Cacna1e突變基因及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，該方法為全基因組深度測序法或毛細(xì)管電泳測序法。本發(fā)明還提供了CACNA1E突變基因。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒以及上述試劑盒在肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述突變基因和檢測方法在肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中的應(yīng)用。通過全基因組測序及基于特異性PCR反應(yīng)，在肺癌病人樣本中發(fā)現(xiàn)了基因CACNA1E突變位點，通過檢測其突變可為臨床治療、用藥提供分子分型、治療靶點等理論基礎(chǔ)，為預(yù)防及治療腫瘤提供新的思路。
【專利說明】CACNA1E突變基因及其檢測方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種CACNA1E突變基因的檢測方法及其突 變基因。進(jìn)一步地，涉及檢測上述突變基因的試劑盒以及該試劑盒的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還 涉及檢測方法、基因和/或試劑盒在肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌基因是一類能誘發(fā)癌癥的基因。癌癥的發(fā)生往往與癌基因的異常表達(dá)及其活化 相關(guān)。在腫瘤組織樣本中，與之相關(guān)的癌基因普遍高表達(dá)，同時這些癌基因突變后導(dǎo)致其活 性大大增強(qiáng)。以表皮生長因子受體（EGFR)為例，在肺癌腫瘤樣本中，EGFR的高表達(dá)導(dǎo)致了 PI3K-AKT信號通路異常激活，從而導(dǎo)致了細(xì)胞異常增生。結(jié)合臨床資料分析，EGFR突變導(dǎo) 致病人對藥物（吉非替尼等）產(chǎn)生敏感性，如發(fā)生在EGFR第21號外顯子（L858R)及第19 號外顯子的突變使得病人對吉非替尼敏感。另一方面，在臨床治療過程中，病人逐漸產(chǎn)生耐 藥性。進(jìn)一步研究顯示，這種耐藥性的產(chǎn)生是由于EGFR第20號外顯子發(fā)生突變（T790M) 而導(dǎo)致的。針對于此，在肺癌患者進(jìn)行臨床治療前，對其EGFR突變篩查已成為臨床及個性 化治療的常規(guī)手段，并已取得較好的效果。由此可見，針對相關(guān)癌基因突變檢測對于預(yù)防 及治療癌癥尤其是肺癌意義重大。但是由于EGFR等其他癌基因的突變在肺癌病人中只占 30% -50%，還有一大部分病人的發(fā)病機(jī)理并不清楚，因此，應(yīng)用新技術(shù)發(fā)現(xiàn)癌基因并檢測 其突變顯得迫在眉睫。
[0003] 隨著人類全基因組測序工作的完成以及測序技術(shù)的不斷革新，全基因組測序已經(jīng) 逐漸成為腫瘤基因組研究的有利武器。Ca 2+離子作為細(xì)胞內(nèi)必不可少的第二信使參與了許 多重要的生理、生化過程。而鈣離子通道蛋白在調(diào)節(jié)鈣離子的過程中起著至關(guān)重要的作用。 近幾年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與鈣相關(guān)蛋白有著密切的聯(lián)系，例如，基因 CACNA2D1能 夠維持肝癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特點。
[0004] 基因 CACNA1E是鈣離子通道蛋白的a IE亞基。它有3個轉(zhuǎn)錄本，這三個轉(zhuǎn)錄本編 碼的蛋白分別由225U2270及2313個氨基酸組成。之前有報道，CACNA1E基因在腎母細(xì)胞 瘤中呈高拷貝狀態(tài)，其mRNA及蛋白均高表達(dá)，且這種高表達(dá)與腎母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)正相關(guān)。 但是，截止目前，基因 CACNA1E在其他腫瘤中表達(dá)情況并不清楚，其在腫瘤樣本中的突變與 腫瘤的關(guān)系也并未報道。因此，研究CACNA1E在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的關(guān)系以及檢測其突 變及突變與腫瘤的關(guān)系對發(fā)現(xiàn)新的癌基因、預(yù)防及治療腫瘤意義重大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明人使用全基因組測序技術(shù)，對來自中國多環(huán)芳烴污染嚴(yán)重的肺癌高發(fā)地區(qū)的 14個病人的癌及癌旁組織進(jìn)行了深度測序，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，鈣離子信號通路及鈣離子通道 蛋白在這些病人體內(nèi)發(fā)生了大量突變。在全基因組測序結(jié)果中，鈣離子通道蛋白突變不僅 得到富集而且有著很高的突變頻率，尤其是基因 CACNA1E。
[0006] 進(jìn)一步地，發(fā)明人針對基因 CACNA1E的每一個外顯子序列特點，設(shè)計每一個外顯 子的特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，在164例病人標(biāo)本以及5個細(xì)胞系（L78細(xì)胞 系、％D細(xì)胞系、Hela細(xì)胞系、NCI-H1975細(xì)胞系及XLA-07細(xì)胞系）中將CACNA1E的所有外 顯子擴(kuò)增出來，并通過毛細(xì)管電泳測序找出引起CACNA1E氨基酸改變的突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 164例病人中共發(fā)現(xiàn)16例病人發(fā)生突變，其中在宣威/富源地區(qū)的79例病人中，有15例發(fā) 生突變，突變頻率達(dá)到19% ;在廣州及云南非宣威/富源地區(qū)的85例病人中只有1例病人 發(fā)生突變，突變頻率為1. 2%。
