具有改善的底物特異性的pqq-依賴性葡萄糖脫氫酶的新變體的制作方法
【專利摘要】本申請涉及具有改善的底物特異性的PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的新變體。本發(fā)明涉及新的PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶（sPQQGDH），與野生型相比較而言，其具有增加的底物特異性，而且還涉及用于其生產和鑒別的方法。
【專利說明】具有改善的底物特異性的PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的新變體
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00980124063.5、申請日為2009年6月17日的發(fā)明專利申請
的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明的主題是PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶(sPQQGDH)，它們的生產和鑒別方法，編碼根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH的基因，生產該基因的載體，以及包含根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖脫氫酶的葡萄糖傳感器。
【背景技術】
[0003]葡萄糖的酶測定在醫(yī)學診斷中是非常重要的。這里，檢測尿或血液中的葡萄糖以診斷或監(jiān)測代謝性疾病的進展是必需的。在糖尿病(也稱為糖尿病)的情況中，每天可能需要多次測定血糖濃度。這可以通過市場上絕大多數(shù)的計量器通過酶方法實現(xiàn)，在酶方法中葡萄糖被氧化，由此得到的氫(2H"和2e_)進行電流分析定量(P.Vadgama, J.Med.EngTechnol.5 [6]，293-298 (1981)，K.S.Chua 和 1.K.Tan, Clin.Chem.24 [I] ,150-152(1978))。
[0004]存在許多適合這種目的的各種酶，但是這些酶與各種輔助因子共同作用進行電子的主要接收，并且還具有不同的生化性質諸如特異性、穩(wěn)定性或轉換率。酶的轉換率通常以活性單位(U)進行報道；在葡萄糖-氧化酶的情況中，比活性(U/mg)通常是指在確定的反應條件下每分鐘被I毫克酶氧化的以微摩爾計的葡萄糖的量。
[0005]通常使用的酶為葡萄糖脫氫酶(⑶H)。在NAD⑵+_依賴性⑶H的情況中，輔助因子為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或煙酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP+) (H.E.Pauly和 G.Pfleiderer,Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.356 [10]，1613-1623 (1975))，二者均為相當不穩(wěn)定的必須添加到反應中的化合物，因為它們不與酶結合。
[0006]另一類葡萄糖脫氫酶含有作為電子受體與酶結合的吡咯并喹啉醌(PQQ)。已經(jīng)描述了這種類型中兩種結構相互不同的葡萄糖脫氫酶:膜錨定型，mPQQGDH (A.MCleton-Jansen等，J.Bacteriol.170 [5]，2121-2125 (1988))，和較小的可溶型，sPQQGDH(A.M.Cleton-Jansen 等，Mol.Gen.Genet.217 [2-3], 430-436 (1989)) ? 由于后者的高比活性、其對氧的不敏感性以及緊密地結合，其為穩(wěn)定的輔助因子，為特別適合生產用于葡萄糖測定的測試系統(tǒng)的酶。因此在許多商品化的血糖計量器中，使用這種酶，盡管與提到的其他酶相比，這種酶顯示更低的底物特異性。由于最后提到的限制，當然希望擁有具有更高底物特異性的這種酶的變體。
[0007]除了底物葡萄糖外，sPQQGDH還將其他糖轉化為相應的內酯，優(yōu)選二糖，其中還原糖為葡萄糖，但也有其他還原糖。由于這種糖正常不存在于人的血液中，基于sPQQGDH的酶測試通常得到對應于葡萄糖濃度的結果。然而，某些醫(yī)學治療包含施用物質，該物質的一種分解產物為麥芽糖，麥芽糖被sPQQGDH氧化并且因此不希望地影響測量結果(T.G.SchIeis, Pharmacotherapy 27 [9]，1313-1321 (2007))。在診斷方法中或者作為藥物的佐劑施用木糖和半乳糖時，測定這些糖自身。因此以適當?shù)姆绞揭种苨PQQGDH的輔助活性是有意義的。
