專利名稱：保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地涉及一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo) 記及其分析方法。
技術(shù)背景DNA分子標(biāo)記是新興的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠從DNA水平直接反映生物的 遺傳本質(zhì)，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、不受季節(jié)、環(huán)境影響、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單迅 速等多種優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記已經(jīng)成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于生物遺 傳多態(tài)性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、親緣關(guān)系分 析、性別鑒定、基因組作圖、基因克隆、文庫(kù)構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種 等等多個(gè)方面，促進(jìn)了農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)，以及醫(yī)學(xué)包括法醫(yī)學(xué)等方面的快 速發(fā)展。1980年，分子標(biāo)記RFUP (Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Botstein D， White R L， Skolnick M, Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Gene-ties, 1980, 32:314 331)以文獻(xiàn)報(bào)道形式出現(xiàn)。由于核苷酸序列的改變 遍及整個(gè)基因組，遺傳標(biāo)記的數(shù)量已不再成為限制因素，其優(yōu)點(diǎn)明顯超過經(jīng)典 的蛋白質(zhì)多態(tài)性，從此開創(chuàng)了利用DNA多態(tài)性進(jìn)行分子標(biāo)記的新階段。但是 RFLP的缺點(diǎn)也很明顯必須經(jīng)過酶切和DNA雜交，因此，DNA需要量大，檢 測(cè)技術(shù)繁雜，難以大范圍推廣使用，開發(fā)新的分子標(biāo)記技術(shù)勢(shì)在必行。1990 年，美國(guó)杜邦公司的科學(xué)家Williams (Williams J G K， Kubelik A R， Livak K J， et al. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers [J]. Nucl Acid Res. 1990, 18: 6531-6535 )和加利 福尼亞生物研究所Welsh (Welsh丄McClelland M， Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 1990， 18(24) :7213 7218 )分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)將PCR 技術(shù)應(yīng)用于分子標(biāo)記，發(fā)展出一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)RAPD( random amplified polymorphic DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)。 RAPD技術(shù)快速、簡(jiǎn)便， 成本低廉。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷RAPD為顯 性標(biāo)記，不能提供完整的信息；易受實(shí)驗(yàn)條件影響；穩(wěn)定性差；結(jié)果不能區(qū) 分純合體和雜合體。1989年，Tautz提出了SSR (Simple Sequence R印eat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)，Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers [J]. N ucleic Aci ds Research ，1989 ，17 :6463 647U)，又稱微衛(wèi)星DNA (Microsatelite DNA(Xitt and Luty 1989， Litt M， LutyJA. A hypervariable microsatellite revealed by in vit2ro amplification of dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. A merican Journal of Human Genetics ， 1989 ， 44 :397 40U)。 SSR標(biāo)記是利用其兩端特定的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后凝膠電泳，數(shù)據(jù)分析。該技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，DNA 用量少，重復(fù)性高。