[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，該方法為全基因組深度測序法 或毛細(xì)管電泳測序法。
[0008] 本發(fā)明還提供了 CACNA1E突變基因。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒以及上述試劑盒在肺 癌的預(yù)防、檢測和/或治療中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述突變基因和檢測方法在肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中的應(yīng) 用。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種檢測CACNA1E突變基因的方法，所述方 法為全基因組深度測序法或毛細(xì)管電泳測序法。
[0012] 優(yōu)選地，所述方法為毛細(xì)管電泳測序法，所述方法包括以下步驟：
[0013] 1)對CACNA1E基因的每個外顯子設(shè)計特異性PCR引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] 優(yōu)選地，所述PCR產(chǎn)物大小控制在400-1200bp之間；
[0015] 優(yōu)選地，所述PCR引物的序列如SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:92所示；
[0016] 2)PCR產(chǎn)物純化后毛細(xì)管電泳測序檢測，將得到的序列與UCSC網(wǎng)站中的CACNA1E 的基因序列（GRCh37/hgl9)比較，從而確定CACNA1E基因的突變位點；
[0017] 3)將得到的PCR產(chǎn)物按照正常的讀碼框進(jìn)行翻譯，以確定CACNA1E的突變位點。
[0018] 優(yōu)選地，所述核苷酸突變位點至少具有以下的一種或多種：c. C356A、c. C507T、 C. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、c. G6865T。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述突變位點還位于 c. A6515G、c. C253A。
[0019] 再一方面，本發(fā)明提供了一種CACNA1E突變基因，其中所述CACNA1E突變基因的核 苷酸序列至少一個突變位點位于 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、 c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、 c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、 c. G6865T、c. A6515G、c.C253A。
[0020] 優(yōu)選地，所述CACNA1E突變基因的編碼蛋白質(zhì)序列至少一個氨基酸突變位點位 于 P. P119H、P. L169F、P. H179N、P. R249L、P. A275S、P. G352W、P. E391D、P. D426Y、P. G546V、 P. R772L、p. E795D、p. S851I、p. R925S、p. L1013Q、p. K1327N、p. E1435K、p. W1665L、p. A1870S、 p. S1942Y、p. D2013Y、p. Ρ2291Τ、ρ· R2288S、p. G2289W。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述突變位點還位于 P. Y2172C、p. L85I。
[0021] 本申請中所有的突變命名是基于國際上突變的命名原則，包含了三部分，突變前 氨基酸-突變的氨基酸位置-突變后氨基酸，如A275S，即突變導(dǎo)致了第275個氨基酸由突 變前的丙氨酸（A)變成了突變后的絲氨酸（S)，核苷酸突變同理。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測CACNA1E突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增 CACNA1E突變位點的引物，優(yōu)選地，所述試劑盒包括SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的引 物。
[0023] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括常用的PCR組分，例如PCR擴(kuò)增酶以及相應(yīng)的緩沖液。
[0024] 需要說明的是，試劑盒中的引物可以根據(jù)已知的氨基酸序列設(shè)計，這是本領(lǐng)域的 常規(guī)技術(shù)手段。
[0025] 本發(fā)明提供的試劑盒的具體使用方法如下所示：
[0026] I) CACNA1E各外顯子特異性PCR引物的設(shè)計：
[0027] 運用軟件Primer5設(shè)計CACNA1E 48個外顯子的特異性引物，共46對引物；設(shè)計引 物時，將產(chǎn)物大小控制在400-1200bp之間，并通過NCBI blast功能blast結(jié)果為單一性， 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述引物如表1所不。
[0028] 2) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增：
[0029] PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，模板DNA用量為10ng。
[0030] PCR程序為95°C，5分鐘，95°C，30秒，60°C，45秒，72°C，1分鐘，35個循環(huán)，最后 72 °C延伸10分鐘。