[0008]在文獻以及在專利說明書中，描述了許多通過引入突變來改善sPQQGDH的底物特異性的嘗試(S.1garashi等，Biomol.Eng 21 [2],81-89 (2004))。為此，在酶的催化位點(EP1666586A1)以及在其他位點(US7132270B2)的區(qū)域內的單個氨基酸通過定向誘變被其他氨基酸取代，或者通過插入來插入單個氨基酸(EP1367120A2)。此外，描述了各種突變的組合(EP1666586A1，US7132270B2)。另外，已經(jīng)描述了在sPQQGDH的一個位點插入兩個氨基酸的變體。然而，結果沒有獲得底物特異性的顯著改善(W02006085509)。
[0009]盡管存在這些結果，但仍然需要sPQQGDH的變體，因為至今還未描述過在與葡萄糖足夠高的反應性下能夠充分識別葡萄糖和其他糖的變體。這里重要的是，更特別地，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下，酶使葡萄糖濃度可靠地測定的能力。所描述的變體沒有充分地顯示這種性質。
【發(fā)明內容】

[0010]考慮到現(xiàn)有技術，因此本發(fā)明的目的是提供使可靠的葡萄糖測定成為可能的葡萄糖脫氫酶，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下。更特別地，本發(fā)明的目的是提供葡萄糖脫氫酶，使用該葡萄糖脫氫酶可以在麥芽糖的存在下可靠地測定葡萄糖。此外，本發(fā)明的目的是提供可以生產和鑒別這種葡萄糖脫氫酶的方法，在其他糖的存在下，更特別地在麥芽糖的存在下，該葡萄糖脫氫酶特別適合用于葡萄糖的測定。
[0011]現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在底物結合區(qū)域的范圍內插入3-5個氨基酸的sPQQ葡萄糖脫氫酶，與酶的原型相比顯示改善的葡萄糖特異性。
[0012]因此，本發(fā)明的主題是與酶的原型相比具有改善的葡萄糖特異性的sPQQ葡萄糖脫氫酶，其特征在于，在底物結合區(qū)域的范圍內插入3-5個氨基酸。
[0013]可以通過所述的天然存在的野生型菌株通過誘變獲得的基因編碼根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH,諸如醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) LMD 79.41 (K.KojimaK.等，Biotechnology Letters 22,1343-1347 (2000)),以及不動桿菌(Acinetobacter)屬的其他菌株(P.J.Bouvet P.J.和 0.Μ.Bouvet, Res.Microbiol.140 [8], 531-540(1989))，更特別地具有增強的熱穩(wěn)定性的那些，諸如在EP1623025A1中描述的不動桿菌屬菌株。優(yōu)選的菌株為EP1623025A1中描述的不動桿菌屬菌株PT16、K0Z62、K0Z65、PTN69、KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25 和 KGNlOO ;更特別優(yōu)選的是菌株 K0Z65。
[0014]為了能夠獲得根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH，密碼子必須插入到對應于適合這種方式的sPQQGDH基因中的底物結合位點的位置。許多sPQQGDH的空間結構是已知的并且儲存于公共數(shù)據(jù)庫中(A.0ubrie 等，J.Mol.Biol.289 [2]，319-333 (1999) ；A.0ubrie 等，EMBO J.18 [19] ,5187-5194 (1999))。因此，可以估算各個氨基酸位置與結合底物的距離。這種估算，例如，可能使用蛋白質的可視化程序，諸如由互聯(lián)網(wǎng)上可以獲得的軟件程序 Cn3D (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)。公開的 X-射線結構的序列是基于醋酸鈣不動桿菌的sPQQGDH，其長度為455個氨基酸。更優(yōu)選的來自菌株K0Z65的sPQQGDH的原型具有456個氨基酸，就像鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)的酶一樣。在兩種情況中，這樣的原因是由于位置289之后其他的谷氨酰胺殘基。以下是與更短的、在X-射線結構中所用的sPQQGDH序列有關的各個氨基酸位置的細節(jié)，所述sPQQGDH來源于菌株醋酸鈣不動桿菌LMD 79.41。據(jù)報道位于那里的氨基酸在該位置前面的氨基酸的單字母密碼中。
