一種i型usher綜合征相關(guān)基因突變及應(yīng)用此突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變及應(yīng)用此突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑。所述診斷試劑包括，1)DNA提取體系試劑盒：被測個體外周靜脈血基因組DNA提?。?)PCR擴(kuò)增體系試劑盒和3)DNA測序體系，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增體系：以外周靜脈血提取的基因組DNA為模板，以(a)和(b)兩組引物同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述DNA測序體系：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序，并與原MYO7A基因編碼DNA序列對比；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物中c.73G＞A和c.462C＞A突變均存在時，為I型USHER綜合征患者，當(dāng)存在突變之一時，為I型USHER綜合征攜帶者，當(dāng)兩突變均不存在時，為健康個體。本發(fā)明實現(xiàn)了臨床上對USHER綜合征患者方便快捷準(zhǔn)確的基因篩查和診斷。
【專利說明】—種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變及應(yīng)用此突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因突變及應(yīng)用此突變基因的診斷試劑，具體涉及一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變及應(yīng)用此突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]USHER綜合征又稱遺傳性視網(wǎng)膜色素變性-感音神經(jīng)性耳聾綜合征。據(jù)統(tǒng)計，先天性重度-極重度感音神經(jīng)性耳聾患者中約有10%為USHER綜合征。臨床上將USHER綜合征分為3型，I型為先天性重度-極重度耳聾，伴前庭反射消失，10歲左右出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性，為三種類型中最重的一型。由于該類患者出生后只表現(xiàn)為聾啞，10歲之后才出現(xiàn)視力障礙，因此單純依靠臨床聽力檢查極易漏診。如能早期篩查出USHER綜合征患者，并在視力障礙出現(xiàn)前進(jìn)行人工耳蝸植入，則可以有效避免嚴(yán)重視力-聽力-言語聯(lián)合殘疾的發(fā)生。
[0003]以往由于人們?nèi)狈SHER綜合征遺傳病因?qū)W的深入認(rèn)識以及診斷技術(shù)，大部分病例均無法明確分子病因，更無法預(yù)防其發(fā)生。近30年來，伴隨耳聾遺傳病因?qū)W及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，至今已有5個I型USHER綜合征基因被克隆，豐富了 USHER綜合征基因譜。但在我國，盡管有眾多的USHER綜合征患者，其分子病因多不清楚，難以明確診斷，使得USHER綜合征防治極其困難。
[0004]研究證實MY07A基因突變可以引起I型USHER綜合征及常染色體隱性遺傳性耳聾[1,2],是最常見的I型USHER綜合征致病基因，臨床上約50%的I型USHER綜合征患者均由該基因突變引起。MY07A基 因位于11號染色體長臂，包含49個外顯子，編碼2215個氨基酸，基因較大，傳統(tǒng)的PCR、測序檢測法耗時、耗力，因此在臨床上很難常規(guī)檢查。如能明確MY07A基因的致病突變位點，設(shè)計針對致病突變位點的檢測芯片，則有望解決臨床上I型USHER綜合征患者基因篩查、診斷的難題。
[0005]已有文獻(xiàn)報道MY07A基因編碼DNA的第73位堿基鳥嘌呤替換為腺嘌呤引起編碼氨基酸的第25位甘氨酸突變?yōu)榫彼?c.73G > A，p.G25R)，為一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變，但只有2條等位基因同時攜帶該突變才致病，如果1條基因攜帶該突變不致病，此發(fā)現(xiàn)不足以解決臨床上I型USHER綜合征患者基因篩查、診斷的難題。尋找新的致病突變，豐富I型USHER綜合征基因譜及突變譜將為臨床上方便快捷的篩查和診斷I型USHER綜合征患者提供重要的靶點及理論依據(jù)，是本領(lǐng)域研究工作者孜孜不倦的探究領(lǐng)域。
[0006]發(fā)明目的
[0007]有鑒于此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的難題，本發(fā)明人經(jīng)過艱辛的研究，發(fā)現(xiàn)了另一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變，該突變與已知的73位堿基相關(guān)基因突變結(jié)合篩查，可有效解決上述難題。
[0008]本發(fā)明還提供應(yīng)用上述新發(fā)現(xiàn)的I型USHER綜合征相關(guān)突變與已知相關(guān)突變結(jié)合的在臨床上可有效快捷地篩查、診斷I型USHER綜合征的分子病因?qū)W診斷試劑。
[0009]本發(fā)明提供的一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變，所述突變?yōu)镸Y07A基因編碼DNA的第462位堿基胞嘧啶替換為腺嘌呤引起編碼氨基酸的第154位半胱氨酸突變?yōu)榻K止碼(c.462C > A, p.C154X)。