但她的開發(fā)和合成新的SSR引物投入高、難度大，必須 有大量的前期工作。1991年Moore等(Moore SS， Sargeant LL， King TJ， et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species [J]. Genomics, 1991,10: 654 660 )創(chuàng)立了 SSR即微衛(wèi) 星DNA分子標(biāo)記。SSR分布廣、多態(tài)性豐富，但前期開發(fā)及合成SSR引物投入 高、難度大。SSR標(biāo)記往往遠(yuǎn)離功能基因，對(duì)研究功能基因不利。由于SSR突 變率高，開發(fā)出來的引物不能通用。1992年，荷蘭學(xué)者Zabeau Marc和Vos Pieter (VosP， Hogers R， BleekerMetal. AFLP:a new technique for DNA finger printing .Nucleic Acids Research, 1995， 21: 4407 4414) t巴RAPD和RFLP 技術(shù)結(jié)合起來，發(fā)明了新的分子標(biāo)記AFLP技術(shù)(amplified fragment length ploymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)，1993年獲歐洲專利局專利，專利號(hào)為 EP0534858A1 ( Zabeau M， Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Office Publication 1993， 0535858AI.)。該技術(shù)快速、高效，分辨率 高、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化，很快被推廣到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。但也存在明 顯的缺點(diǎn)技術(shù)繁瑣；過程時(shí)間長(zhǎng)；檢測(cè)的不是等位片段；費(fèi)用昂貴；AFLP 標(biāo)記是顯性標(biāo)記，不能提供完整信息。另外，它常常使用放射性同位素，假 陽(yáng)性頻繁。1995年，Umethara等(UmetharaY， Inagaki A， Tanou H， Yasukochi Y， Nagamura Y， Saji S， 0tsuki Y， Fujimura T, Kurata N， Minobe Y， Construction and characterization of rice YAC library for physical mapping. Molecular Breeding, 1995,1， 79 - 89)用cDNA作為探針構(gòu)建水 稻染色體的物理圖譜，該標(biāo)記是一種EST標(biāo)記。2001年，Schubert等(Schubert R， Starck GM， Riegel R (2001) Development of EST-PCR markers and monitoring their intra populational genetic variation in Picea abies (L.) Karst. Theoretical and Applied Genetics, 103， 1223 - 1231)應(yīng)用 EST-PCR分子標(biāo)記進(jìn)行了歐洲云杉基因變異的研究。但EST的高度的保守性造成其多態(tài)性極低，難以大量應(yīng)用。1996年，美國(guó)MIT的科學(xué)家Lander (Lander E S. The new genomics: Global views of biology. Science, 1996,274:536 539)提出了SNP (single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)。SNP 數(shù)量極多，其遺傳穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于SSR，可以進(jìn)行快速、規(guī)?；Y査，易于基因 分型。和SSR —樣，SNP也需要前期工作基礎(chǔ)，制作一個(gè)SNP圖需要多個(gè)SNP， 且難以確定哪個(gè)SNP出錯(cuò)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分析。2001年，美國(guó)加州大學(xué) 的 Li 與 Quiros ( Li G，Quiros C F. Sequence—related amplified polymorphism (SRAP)，A new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Bmssica. Theor Appl Genet, 2001， 103:455 461 ) 發(fā)表了 一種新型分子標(biāo)記 SRAP(sequence—related amplified polymorphism,相關(guān)序歹(JI廣增多態(tài)'性)， 又口L] SBAPsequence-based amplified polymorphism,基于序歹lj擴(kuò)增多態(tài)性)。 