新型聚合酶底物:熒光可產(chǎn)生多聚磷酸末端標(biāo)記核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類(lèi)5'-末端磷酸熒光標(biāo)記的核苷酸，及其在核酸堿基序列測(cè)定方 法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在DNA聚合酶參與的DNA復(fù)制放大、核苷酸序列邊合成邊測(cè)定等應(yīng)用中，都涉及 到核苷酸分子的標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)，熒光標(biāo)記的核苷酸被充分運(yùn)用到DNA高通量測(cè)序技術(shù) 中，其中，標(biāo)記技術(shù)之一是將不同的熒光基團(tuán)通過(guò)可切斷長(zhǎng)鏈連接到核苷酸堿基的特定位 置上，在DNA完成識(shí)別并記錄熒光信號(hào)之后通過(guò)額外的化學(xué)手段去除該標(biāo)記基團(tuán)，進(jìn)而為 下一輪的核苷酸導(dǎo)入做準(zhǔn)備。該技術(shù)現(xiàn)已被illumina公司為代表的商業(yè)機(jī)構(gòu)發(fā)展成熟并 占據(jù)主要市場(chǎng)應(yīng)用地位（US7057026;7566537)。但這種在核苷酸堿基上進(jìn)行熒光標(biāo)記的 方式仍然存在一定的局限一每次化學(xué)切除標(biāo)記分子所存留的'分子疤痕'都造成新合成 的DNA分子在一定程度后不可避免的形態(tài)改變，阻止聚合酶分子的有效結(jié)合，從而影響測(cè) 序讀取長(zhǎng)度。因而，發(fā)展新的核苷酸標(biāo)記手段，進(jìn)而發(fā)展新的DNA高通量測(cè)序技術(shù)都是目 前市場(chǎng)需求和科學(xué)研宄追逐的熱點(diǎn)。相對(duì)于在核苷酸堿基上進(jìn)行的標(biāo)記的技術(shù)，對(duì)核苷酸 的5'-末端磷酸進(jìn)行標(biāo)記的技術(shù)也很早就應(yīng)用于生物化學(xué)和有關(guān)的生物技術(shù)研宄中。通 過(guò)在末端磷酸位置上引入不同功能的標(biāo)記物，可以幫助人們了解各種核苷酸參與的生理過(guò) 程。而在核苷酸末端磷酸上引入熒光標(biāo)記基團(tuán)，核酸聚合酶在識(shí)別并正確引入核苷酸后將 自動(dòng)切除剩余部分的磷酸基團(tuán)以及其末端帶有的熒光標(biāo)記物，從而保證新合成的DNA的自 然結(jié)構(gòu)，有利于聚合酶在長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)連續(xù)引入堿基的快速性和準(zhǔn)確性。這些潛在特點(diǎn)驅(qū)使著 人們將5'-末端磷酸標(biāo)記核苷酸應(yīng)用到諸如高通量DNA測(cè)序、單核苷酸多態(tài)性篩查等方面 的實(shí)際應(yīng)用中。然而，保證這些應(yīng)用的關(guān)鍵之處在于核苷酸的5'-磷酸末端引入熒光標(biāo) 記基團(tuán)后，該被標(biāo)記核苷酸能被DNA聚合酶順利的識(shí)別出來(lái)。2005年Sood等人的研宄已 經(jīng)證明（Sood，A.等J.Am.Chem.Soc. 2005,127, 2394)，將熒光標(biāo)記分子直接連接在三磷酸 脫氧核糖核苷酸（dNTP)的末端磷酸上并不是理想的標(biāo)記方式，因?yàn)橐环矫鏄?biāo)記上的熒光 基團(tuán)占用了磷酸鏈上的一個(gè)負(fù)電荷，減少了磷酸與DNA聚合酶催化中心金屬離子的結(jié)合能 力；另一方面，熒光基團(tuán)所造成的位阻效應(yīng)使得核苷酸不容易接近并進(jìn)入DNA聚合酶的活 性催化中心，從而減緩了DNA聚合酶對(duì)被標(biāo)記核苷酸分子的正確識(shí)別和反應(yīng)速率。因而，研 宄合成具有更長(zhǎng)磷酸鏈的末端磷酸熒光標(biāo)記核苷酸技術(shù)是人們研宄的目標(biāo)。
[0003] 在研宄長(zhǎng)鏈末端磷酸熒光標(biāo)記的方法中，有兩個(gè)不同的方向，其中一個(gè)方向是作 為標(biāo)記的熒光分子在DNA聚合酶作用前后的各種階段熒光性質(zhì)保持不變，因而可以使用長(zhǎng) 的化學(xué)惰性鏈接分子將熒光標(biāo)記物'錨定'在核苷酸的末端磷酸上，這一技術(shù)以Stephen W.Turner等人發(fā)展的末端磷酸標(biāo)記技術(shù)為代表（Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，2008, 27,1072-1083);盡管這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記分子遠(yuǎn)離聚合酶催化位點(diǎn)，但由 于不能體現(xiàn)聚合酶將核苷酸結(jié)合到新合成DNA上這一化學(xué)過(guò)程前后的熒光變化，因而只能 應(yīng)用于特定的場(chǎng)合。第二種技術(shù)，也就是本發(fā)明所討論的標(biāo)記技術(shù)，所標(biāo)記的熒光分子以共 價(jià)鍵直接與磷酸分子結(jié)合，并且在'結(jié)合'和'解離'兩個(gè)狀態(tài)下熒光分子的性質(zhì)呈現(xiàn)'關(guān) 閉'和'開(kāi)啟'兩個(gè)不同狀態(tài)，或者說(shuō)在熒光標(biāo)記分子處于與末端磷酸的結(jié)合狀態(tài)時(shí)其熒光 性質(zhì)處于淬滅狀態(tài)，不能被特定波長(zhǎng)的激發(fā)光所激發(fā)；而一旦被聚合酶和磷酸酶所釋放后 立即回到可激發(fā)狀態(tài)，從而給出熒光信號(hào)。