[0010]本發(fā)明提供的一種含有上述I型USHER綜合征相關(guān)突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑，所述診斷試劑包括，1)DNA提取體系試劑盒:被測個體外周靜脈血基因組DNA提??；2)PCR擴(kuò)增體系試劑盒和3)DNA測序體系，所述PCR擴(kuò)增體系:以外周靜脈血提取的基因組DNA為模板，以(a)和(b)兩組引物同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0011]具中:(a)組引物為上游引物(5’ 一 3’):TTGTAGCAGAGGGATATAGGGC,下游引物(5’ — 3’):GGGGACTACTCACATTGTCTTCA,
[0012](b)組引物為上游引物(5，一 3，): CTGGTGGCTGTGAACCCCTA，下游引物(5，一 3，):GCTTGATGGCATTTCCGAC ；
[0013]所述DNA測序體系:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序，并與原MY07A基因編碼DNA序列對比:
[0014]當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物中c.73G >八和c.462C > A突變均存在時，為I型USHER綜合征患者，當(dāng)存在突變之一時，為I型USHER綜合征攜帶者，當(dāng)兩突變均不存在時，為健康個體。
[0015]MY07A蛋白為非常規(guī)肌球蛋白，在耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛的形成中發(fā)揮了重要作用。
[0016]MY07A基因編碼DNA的第462位堿基胞嘧啶替換為腺嘌呤引起編碼氨基酸的第154位半胱氨酸突變?yōu)榻K止碼(c.462C > A，p.C154X)是本
【發(fā)明者】首次發(fā)現(xiàn)的引起常染色體隱性遺傳性耳聾的突變，并首次證實了其為I型USHER綜合征的分子病因之一，在219例中國正常聽力人群中進(jìn)行該位點的篩查，均為陰性。本研究豐富了 USHER綜合征基因譜及突變譜，為開展USHER綜合征分子診斷提供了基因?qū)W依據(jù)。在我國開展I型USHER綜合征相關(guān)基因及其突變譜的研究為研發(fā)適用于中國人群的篩查工具提供了理論依據(jù)及篩查靶點。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:
[0018]1.本發(fā)明公開了一種已知I型USHER綜合征(MY07A)的新突變，首次證實了其與第73位堿基突變(c.73G > A，p.G25R) 一起共同決定了 I型USHER綜合征的分子病因，本研究豐富了 USHER綜合征基因突變譜，為開展USHER綜合征分子診斷提供了基因?qū)W依據(jù)和重要的靶點。
[0019]2.本發(fā)明方法中MY07A基因的復(fù)合雜合突變:c.73G> A(p.G25R)錯義突變和c.462C > A(p.C154X)無義突變經(jīng)證實可引起I型USHER綜合征，通過基因診斷可判斷此家族中未發(fā)病的人群患病的可能性，將疾病的診斷及干預(yù)提前至未發(fā)病時，降低該家庭嚴(yán)重殘疾的發(fā)生率。
[0020]3.本發(fā)明提供了兩突變位點同時擴(kuò)增的有效PCR擴(kuò)增引物及以此為基礎(chǔ)的診斷試劑，易于篩查操作和診斷，當(dāng)c.73G > A和c.462C > A突變均存在時，為I型USHER綜合征患者，當(dāng)存在突變其一時，為I型USHER綜合征攜帶者，當(dāng)兩突變均不存在時為健康，從而解決了臨床上USHER綜合征患者基因篩查、診斷的難題。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0021]圖1家系圖及MY07A突變在家系內(nèi)的共分離結(jié)果。(9名直系親屬的基因型均進(jìn)行了標(biāo)記。)[0022]圖2家系部分成員MY07A突變檢測結(jié)果
[0023]測序結(jié)果顯示所有患者(II:1,I1:2,11:4,11:5)均攜帶MY07A基因c.73G > A，c.462C>A突變.113未攜帶致病突變，父母均為正常攜帶者，即1: 1僅有c.462C > A突變:2僅有c.73G> A突變。
【具體實施方式】:
[0024]實施例1本發(fā)明的I型USHER綜合征相關(guān)基因突變
[0025]發(fā)明人使用131個已知耳聾基因捕獲平臺，結(jié)合Illumina Hiseq2000的高通量測序技術(shù)，對4位患者及其表型正常的父母進(jìn)行了 131個耳聾基因全外顯子捕獲測序，詳細(xì)步驟如下:
[0026](1)將基因組DNA隨機(jī)打斷成250_300bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭制備雜交文庫。
[0027](2)對131個已知耳聾基因的外顯子及側(cè)翼50bp序列進(jìn)行捕獲，采用下一代平行測序技術(shù)進(jìn)行測序。測序平臺為Illumina Hiseq2000，雜交探針長度為0.5_1.6kbps。每個樣本的平均測序深度最少為50 X。
[0028](3)測序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software 1.7進(jìn)行處理，使用S0APaligner2.20將過濾后的reads比對到參考基因組，得到比對到基因組上的Uniquemapped reads。利用軟件SOAPsnp確定祀?yún)^(qū)域的基因型。