[0031] 3)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序，將得到的序列與CACNA1E的基因序列比較，從而 判斷是否存在突變位點。
[0032] 另外，也可以直接針對某個或某些突變位點設(shè)計引物，例如引物可以為SEQ ID NO: I-SEQ ID NO:92所示的序列中的一種或多種。
[0033] 由于上述試劑盒可以檢測到CACNA1E基因的突變情況，而CACNA1E基因在肺癌病 人，尤其是中國多環(huán)芳烴污染嚴(yán)重的肺癌高發(fā)地區(qū)及細(xì)胞系中具有較高的突變率，因此該 試劑盒可以應(yīng)用到肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中。
[0034] 同樣地，本發(fā)明提供的CACNA1E突變基因和檢測方法也可以應(yīng)用到肺癌的預(yù)防、 檢測和/或治療中的應(yīng)用。例如，由于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在中國多環(huán)芳烴污染嚴(yán)重地區(qū)的肺癌 中基因 CACNA1E發(fā)生了突變，并通過一系列實驗證實了基因 CACNA1E與肺癌發(fā)生相關(guān)，因此 基因 CACNA1E及其突變位點可以作為肺癌的治療靶點。
[0035] 優(yōu)選地，可以通過siRNA干擾技術(shù)，干擾掉CACNA1E，從而達(dá)到降低腫瘤的成瘤能 力或者抑制腫瘤生長的目的，用于治療和/或預(yù)防肺癌。
[0036] 因此，本發(fā)明還提供了一種siRNA的組合，所述siRNA為用于干擾CACNA1E表達(dá)的 特異性siRNA。優(yōu)選地，所述siRNA的序列為
[0037] SEQ ID N0:93 :5, -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3, ；（CACNA1E 干擾 1)
[0038] SEQ ID N0:94 :5, -CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3，。（CACNA1E 干擾 2)
[0039] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含上述siRNA序列。所述試劑盒中還 包括PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
[0040] 本發(fā)明提供還提供了上述試劑盒的使用方法，優(yōu)選地，所述方法為二次干擾法。
[0041] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述二次干擾法是通過包括以下步驟的方法實現(xiàn)的：
[0042] a.將受試者的細(xì)胞接種于6孔板，接種密度為IX IO5個細(xì)胞/孔，并使用培養(yǎng)基 培養(yǎng)；
[0043] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為含10 % FBS的RPMI1640/DMEM培養(yǎng)基；
[0044] b. -天后，吸掉培養(yǎng)基，加入800 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基；
[0045] c.將轉(zhuǎn)染試劑 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ I siRNA (20 μ Μ)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM的RNase free的管子中，漩渦振蕩混勻，室溫靜止10-15分鐘；
[0046] d.將混和液加入到6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時左右；
[0047] e. 6小時后，用新鮮培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染液；
[0048] f.第三天重復(fù)步驟a-e。
[0049] 由于上述試劑盒可以干擾CACNA1E突變基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖、克隆 形成、成瘤能力，并使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度以及細(xì)胞內(nèi)磷酸化EGFR、ERK、AKT也隨之下降， 因此該試劑盒可以應(yīng)用到肺癌的預(yù)防、檢測和/或治療中。
[0050] 本發(fā)明為檢測癌基因 CACNA1E突變提供了理論基礎(chǔ)，設(shè)計了檢測突變的特異性 引物。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過全基因組測序及PCR、毛細(xì)管電泳測序等方法公開了基因 CACNA1E在肺癌病人尤其是中國多環(huán)芳烴污染嚴(yán)重的肺癌高發(fā)地區(qū)及細(xì)胞系中的突變情 況。除此之外，本發(fā)明通過干擾的方式初步揭示了癌基因 CACNA1E在肺癌發(fā)病中的作用。發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)，在帶CACNA1E突變的細(xì)胞中干擾CACNA1E后，細(xì)胞的增殖、克隆形成、成瘤能力皆 受到抑制，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度以及細(xì)胞內(nèi)磷酸化EGFR、ERK、AKT也隨之下降。
[0051] 本發(fā)明適用于檢測癌基因 CACNA1E的突變，包括病人來源的腫瘤組織及細(xì)胞系。 通過檢測其突變可為臨床治療、用藥提供分子分型、治療靶點等理論基礎(chǔ)，為預(yù)防及治療腫 瘤提供新的思路。
