼珠，水相體系注入到油相體系，放置于乳濁液制備儀上振蕩混勻。關(guān)于此步驟的具體操作，可見圖2所述詳細(xì)步驟。其中，本實(shí)施例中制備乳濁液體系的條件為乳濁液制備儀的振蕩頻率13HZ，時(shí)間為 13s。步驟S204中，利用制備的乳濁液體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)如下橋式ePCR 反應(yīng)程序940C 2min，90°C 15s，56°C 2min，72°C 45s，然后進(jìn)行 100 個(gè)循環(huán)數(shù)；90"C 15s，61°C 5min，循環(huán)數(shù)為 20;72°C，5min ;10°C 保溫。步驟S205中，破乳收集目的擴(kuò)增產(chǎn)物。破乳方式可以采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中的任何方式進(jìn)行，本實(shí)施例采用異丙醇同時(shí)輔助以提取清洗的緩沖液進(jìn)行破乳釋放收集。圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系進(jìn)行片段擴(kuò)增并用于基因測(cè)序的示意圖。該圖直觀的展現(xiàn)了利用用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系進(jìn)行橋式 ePCR擴(kuò)增的過程步驟1.生物素化的上、下游引物鏈霉親和作用結(jié)合固定到微珠表面，得到帶引物的微珠。步驟2.利用帶引物的微珠先制備如圖1步驟SlOl中的水相體系。步驟3.利用多種油脂混合，制備如圖1步驟S102中的油相體系。步驟4.將水相與油相體系混合，加入輔助微固體材料如鋼珠、玻璃珠、塑料珠等， 然后通過乳濁液制備儀振蕩混勻，制備乳濁液體系。步驟5.利用制備的乳濁液體系進(jìn)行橋式ePCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明一種用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法典型的應(yīng)用于擴(kuò)增，但不限于擴(kuò)增，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟A.制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的固相載體的水相體系；B.制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系；C.將水相與油相體系混合，制備乳濁液體系； 其中，步驟A和步驟B無先后順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，步驟A 包括Al.將目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的引物連接到固相載體，得到帶引物的固相載體； A2.將其他擴(kuò)增體系試劑與帶引物的固相載體混合，制備水相體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，步驟 A2中所述水相體系除包含有擴(kuò)增所需試劑之外，還包含一對(duì)加快反應(yīng)啟動(dòng)速度的小引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，步驟B 中油相體系由符合熱穩(wěn)定性以及密度要求的多種油脂混合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，步驟C 包括Cl.將水相加入到油相體系中混合，得到水、油混合體系；C2.水、油混合體系中加入輔助微固體，得到乳濁液混合物；C3.將乳濁液混合物放置于乳濁液制備儀上，振蕩打勻形成乳濁液體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，所述步驟C2中的輔助微固體，采用鋼珠、塑料珠或玻璃珠中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，所述步驟C3中乳濁液制備的振蕩條件根據(jù)待測(cè)模板長度和固相載體的大小變化而選擇不同的振蕩頻率。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于，所述步驟C之后還包括以下步驟D.利用制備的乳濁液體系進(jìn)行ePCR擴(kuò)增反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法，其特征在于 若連接到固相載體的引物為一端單引物，則步驟D直接進(jìn)行單引物擴(kuò)增反應(yīng)；若連接到固相載體的引物為上、下游兩端對(duì)應(yīng)引物，則步驟D進(jìn)行的是雙引物擴(kuò)增反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，提供了一種用于擴(kuò)增長片段的乳濁液體系制備方法。所述方法包括以下步驟A.制備包含連有目的擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)引物的固相載體的水相體系；B.制備包含多種油脂混合在內(nèi)的油相體系；C.將水相體系與油相體系混合，制備乳濁液體系。本發(fā)明中利用水、油兩相的混合比例以及制備的振蕩頻率和時(shí)間對(duì)乳濁液體系進(jìn)行控制，使得乳濁液體系中包含有更多的液滴數(shù)量，同時(shí)在保證乳濁液穩(wěn)定的前提下，增大其所含有的液滴體積，進(jìn)而使其能夠用于擴(kuò)增更長的片段。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102286472SQ20111025894
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者盛司潼 申請(qǐng)人:盛司潼