這一特定的性質(zhì)為我們發(fā)展基于熒光信號(hào)產(chǎn)生 的諸如DNA堿基序列測(cè)定技術(shù)等應(yīng)用提供了前提。然后在聚合酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面，核苷酸 5' _磷酸末端熒光基團(tuán)的引入在一定程度上增加了核苷酸進(jìn)入聚合酶催化中心的位阻效 應(yīng)，從而影響了聚合酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，使得反應(yīng)與自然狀態(tài)核苷酸（未經(jīng)修飾的核苷 酸）相比速度變慢。另外被標(biāo)記核苷酸的背景熒光信號(hào)，即熒光基團(tuán)被釋放之前的熒光淬 滅程度，以及熒光基團(tuán)釋放之后的熒光強(qiáng)度（消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積），熒光性質(zhì)（吸 收/發(fā)射波長(zhǎng)），都受所選擇的熒光基團(tuán)直接影響。
[0004] 針對(duì)這些存在的問(wèn)題，本發(fā)明采用新穎的熒光染料來(lái)解決被標(biāo)記的核苷酸的熒 光背景以及釋放后熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度和熒光性質(zhì)問(wèn)題。另一方面，本發(fā)明在不同長(zhǎng) 度多聚磷酸鏈的合成方面采用了新的方法，以解決標(biāo)記分子與聚合酶催化活性中心之 間的位阻問(wèn)題。在磷酸鏈的合成方面，ShivKumar等作了有益的探索（Nucleosides， Nucleotides&NucleicAcids，2005, 24,401 ;)，但仍然存在合成方法不直接、難以合成長(zhǎng)磷 酸鏈（例如多于五個(gè)磷酸）。因而，本發(fā)明公開(kāi)了新的合成具有不同長(zhǎng)度多聚磷酸鏈的末端 標(biāo)記核苷酸分子的方法，并通過(guò)采用吸光系數(shù)和量子產(chǎn)率高，淬滅效果好，激發(fā)波長(zhǎng)適合核 苷酸序列測(cè)定應(yīng)用的熒光分子來(lái)實(shí)現(xiàn)這一類(lèi)具有熒光可產(chǎn)生性質(zhì)的末端磷酸標(biāo)記核苷酸 的實(shí)際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一類(lèi)5'-末端磷酸熒光標(biāo)記的核苷酸，提供了分子結(jié)構(gòu)及合成方法。 該類(lèi)分子可以更好地被DNA聚合酶所識(shí)別，并且在被聚合酶識(shí)別并正確結(jié)合之后在堿性 磷酸酶協(xié)助下實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)由關(guān)閉向開(kāi)啟狀態(tài)的快速轉(zhuǎn)變，從而作為聚合酶底物可以被應(yīng) 用于核酸序列測(cè)定等領(lǐng)域中。本案中具體的熒光分子的合成方法在申請(qǐng)人申請(qǐng)的專(zhuān)利CN 201510155218. 9中有更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0006] 本發(fā)明提供一種末端磷酸熒光標(biāo)記的核苷酸結(jié)構(gòu)，其特征在于：具有如下通式 (1)所示結(jié)構(gòu)，
[0007]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種末端磷酸熒光標(biāo)記的核苷酸結(jié)構(gòu)，其特征在于：具有如下通式（1)所示結(jié)構(gòu)，
其中Ra，Rb可以獨(dú)立的選自-H，-OH;n為大于等于1，并且小于等于5的整數(shù)； 其中，通式（1)中的熒光基團(tuán)具備下面通式（2)所述結(jié)構(gòu)，
其中，通式（2)中Ri，R5可獨(dú)立的選自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、取代 的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基； ^…札^可以獨(dú)立的選自-瓜氟~氯:溴~芳基~取代芳基~雜芳基廠⑶辦-⑶木、03H、-S03R、-CH2C02H、-CH2C02R、-CH2S03H、-CH2S03R、-CH2NH2、-CH2NHR、-N02、C1-C6 烷基、取代的 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基 芳基、苯基、取代苯基、聯(lián)苯基、取代聯(lián)苯基、芐基、取代芐基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其中 R選自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基 芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、聯(lián)