[0052] 通過全基因組測序及基于特異性PCR反應(yīng)在肺癌病人樣本中發(fā)現(xiàn)了基因 CACNA1E 突變位點，這些突變位點在肺癌預(yù)防、診斷及治療過程中的作用。設(shè)計針對CACNA1E的特異 性小核酸RNA干擾序列（siRNA)，通過干擾的方式在CACNA1E突變以及野生型的細(xì)胞中將蛋 白CACNA1E干擾掉，檢測細(xì)胞增殖，克隆形成能力、鈣信號變化以及下游信號通路的變化。 結(jié)果顯示，在CACNA1E突變的細(xì)胞中，干擾CACNA1E后能明顯抑制細(xì)胞的增殖以及克隆形成 能力，并能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。同時，檢測其下游信號通路發(fā)現(xiàn)，在帶CACNA1E突 變的細(xì)胞中，干擾CACNA1E，磷酸化的EGFR、ERK、AKT都下調(diào)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0054] 圖1為肺癌病人樣本及細(xì)胞系中CACNA1E蛋白突變的結(jié)構(gòu)示意圖；其中圖A為肺 癌病人樣本中CACNA1E蛋白突變的結(jié)構(gòu)示意圖；其中圖B為肺癌細(xì)胞系（XLA-07)和Hela 細(xì)胞中CACNA1E蛋白突變的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0055] 圖2在基因 CACNA1E發(fā)生突變的Hela細(xì)胞及肺癌細(xì)胞XLA-07中，干擾CACNA1E 后細(xì)胞增殖、克隆形成及相關(guān)信號通路變化；其中，A為Hela及XLA-07細(xì)胞干擾CACNA1E 后，增殖能力受到抑制；B為Hela細(xì)胞干擾CACNA1E后克隆形成能力受到抑制；C為Hela及 XLA-07細(xì)胞干擾CACNA1E后，磷酸化EGFR、磷酸化AKT及磷酸化ERK下調(diào)；
[0056] 圖3為基因 CACNA1E發(fā)生突變的Hela細(xì)胞及肺癌細(xì)胞XLA-07中，干擾CACNA1E 后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低；其中，橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度越高，熒光越強(qiáng)； 縱坐標(biāo)是發(fā)射熒光的細(xì)胞比例；如圖中所示，對照組中的細(xì)胞熒光強(qiáng)度要高于CACNA1E干 擾后的細(xì)胞，即CACNA1E干擾后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低；
[0057] 圖4為基因 CACNA1E發(fā)生突變的Hela細(xì)胞中，干擾CACNA1E后，細(xì)胞成瘤能力受 到抑制。其中，圖A是在荷瘤的不同時間點測量腫瘤的體積，對照組中的瘤子體積明顯大于 CACNA1E干擾后的瘤子體積；圖B是處死老鼠后將瘤子剝離下來后的瘤子照片；圖C是老鼠 處死時的荷瘤照片。

【具體實施方式】
[0058] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。
[0059] 除非特別指明，以下實施例中采用的Hela細(xì)胞系購自協(xié)和細(xì)胞庫；XLA-07細(xì)胞系 購自中國科學(xué)院昆明動物所；L78細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫、％D細(xì)胞系購自中國 科學(xué)院上海細(xì)胞庫、NCI-H1975細(xì)胞系購自ATCC ;
[0060] 除非特別指明，以下實施例中采用的裸鼠為Nude mouse，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。
[0061] 除非特別指明，以下實施例中所用的試驗方法均為本領(lǐng)域中所用的常規(guī)方法。
[0062] 除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商 購獲得。
[0063] 實施例1CACNA1E引物設(shè)計
[0064] CACNA1E為R型電壓門依賴性鈣離子通道蛋白α亞基1E，屬于細(xì)胞膜表面蛋白， 調(diào)控鈣離子的細(xì)胞內(nèi)入。同時還參與了多種鈣離子依賴性的細(xì)胞生理生化反應(yīng)，如肌肉收 縮、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞運動、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞死亡等。該基因目前發(fā)現(xiàn) 有三個轉(zhuǎn)錄本，其最長的轉(zhuǎn)錄本為ΝΜ_001205293. 1，包含48個外顯子，編碼2313個氨基酸。 其蛋白結(jié)構(gòu)包含了三個I〇n_trans結(jié)構(gòu)域、一個Ca_chan_IQ結(jié)構(gòu)域和一個PKD_Channel結(jié) 構(gòu)域。登陸UCSC網(wǎng)站下載CACNA1E的基因序列，通過軟件Primer 5設(shè)計CACNA1E每一個 外顯子的特異性引物，將產(chǎn)物大小控制在400-1200bp之間，并通過NCBI blast功能blast 結(jié)果為單一性，具體的引物序列如表1所示。
[0065] 表I. CACNA1E外顯子特異性引物序列
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種CACNA1E突變基因，其中所述CACNA1E突變基因的至少一個突變位點位于 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c.G1054T、c.G1173T、c.G1276T、c.G1637T、 c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、 c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c.C6871A、c.C6862A、c.G6865T、c. A6515G、c. C253A ; 優(yōu)選地，所述突變位點還位于c. A6515G，其中所述CACNA1E突變基因為Hela細(xì)胞系中 的突變基因； 優(yōu)選地，所述突變位點還位于c. C356A，其中所述CACNA1E突變基因為LXA-07細(xì)胞系中 的突變基因。