[0029](http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hgl9/database/snpl32.txt.gz), HapMap 數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncb1.nlm.nih.·gov/hapmap),千人基因組數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.lOOOgenomes.eb1.ac.uk/vol 1/ftp),等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,過濾掉所有已知變異。
[0030]USHER綜合征為常染色體隱性遺傳，本研究結(jié)合家系實際情況，使用隱性遺傳策略分析。將分析后的加息結(jié)果與目前已經(jīng)報道的與I型USHER相關(guān)的基因列表取交集，得到17個已知基因的突變，其中4個患者共有的突變有2個。綜合測序質(zhì)量和信息分析提供的篩選參考(如SIFT預(yù)測蛋白危害)，發(fā)明人結(jié)合隱性策略分析，即父母雜合突變、孩子純合突變或者父母同一基因各帶有一突變、孩子同時擁有兩個突變(復(fù)合雜合)，發(fā)現(xiàn)MY07A基因上的突變符合條件。根據(jù)分析，MY07A中有2個突變?yōu)榛颊吖灿?一個錯義突變c.73G >A(p.G25R)存在于母親，一個無義突變c.462C > A(p.C154X)存在于父親。確定分析結(jié)果，發(fā)明人對結(jié)果進(jìn)行sanger測序驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4名患者都攜帶MY07A上的c.73G > A (p.G25R)錯義突變和c.462C > A(p.C154X)無義突變，父親攜帶錯義突變，母親攜帶剪接突變(具體結(jié)果見圖2)，正常人中無此兩種突變。由此，可初步推斷上述錯義突變和無義突變?yōu)樵摷蚁抵虏⊥蛔儭?br> [0031]實施例2應(yīng)用上述突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑
[0032]包括1)DNA提取體系試劑盒:被測個體外周靜脈血基因組DNA提取，2)PCR擴(kuò)增體系試劑盒和3)DNA測序體系。
[0033]具體操作如下采集家系圖1所標(biāo)注9名直系成員的外周血，利用DNA提取體系試劑盒QIAmp Blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)抽提外周血白細(xì)胞中的基因組DNA,利用Qubit Fluorometer和瓊脂糖凝膠電泳測量DNA的濃度及純度，所得的每個標(biāo)本基因組DNA0D260/0D280均位于1.7-2.0之間，濃度不少于50ng/ul，總量不少于3 μ g。[0034]分別對4名患者(即圖1中的III，112，114，115)、5名家系內(nèi)正常人(患者的父母II，12，未發(fā)病的兄弟113和患者的正常子女II1:1,111:3)以及219位家系外正常人采用本發(fā)明PCR擴(kuò)增體系試劑盒，針對該MY07A基因復(fù)合雜合突變位點所在序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增，2)引物設(shè)計及PCR反應(yīng)
[0035]引物設(shè)計參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫GRCh37/hgl9，具體見下。
[0036]a)引物序列:
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種I型USHER綜合征相關(guān)基因突變，其特征在于，所述突變?yōu)镸Y07A基因編碼DNA的第462位堿基胞嘧啶替換為腺嘌呤引起編碼氨基酸的第154位半胱氨酸突變?yōu)榻K止碼(c.462C > A, p.C154X)。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的I型USHER綜合征相關(guān)突變基因的耳聾分子病因?qū)W診斷試劑，所述診斷試劑包括，1)DNA提取體系試劑盒:被測個體外周靜脈血基因組DNA提??；2)PCR擴(kuò)增體系試劑盒和3)DNA測序體系，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增體系:以外周靜脈血提取的基因組DNA為模板，以(a)和(b)兩組引物同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中:(a)組引物上游引物(5，一3’):TTGTAGCAGAGGGATATAGGGC，下游引物(5，一 3’):GGGGACTACTCACATTGTCTTCA,(b)組引物上游引物(5，—3，):CTGGTGGCTGTGAACCCCTA,下游引物(5，— 3，):GCTTGATGGCATTTCCGAC ； 所述DNA測序體系:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測序，并與原MY07A基因編碼DNA序列對比；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物中c.73G > A和c.462C > A突變均存在時，為I型USHER綜合征患者，當(dāng)存在突變之一時，為I型USHER綜合征攜帶者，當(dāng)兩突變均不存在時，為健康個體。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710340SQ201310472734
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】高雪, 戴樸 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院