2003年，美國(guó)農(nóng)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu與Vick (Hu J， Vick BA. Target region amplification polymorphism, .a novel marker technique for plant genotyping. Plant Mol Biol R印.2003， 21,289-294)在SRAP的基礎(chǔ)上又 提出了 TRAP分子標(biāo)記，TRAP的一個(gè)引物直接應(yīng)用SRAP，另一個(gè)根據(jù)EST設(shè) 計(jì)。TRAP和SRAP的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)量中等、條帶易于分離及可測(cè)序， 操作過程簡(jiǎn)單，不須使用同位素。但這二種技術(shù)存在一個(gè)共同缺陷PCR的起 始退火溫度過低，假陽(yáng)性率太高。除第一個(gè)分子標(biāo)記RFLP是基于DNA Southern 雜交技術(shù)外，后來發(fā)展的分子標(biāo)記基于PCR技術(shù)，他們的技術(shù)核心是引物的 設(shè)計(jì)。從上述情況可以看到，分子標(biāo)記的研究不斷有文獻(xiàn)報(bào)道，特別是90年代 以來，發(fā)展十分迅速。 一般來說，后來的研究都吸收了前者的優(yōu)點(diǎn)而克服了 他們的不足，使之不斷優(yōu)化，但現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)缺陷仍然十分明顯。因 此，開發(fā)更加簡(jiǎn)便、實(shí)用、重復(fù)性好的新分子標(biāo)記技術(shù)十分必要。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)量中等、穩(wěn) 定性高、重復(fù)性好的一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，是根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST和內(nèi)含子 的保守序列設(shè)計(jì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。而且，所述的引物包括固定引物和隨機(jī)引物，該固定引物根據(jù)目標(biāo)EST 設(shè)計(jì)，該隨機(jī)引物的核心序列為CACGC。而且，所述的固定引物的其序列如下El: 5，ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606E2: 5 ，TATCTTGACCAGGCGAGACCT 3 V CV171卯4 。而且，所述的隨機(jī)引物的序列如下Cl: 5，GACTGCGTACGCACGCTGA3， C2: 5， GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5， GACTGCGTACGCACGC AAC3，。一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記的分析方法，其分析方法包括以下步驟(1) .設(shè)計(jì)固定引物和隨機(jī)引物；(2) .合成引物應(yīng)用DNA合成儀合成設(shè)計(jì)好的引物；(3) . DNA提?。?4) .PCR擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的引物和提取的DN模板，選擇反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行PCR;(5) .擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(6) .數(shù)據(jù)的采集與分析非熒光標(biāo)記引物銀染以顯示擴(kuò)增條帶，將條帶進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)，用于數(shù)據(jù)分析；熒光標(biāo)記引物直接在共聚焦熒光掃描儀上掃描檢測(cè)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。而且，所述的隨機(jī)引物和固定引物的組合為 C1/E1, Cl/E2; C2/E1, C2/E2; C3/E1, C3/E2。而且，所述的隨機(jī)引物和固定引物可以應(yīng)用熒光標(biāo)記。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是1. 本發(fā)明的分子標(biāo)記CRAP簡(jiǎn)單高效、擴(kuò)增條帶量中等；同時(shí)，因?yàn)镃RAP 的退火溫度始終為PCR的正常溫度，其可靠性和重復(fù)性較前二者增高。因?yàn)?CRAP的核心序列為內(nèi)含子的高度保守區(qū)域，其與內(nèi)含子位點(diǎn)的匹配率提高。 而且應(yīng)用了特定基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，可以直接研究基因內(nèi)多態(tài)性。2. 本發(fā)明通過引物設(shè)計(jì)，保留了上述最新形成的分子標(biāo)記SRAP和TRAP技 術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，克服了他們的缺陷，除具備操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)量中等、條帶易于分離 及可測(cè)序，不須使用同位素等優(yōu)點(diǎn)之外，還具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。 