專利名稱：一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人α-乳清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人 a-乳清白蛋白的方法。
背景技術(shù)：
a-乳清白蛋白是哺乳動(dòng)物乳腺中特異表達(dá)的一種蛋白，其主要生理功能 是改變卩-l,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的底物特異性，促進(jìn)乳糖的合成，從而調(diào)節(jié)乳中 的滲透壓。oi-乳清白蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有人體營(yíng)養(yǎng)所需要的各種 必須氨基酸(必須氨基酸的含量占氨基酸組成的63%)，其中半胱氨酸、色氨 酸、異亮氨酸和亮氨酸含量豐富。半胱氨酸是體內(nèi)抗氧化劑谷胱酐肽的一種 前體，有利于體內(nèi)自由基的清除；色氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的合成前體，
可以促進(jìn)嬰兒的神經(jīng)發(fā)育和改善睡眠質(zhì)量；異亮氨酸和亮氨酸屬于支鏈氨基 酸，能促進(jìn)肌肉中蛋白質(zhì)的合成。同時(shí)，來(lái)源于人(x-乳清白蛋白的生物活性 肽，具有抑菌功效，并能提高機(jī)體的免疫力。因而a-乳清白蛋白成為配方奶 粉和各種功能性食品的主要原料。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，人a-乳清白蛋白多聚 體或結(jié)構(gòu)變異體能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，是一種潛在的 新型抗腫瘤藥物，臨床試驗(yàn)表明人a-乳清白蛋白結(jié)構(gòu)變異體可以有效地治療 乳頭瘤狀病毒感染導(dǎo)致的皮膚疣。
鑒于人ct-乳清白蛋白的重要性，需要獲得大量高純度的人ct-乳清白蛋白 以進(jìn)行功能研究，并滿足功能性食品和臨床藥物開(kāi)發(fā)的需要。從人乳中獲得 這種蛋白遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。牛乳腺是天然的大型生物反應(yīng)器，利用轉(zhuǎn)基因 克隆技術(shù)，在牛乳腺中重組表達(dá)具有生物活性的轉(zhuǎn)基因人a-乳清白蛋白成為 理想的選擇。
由于牛乳中含有內(nèi)源的a-乳清白蛋白，為重組蛋白的后繼純化帶來(lái)挑戰(zhàn)。 目前，用于分離、純化天然的a-乳清白蛋白的方法可分為三類'.根據(jù)蛋白質(zhì) 的理化特性進(jìn)行選擇性沉淀；利用蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行膜過(guò)濾；與特定介
質(zhì)的選擇性吸附和洗脫。前兩類方法只能對(duì)牛乳中的蛋白質(zhì)進(jìn)行粗分離，且
回收率低，不能獲得高純度的a-乳清白蛋白。第三類是比較常用的分離乳中
特定蛋白質(zhì)的方法，主要包括親合層析、離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜、疏 水互作色譜等。
用親合層析純化ct-乳清白蛋白，主要是利用a-乳清白蛋白的鈣離子結(jié)合
特性，選擇性吸附乳中鈣離子結(jié)合蛋白，配合凝膠過(guò)濾層析，能夠提高蛋白
的純度；陰離子交換色譜純化a-乳清白蛋白是當(dāng)前較為常用的蛋白純化技術(shù)， 具有純化成本低、色譜柱載樣量不受樣品體積限制、純化工藝容易放大等優(yōu) 點(diǎn)；疏水互作色譜需要使用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，易使目的蛋白質(zhì)變性，失去 生物活性，因而很少采用。
轉(zhuǎn)基因牛乳中表達(dá)的重組人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白具有相似的 理化特征，例如相近的分子量(人a-乳清白蛋白為14,070 Da,牛a-乳清白蛋 白為14,178 Da)和相似的等電點(diǎn)(pH4.2-4.6),目前的純化方法不能有效 的將二者分離。要獲得高純度的重組人a-乳清白蛋白，就必須對(duì)現(xiàn)有的純化 方法進(jìn)行優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人a-乳清白蛋白的方法。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人a-乳清白蛋白的方法，它 包括如下步驟