[0015]距離底物不大于5埃的氨基酸區(qū)域，諸如，例如，位置076、0143、0168、￥343和各自鄰近的氨基酸殘基，對于誘變而言是優(yōu)選的。因此，3個或更多個氨基酸的插入可以，例如，在一個特定的位置之前或之后出現(xiàn)，以便改變底物結合位點的空間結構。更優(yōu)選的是在位置Q168和L169之間的其他氨基酸的插入。在該位點具有插入的K0Z65的變體主要令人驚奇地表現(xiàn)出，與葡萄糖相比大比例的顯著降低的對麥芽糖的活性。特別優(yōu)選的是在位置Q168和L169之間具有表1所列的插入序列的sPQQGDH。作為比較，野生型顯示于第一行中。如表1所概述，根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH具有增加的底物特異性(更低的麥芽糖/葡萄糖比和葡萄糖/麥芽糖混合物中更低的葡萄糖干擾值)。
[0016]表1:
【權利要求】
1.可溶性吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(SPQQGDH)，其特征在于，與不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)的一種野生型菌株的sPQQGDH相比,其在底物結合區(qū)域的范圍內具有4-5個氨基酸的插入,其中基于野生型醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)LMD 79.41的序列，所述插入位點位于位置Q168與L169之間，并且其中所述插入選自由下列組成的組: 一具有4個氨基酸的插入，其中插入的氨基酸在位置I具有A或G，在位置2具有G、D或L，在位置3具有R或A，和在位置4具有M或V， 一具有5個氨基酸的插入,其中插入的氨基酸在位置I具有A、M、S或V,在位置2具有E、G或S，在位置3具有H、K、R、S或T，在位置4具有F、H、1、L、N、V或Y，和在位置5具有F、H、L、N、Q、T或 Y。
2.如權利要求1所述的sPQQGDH，其特征在于，插入位點距離底物結合區(qū)域不超過5埃。
3.如權利要求1-2中任一項所述的sPQQGDH，其特征在于，其通過誘變由PT16、K0Z62、Κ0Ζ65、ΡΤΝ69、KG106、ΡΤΝ26、ΡΤ15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGNlOO 系列的菌株產生。
4.如權利要求1至3中任一項所述的sPQQGDH，其具有選自系列SEQID 1-SEQ ID 18的插入序列。
5.基因，其編碼一種如權利要求1至4中任一項所述的蛋白質。
6.載體，其特征在于，其在插入位點的范圍內具有一個唯一的限制位點，以便可以在該位點插入編碼如權利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH的寡核苷酸序列。
7.如權利要求6所述的載體，其具有序列SEQID 27。
8.用于生產和鑒別如權利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH的方法，其特征在于，在第一步中生產在插入位點的范圍內具有唯一的限制位點的載體，在第二步中將多種不同的寡核苷酸序列插入載體中，在第三步中將這樣獲得的重組載體轉化到宿主細菌中并使細菌增殖，在第四步中篩選細菌產生的sPQQGDH，以便測定sPQQGDH對至少兩種不同的糖的單獨活性以及至少一種糖與至少另一種糖的干擾作用，和在第五步中選擇與未修飾的野生菌株的sPQQGDH相比具有改善的底物特異性的那些sPQQGDH。
9.葡萄糖傳感器，其包含權利要求1-4的sPQQGDH。
【文檔編號】C12N15/70GK103540572SQ201310472347
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2009年6月17日 優(yōu)先權日:2008年6月26日
【發(fā)明者】W.韋歇爾, V.莫爾勒, M.欣德勒, R.科克, R.梅斯基斯 申請人:拜耳知識產權有限責任公司