2. -種檢測如權(quán)利要求1所述的CACNA1E突變基因的方法，所述方法通過全基因組深 度測序法或毛細(xì)管電泳測序法確定突變基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述突變位點定位于Ion_trans結(jié)構(gòu)域、PKD_ Channel結(jié)構(gòu)域、Ca_chan_IQ結(jié)構(gòu)域和/或其它他非功能區(qū)； 優(yōu)選地，所述核苷酸突變位點至少具有以下的一種或多種：c. C356A、c. C507T、 c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A, c. G6037T, c. C6871A,c. C6862A,c.G6865T,c.A6515G,c.C253A ； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述突變位點還位于c. A6515G、c. C253A。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述方法通過毛細(xì)管電泳測序法確定突變基 因，包括以下步驟： 1) 對CACNA1E基因的每個外顯子設(shè)計特異性PCR引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 優(yōu)選地，所述PCR產(chǎn)物大小控制在400-1200bp之間； 優(yōu)選地，所述PCR引物的序列如SEQIDN0:1-SEQIDN0:92所示； 2. PCR產(chǎn)物純化后毛細(xì)管電泳測序檢測，將得到的序列與UCSC網(wǎng)站中的CACNA1E的基 因序列（GRCh37/hgl9)比較，從而確定CACNA1E基因的突變位點； 優(yōu)選地，所述方法還包括將得到的PCR產(chǎn)物按照正常的讀碼框進(jìn)行翻譯，以確定 CACNA1E的突變位點。
5. -種用于檢測如權(quán)利要求1所述的CACNA1E突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括用 于擴(kuò)增CACNA1E突變位點的引物； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增酶、緩沖液、酶切不同突變位點的相應(yīng)的限制性內(nèi) 切酶； 優(yōu)選地，所述PCR引物的序列選自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一種或 多種。
6. -種用于干擾如權(quán)利要求1所述的CACNA1E突變基因表達(dá)的siRNA的組合； 優(yōu)選地，所述siRNA的序列為 SEQ ID N0:93 :5' -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3' ；（CACNA1E 干擾 1) SEQ ID N0:94:5'-CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3'（CACNA1E 干擾 2)。
7. -種用于干擾如權(quán)利要求1所述的CACNA1E突變基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包 括如權(quán)利要求6所述的siRNA序列； 優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒的使用方法，所述方法為二次干擾法； 優(yōu)選地，所述二次干擾法是通過包括以下步驟的方法實現(xiàn)的： a. 將受試者的細(xì)胞接種于6孔板，，接種密度為1 X 105個細(xì)胞/孔，并使用培養(yǎng)基培養(yǎng) 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為含10% FBS的RPMI1640/DMEM培養(yǎng)基； b. -天后，吸掉培養(yǎng)基，加入800μ1 Opti-MEM培養(yǎng)基； c. 將轉(zhuǎn)染試劑 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ 1 siRNA(20 μ M)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM 的RNase free的管子中，漩潤振蕩混勻，室溫靜止10-15分鐘； d. 將混和液加入到6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時左右； e. 6小時后，用新鮮培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染液； f. 第二天重復(fù)步驟a_e。
9. 一組用于擴(kuò)增如權(quán)利要求1所述的CACNA1E突變基因的引物和/或用于干擾如權(quán)利 要求1所述的CACNA1E突變基因的SiRNA在制備用于預(yù)防、檢測和/或治療肺癌的藥物或 試劑盒中的用途； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增酶、緩沖液、酶切不同突變位點的相應(yīng)的限制性內(nèi) 切酶； 優(yōu)選地，所述引物選自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一種或多種 優(yōu)選地，所述siRNA為SEQ ID NO:93和/或94。
【文檔編號】A61P35/00GK104293796SQ201410524704
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】周光飚, 吳黎川, 程昕 申請人:中國科學(xué)院動物研究所