(1) 用超速離心沉淀轉(zhuǎn)基因牛乳中的酪蛋白，并脫脂，獲得含有重組人 a-乳清白蛋白的乳清；
(2) 將獲得的乳清用50 mM Tris-HCl稀釋平衡，采用陰離子交換色譜 進(jìn)行第一步純化先用50mMTris-HCl的緩沖液將沒(méi)有與色譜柱上的載體介
質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫，再用50 mM Tris-HCl + 1 MNaCl的緩沖液進(jìn)行分步梯 度洗脫，分步梯度洗脫的操作為先用50 mM Tris-HCl + 0.05 MNaCl直接洗 脫，再用50 mM Tris-HCl+ 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脫。收集各個(gè)洗脫峰， 采用15%的Native-PAGE電泳法(具體操作參見(jiàn)《分子克隆》第三版，科學(xué) 出版社，2002年8月出版)檢測(cè)重組人a-乳清白蛋白，結(jié)果分步梯度洗脫時(shí) 用50 mM Tris-HCl + 0.05 M NaCl直接洗脫得到的洗脫峰組分中含有重組人 a-乳清白蛋白，而用50 mM Tris-HCl + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脫得到的洗 脫峰組分中含有轉(zhuǎn)基因牛乳的內(nèi)源cx-乳清白蛋白和(3-乳球蛋白。
本步的原理是根據(jù)多次蛋白純化條件的摸索，發(fā)現(xiàn)在pH值接近中性 的緩沖液中，重組人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白與陰離子交換介質(zhì)結(jié)合 能力存在一定的差別，用低離子濃度NaCl可以先將重組人a-乳清白蛋白從 色譜柱上洗脫，從而與內(nèi)源a-乳清白蛋白分離。
(3)收集含有重組人a-乳清白蛋白的組分，濃縮，釆用凝膠過(guò)濾色譜進(jìn) 行第二步純化首先用50 mM Tris-HCl + 0.1 M NaCl緩沖液平衡凝膠過(guò)濾色 譜柱，再用50 mM Tris-HCl+ 0.1 MNaCl作為洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集各 個(gè)洗脫峰，采用15%的Native-PAGE電泳法檢測(cè)組分為重組人a-乳清白蛋白 的洗脫峰，從而得到純化的重組人a-乳清白蛋白。
本步的原理是采用凝膠過(guò)濾色譜根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小分離各種蛋白成分。
在本發(fā)明所述的方法中，步驟(2)中洗脫的流速是60cm/h,步驟(3) 中洗脫的流速是30 cm/h。所用的Tris-HCl緩沖液的pH均是7.4。 本發(fā)明所述的方法可以用于從轉(zhuǎn)基因家畜乳中分離轉(zhuǎn)基因蛋白。 (三)有益效果
本發(fā)明提供的從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人a-乳清白蛋白的方法，采用了 兩步液相色譜分離純化法，可以有效的將轉(zhuǎn)基因牛乳中表達(dá)的重組人a-乳清 白蛋白與牛乳中的其它蛋白分離，避免了牛內(nèi)源性(x-乳清白蛋白的污染，得 到的目的蛋白純度達(dá)到99.9%以上。將該方法按比例放大，可用于工業(yè)化生 產(chǎn)。
采用本發(fā)明所述方法得到的重組人a-乳清白蛋白，保持了 a-乳清白蛋白 完整的生物活性，具有與天然的人a-乳清白蛋白相似的空間結(jié)構(gòu)。
不僅如此，由于在整個(gè)純化過(guò)程中所使用的緩沖液成分簡(jiǎn)單，避免了大 量鹽分的使用，從而有效降低了純化成本，并減少了廢液對(duì)環(huán)境的污染。


圖l是轉(zhuǎn)基因牛乳中重組人a-乳清白蛋白陰離子交換純化色譜圖，其中 箭頭表示含有重組人a-乳清白蛋白的色譜峰；
圖2是15%Native-PAGE檢測(cè)陰離子交換色譜純化結(jié)果，其中方框內(nèi)表 示含有重組人a-乳清白蛋白分離組分的電泳結(jié)果；
圖3是轉(zhuǎn)基因牛乳中重組人a-乳清白蛋白凝膠過(guò)濾純化色譜圖，其中箭 頭表示重組人a-乳清白蛋白色譜分離峰；
圖4是15。/。Native-PAGE檢測(cè)凝膠過(guò)濾色譜純化結(jié)果，其中橢圓內(nèi)所示 純化后的重組人a-乳清白蛋白；
圖5是純化的重組人a-乳清白蛋白15% Native-PAGE和Westem-Blot檢 測(cè)圖6是15。/。SDS-PAGESYPRORuby蛋白染色檢測(cè)重組人a-乳清白蛋白 純度，其中，Sl、 S2、 S3代表純化的重組人(x-乳清白蛋白，并以人天然cc-乳清白蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，whey為轉(zhuǎn)基因牛乳清；
圖7是重組人oc-乳清白蛋白結(jié)合鈣離子的電泳遷移率圖，其中，從左往 右數(shù)，泳道3-8代表重組人a-乳清白蛋白，泳道l、 2代表人天然的a-乳清白 蛋白，9、 10為牛a-乳清白蛋白對(duì)照；
圖8是重組人(x-乳清白蛋白合成乳糖能力檢測(cè)結(jié)果圖，其中，XW、 LW、 HW代表重組人a-乳清白蛋白，Sl、 S2、 S3代表天然的人a-乳清白蛋白。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所用的主要試驗(yàn)儀器與試劑如下
AKTApurifierlO快速蛋白液相層析系統(tǒng)、陰離子交換色譜柱HiLoad 16/10 Q Sepharose high performance,凝膠過(guò)濾色譜柱HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade購(gòu)自Amersham Pharmcia;超速離心機(jī)LT-65購(gòu)自Beckman; mini-Protean II蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；超濾濃縮管Amicon Ultra-15，購(gòu)自Millipore; SYPRO Ruby蛋白染色試劑購(gòu)自Invitrogen;乳糖 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)r-Biopharm,人、牛a-乳清白蛋白純品購(gòu)自Sigma公司， 兔抗人a-乳清白蛋白抗血清購(gòu)自美國(guó)Nordic Immunological Laboratory,奶牛 催乳針劑購(gòu)自國(guó)營(yíng)西安草灘制藥廠，其它藥品非特殊注明均為國(guó)產(chǎn)分析純或 進(jìn)口分裝。
實(shí)施例1 從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人a-乳清白蛋白
1.1轉(zhuǎn)基因乳清的獲得
給6-8月齡的轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白的奶牛注射不孕奶牛催乳針，使其產(chǎn)奶， 注射方法如下連續(xù)肌肉注射I號(hào)針10天，每天一次，劑量為該試劑說(shuō)明書 推薦的1/4; 1I號(hào)針在第13、 15、 17天各注射一支。從注射7天開(kāi)始每天溫 水按摩乳房，n號(hào)針注射完畢后開(kāi)始人工擠乳兩周，每天兩次，收集乳樣， 立即置于-20'C冰箱凍存?zhèn)溆?。將凍存的轉(zhuǎn)基因牛乳充分解凍，使蛋白質(zhì)全部 溶解。用超速離心機(jī)在20。C， 90,000 x g離心1小時(shí)，棄去最上層的乳脂肪 和沉淀的酪蛋白，小心吸取中層的乳清。用50mMTris-HCl (pH7.4)稀釋， 0.45pm微孔濾膜過(guò)濾。 1.2采用陰離子交換色譜進(jìn)行第一步純化
用于色譜純化的所有溶液都用分析純藥品和Millipore水配制，并經(jīng)過(guò) 0.22(im濾膜過(guò)濾和脫氣處理，蛋白純化操作在室溫進(jìn)行。
取10 ml稀釋的乳清加入到快速蛋白液相層析系統(tǒng)的加樣杯中，陰離子 交換色譜柱先用50mMTris-HCl (pH7.4)平衡5個(gè)柱體積，之后開(kāi)始進(jìn)樣。 用50mMTris-HCl(pH7.4)洗2個(gè)柱體積，將未與柱載體介質(zhì)結(jié)合的蛋白洗
掉；繼而采用分步梯度洗脫(segmentgradient)的方法，先用50mMTris-HCl (pH7.4) +0.05MNaCl洗脫，直至基線趨于平穩(wěn)，接著用50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脫，線性流速60 cm/h。收集各個(gè)洗脫 峰，用15。/。的Native-PAGE電泳檢測(cè)重組人a-乳清白蛋白。陰離子交換色譜 圖如圖1所示，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)圖1中箭頭所指的洗脫峰含 有重組人a-乳清白蛋白。 1.3采用凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行第二步純化
用超濾管(最小蛋白質(zhì)截留分子量為5,000 kD)將上述含有重組人a-乳 清白蛋白的組分濃縮，加到快速蛋白質(zhì)液相層析系統(tǒng)的加樣杯內(nèi)。用2倍柱 體積的50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + 0.1 MNaCl緩沖液平衡凝膠過(guò)濾色譜柱， 開(kāi)始進(jìn)樣，1.5倍柱體積的50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + O.lMNaCl緩沖液洗 脫，收集洗脫峰，用15。/。的Native-PAGE電泳檢測(cè)重組人a-乳清白蛋白。蛋 白質(zhì)分離的色譜圖如圖3所示，電泳結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)圖3中箭頭所指 的洗脫峰為重組人a-乳清白蛋白。這樣就得到了純化的重組人a-乳清白蛋白。
實(shí)施例2WestemBlot鑒定純化的蛋白
為了確證純化的蛋白為重組人a-乳清白蛋白，將純化的蛋白用15%的 Native-PAGE電泳分離，并用人和牛的a-乳清白蛋白純品作為對(duì)照，進(jìn)行 Western Blot鑒定。結(jié)果如圖5所示，表明純化的蛋白Sl、 S2、 S3確為重組 表達(dá)的人a-乳清白蛋白。
實(shí)施例3重組人a-乳清白蛋白純度檢測(cè)
為了鑒定用此方法分離的重組人a-乳清白蛋白純度，將純化的蛋白用15%的 SDS-PAGE電泳分離。凝膠染色用SYPRORuby染色試劑進(jìn)行染色，該染色 劑為熒光染料，靈敏度達(dá)到每條帶lng。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，表明蛋白的 純度至少為99.9%。
實(shí)施例4重組蛋白的鈣離子結(jié)合實(shí)驗(yàn)
(x-乳清白蛋白是鈣離子結(jié)合蛋白，鈣離子的結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是 必須的。通過(guò)非變性凝膠電泳分離，可以觀察到結(jié)合鈣離子后，重組蛋白電 泳遷移率與天然蛋白相似，從而間接驗(yàn)證重組蛋白是否與天然蛋白具有相似
的空間構(gòu)象。結(jié)果如圖7所示，圖中l(wèi)、 3、 5、 7、 9分別加入10mMCaCl2， 2、 4、 6、 8、 IO分別加入10mMEGTA, 1、 2為人a-乳清白蛋白純品對(duì)照， 9、 10為牛a-乳清白蛋白純品對(duì)照。從圖中可以看出重組蛋白與天然蛋白具 有相似的電泳遷移率，表明重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)與天然蛋白相似。
實(shí)施例5重組人a-乳清白蛋白生物活性檢測(cè)
a-乳清白蛋白可以改變p-l，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶底物的特異性，使乳糖能在 生理?xiàng)l件合成。在缺乏a-乳清白蛋白的情況下，卩-l,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶催化 UDP-半乳糖與N-乙酰葡萄胺結(jié)合，合成N-乙酰乳糖胺和UDP，化學(xué)反應(yīng)式如 下
UDP陽(yáng)galaGtose + N-acety1—D-glucosamine — N陽(yáng)acetyllaGtosamine + UDP。 而加入(x-乳清白蛋白后，可以提高P-l,4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶對(duì)葡萄糖的底物 結(jié)合能力，化學(xué)反應(yīng)式為UDP-D-galactose + D-glucose — lactose+ UDP。
為了鑒定重組的人a-乳清白蛋白是否具有此活性，進(jìn)行體外驗(yàn)證。在此 反應(yīng)體系下100^1溶液中加入5.78mUGTase, 50mM Hepes (pH6.63), 0.0245% Triton X-IOO， 0.0245% BSA, 9 mM MnC12， 25 mM Glucose, 0.4 mM UDP-Galactose, 10^1重組a-乳清白蛋白，37'C反應(yīng)2小時(shí)，合成乳糖。用乳 糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳糖的合成。結(jié)果如圖8所示，重組蛋白同樣可以合成乳 糖，說(shuō)明利用此純化方法并不影響重組a-乳清白蛋白的生物活性。
權(quán)利要求
1、一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人α-乳清白蛋白的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)用超速離心沉淀轉(zhuǎn)基因牛乳中的酪蛋白，并脫脂，獲得含有重組人α-乳清白蛋白的乳清；(2)將獲得的乳清用50mM Tris-HCl稀釋平衡，采用陰離子交換色譜進(jìn)行第一步純化先用50mM Tris-HCl的緩沖液將沒(méi)有與色譜柱上的載體介質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫，再用50mM Tris-HCl+1 M NaCl的緩沖液進(jìn)行分步梯度洗脫，收集各個(gè)洗脫峰，檢測(cè)重組人α-乳清白蛋白；(3)收集含有重組人α-乳清白蛋白的組分，濃縮，采用凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行第二步純化首先用50mM Tris-HCl+0.1 M NaCl緩沖液平衡凝膠過(guò)濾色譜柱，再用50mM Tris-HCl+0.1M NaCl作為洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集各個(gè)洗脫峰，檢測(cè)重組人α-乳清白蛋白，得到純化的重組人α-乳清白蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的分步梯度 洗脫為先用50mMTris-HCl + 0.05MNaCl直接洗脫，再用50mMTris-HCl + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脫。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中洗脫的流速是 60 cm/h。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中洗脫的流速是 30 cm/h。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用的Tris-HCl緩沖液的 pH均是7.4。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于檢測(cè)重組人a-乳清白蛋白釆 用15%的Native-PAGE電泳法。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l-6之任一項(xiàng)所述的方法在從轉(zhuǎn)基因家畜乳中分離轉(zhuǎn) 基因蛋白上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人α-乳清白蛋白的方法，它采用了兩步液相色譜分離純化法。該方法可以有效的將轉(zhuǎn)基因牛乳中表達(dá)的重組人α-乳清白蛋白與牛乳中的其它蛋白分離，避免了牛內(nèi)源性α-乳清白蛋白的污染，得到的目的蛋白純度達(dá)到99.9％以上。將該方法按比例放大，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明所述方法得到的重組人α-乳清白蛋白，保持了α-乳清白蛋白完整的生物活性。而且整個(gè)純化過(guò)程中所使用的緩沖液成分簡(jiǎn)單，有效降低了純化成本，并減少了廢液對(duì)環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)C07K14/76GK101104635SQ20071010203
公開(kāi)日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者寧 李, 楊鵬華, 波 湯, 王建武 申請(qǐng)人:北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司;李 寧