可用于研究植物、動(dòng)物、人類以及微生物的遺傳多態(tài)性分析、種質(zhì)資源鑒定、 基因定位、親緣關(guān)系分析和分子標(biāo)記輔助選擇育種等等。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一歩詳述，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定 性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。 不同產(chǎn)地丹參種群間的遺傳一致性及遺傳距離研究1. 實(shí)驗(yàn)材料:河南、四川、陜西和江蘇丹參的根。2. 實(shí)驗(yàn)儀器低溫高速離心機(jī)(SIGMA 3K30)、超低溫冰箱(SANYO UltraLow)、水浴箱(RB-200型)、超凈工作臺(tái)(天津市醫(yī)藥凈化設(shè)備廠)、752分 光光度儀(上海第三分析儀器廠)、電泳儀(Model 4000 Power supply Life Techenologies Ins USA)、電泳圖象分析系統(tǒng)(Kodak EDAS290) 、 DNA擴(kuò)增儀 (PE 9600)、旋渦混合器、微型高速離心機(jī)、水平電泳儀3. 試劑:CTAB、 Tris-HCL(PH 8.0)、 EDTA、 巰基乙醇、NaCL、 NH4Ac、 (Promega Corp.聯(lián)星公司分裝)、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、瓊脂糖、Tris飽和酚、RNA酶、冰乙酸，Spfu-DNA Polymerase (賽百盛公司)。植物基因組 DNA快速提取試劑盒(鼎國(guó)公司)，dNTPS ， Acrylamiole， bis， IOXTBE，TEMED， 10% Ammonium Persulfate4. 實(shí)驗(yàn)方法 4. 1 DNA提取(1) .準(zhǔn)備工作恒溫水浴箱調(diào)節(jié)至65t預(yù)熱、低溫高速離心機(jī)調(diào)節(jié)至4('C 預(yù)冷，小型食品加工機(jī)取出接通電源，將其研磨杯連同底座-2(y'C預(yù)冷10min，。(2) .打開液氮罐，先取出極少量液氮放入研磨杯中再次預(yù)冷使其溫度更 低。然后取出丹參根，立即置于研磨杯中，再加入少量液氮，液氮快揮發(fā)完 時(shí)迅速擰緊底座(過早擰上底座易爆炸！)，放在主機(jī)上，用力一按，主機(jī)轉(zhuǎn) 動(dòng)，打碎丹參標(biāo)本。(3) .用預(yù)冷過的小匙將打碎的丹參標(biāo)本轉(zhuǎn)入勻漿器中，迅速加入CTAB提 取液，勻漿。(4) .勻漿后轉(zhuǎn)入1. 5ml印pendorf管中，每管800ul。置于65。C水浴箱中， 裂解30min。(5) .取出冷卻至室溫，加入Tris飽和酚:氯仿(1:1) 800ul，混勻，室溫 放置5min。(6) . 12000gpm，離心15min。OO.取上清，加入氯仿600ul混勻，12000gpm，離心10min。(8) .取上清，加入異丙醇700ul混勻，-20°C，沉淀30min。(9) . 12000g，離心15分鐘，棄去異丙醇。短暫離心，微量移液器吸取剩 余異丙醇，涼干。卿.加入TE 50ul， RNAse 3ul，吹打混勻，37°C，消化lh。 (11).加300ul無(wú)水乙醇，-20°C，沉淀5min， 12000g，離心10min，棄去 乙醇。d2).加75。/。乙醇800ul，腦0g，離心3min，棄去乙醇。再短暫離心，用 微量移液器吸取剩余乙醇，涼干。(13) .加入TE30ul溶解DNA。(14) .檢測(cè)其完整性及純度。4.2引物設(shè)計(jì)(1) .固定引物的設(shè)計(jì)a.在丹參的EST數(shù)據(jù)庫(kù)査找到丹參素生物合成相關(guān) 的苯丙醇(phenylpropanol)代謝途徑目標(biāo)序列為CV171606和CV171904;b.將 這2個(gè)序列調(diào)入PCR引物設(shè)計(jì)軟件oligo6. O;c.根據(jù)軟件提示，分別設(shè)置參數(shù);d. 從軟件產(chǎn)生的引物中，任選1個(gè)引物作為固定引物。其序列及NCB燈陸號(hào)如下El: 5，ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5，TATCTTGACCAGGCGAGACCT 3，/ CV171904(2) .隨機(jī)引物的設(shè)計(jì)隨機(jī)引物包括3部分核心序列，前置序列和后前置 序列，核心序列為一段內(nèi)含子保守序列"CACGC"。前置序列和后前置序列 來自SRAP和TRAP。其序列如下Ch 5，GACTGCGTACGCACGCTGA3， C2: 5' GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5' GACTGCGTACGCACGC AAC3'(3) .隨機(jī)引物和固定引物的組合如下 C1/E1， Cl/E2; C2/E1, C2/E2; C3/E1, C3/E2。 4. 3. PCR擴(kuò)增(l).反應(yīng)體系模板DNA(25ng) 2ul 10XPCR Buffer 2 ix 1dNTPS(10mMeach) 0.5ul 隨機(jī)和固定引物(30pmo1) 各1 ul s-pfUDNA聚合酶(2.5U) 0.5ul 去離子水加至 20 ul加各種試劑后，蓋緊薄壁管蓋，短暫離心混勻。向需要滴加石蠟油的PCR 薄壁管中滴加石蠟油30ul，放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀中。 (2)將反應(yīng)管置于PCR儀上，按下面溫度操作i 940C 4miii 35cycle: 94')C 45sec520C 1 min720C lmin30sec 720C 10min 4"C 終止 取出擴(kuò)增的樣品，4"C保存。 4. 4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 4. 4. 1準(zhǔn)備制膠玻板mIV(1) .洗潔精清洗大小玻璃板，自來水沖洗數(shù)遍，蒸餾水沖洗3遍，涼干。 大小玻璃板清洗必須潔凈，否則影響后面灌膠。洗前用彩色透明膠布做好標(biāo) 記以區(qū)分未經(jīng)處理的一面。(2) . 95%乙醇清洗大小玻璃板。(3) .處理小玻板噴灑適量"雨敵"于小玻板，衛(wèi)生紙將其均勻涂抹在整 個(gè)表面。室溫干燥10分鐘，輕輕擦去多余的"雨敵"。(4) .處理大玻板:在通風(fēng)櫥中準(zhǔn)備Bind-Silane，將150 u 1 Bind Silane， 150ul冰醋酸加于1.2ml的95%乙醇中，充分混合，全部加到大玻板上，衛(wèi)生 紙均勻涂抹整個(gè)表面。室溫10分鐘，輕輕擦去多余的Bind-Silane。(5) .清洗間隔條、加樣梳，將處理好的大玻板置于水平制膠模具上，放置 間隔條，壓上小玻板對(duì)齊，夾好長(zhǎng)尾夾子，準(zhǔn)備制膠。(6) .變性聚丙烯酰胺凝膠60ml，迅速加入 TEMED 60ul 10% Ammonium persulfate 240ul 輕輕混勻(7) .用20ml注射器小心吸取凝膠混合液，加入兩塊玻板間，讓液體自頂 端向下流動(dòng)直到液面到達(dá)玻板底部，注入過程可以根據(jù)具體情況，用拳頭輕 輕捶打震動(dòng)玻板，以便凝膠混合液流動(dòng)。注入過程應(yīng)該連續(xù)，避免氣泡產(chǎn)生。 一旦有邊緣處產(chǎn)生氣泡，立即用細(xì)絲插入將其引出。如果中間產(chǎn)生大量氣泡， 只能廢棄再?gòu)男鹿嗄z。(8) .灌膠成功后，迅速插入加樣梳(齒向上)于頂端兩玻板間，并用長(zhǎng)尾 夾固定頂端。(9) .室溫聚合1小時(shí)以上。 4. 4. 2.預(yù)電泳(1) .凝膠聚合好后，去掉長(zhǎng)尾夾，放置凝膠板于垂直電泳槽上，對(duì)齊后擰 緊固定螺絲。(2) .在垂直電泳槽的上下槽中分別加入約500ml 1 XTBE緩沖液。(3) .小心去掉加樣梳，用小吸管沖洗加樣槽。(4) .接通電源，調(diào)節(jié)電壓，恒壓85v預(yù)電泳0. 5小時(shí)。 4. 4. 3.電泳(1) .擴(kuò)增產(chǎn)物10ul，加入5ul上樣緩沖液。(2) . 95r變性10分鐘，立即取出置于冰上冷卻。(3) .凝膠預(yù)電泳結(jié)束后，切斷電源。再次沖洗加樣槽，吹去氣泡。(4) .小心插入梳子(齒向下)，沖洗二遍。然后自左向右依次將樣本和DNA marker加入凝膠加樣槽。從上表可以看出，陜西商洛丹參與江蘇陽(yáng)馬丹參遺傳一致性最小為0.9194，四川中江丹參與江蘇陽(yáng)馬丹參的遺傳一致性最大為0.9746，陜西商洛(5).恒電壓lOOv電泳1. 5小時(shí)。 4. 4. 4.銀染(1) .電泳結(jié)束后，打開固定螺絲，從電泳槽上取下凝膠玻板置于水平制膠 模具上。拔掉梳子，松動(dòng)間隔條，小心去掉小玻璃板，凝膠粘附在大玻板上。(2) .將大玻板輕輕放入2000ml固定液盒中，打開旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動(dòng)固定 20min。(3) .蒸餾水水洗2次，每次5min。(4) .轉(zhuǎn)入2000ml銀染液盒中，旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動(dòng)銀染30min。(5) .水洗10s。(S).迅速轉(zhuǎn)入2000ml顯影液盒中，旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動(dòng)直至譜帶顯出，再 顯影片刻。( ).在顯影液中，待條帶稍稍清晰時(shí)，直接轉(zhuǎn)入固定液中，定影5min。 (8).水洗5min。(g).取出凝膠，自然干燥。4.4.5. 數(shù)據(jù)的采集與分析根據(jù)計(jì)算機(jī)分析的要求，將TRAP聚丙烯酰胺凝膠上出現(xiàn)的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 并轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)矩陣。每一條帶視為一個(gè)位點(diǎn)，有帶賦值為l (強(qiáng)帶和弱帶均賦 值為l)，無(wú)帶的賦值為O，得到l， O數(shù)據(jù)矩陣，將該矩陣輸入計(jì)算機(jī)。對(duì)于多 態(tài)性位點(diǎn)，重復(fù)3次以上均能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用 POPGENE32分析軟件計(jì)算不同產(chǎn)地丹參的遺傳一致性及遺傳距離，并建立系 統(tǒng)聚類分支樹狀圖。4.4.6. 丹參4種群間的遺傳一致性及遺傳距離分析遺傳一致性及遺傳距離是衡量種群遺傳多樣性的重要參數(shù)。運(yùn)用種群遺 傳分析軟PopGene32計(jì)算丹參4種群間的遺傳一致性及遺傳距離(表)。表l 4種丹參種群間的遺傳一致性(右上)及遺傳距離(左下)表**** 0.9737 0.9287 0.94850.0267 **** 0.9242 0.97460.0740 0駕9 **** 0.91940.0529 0.0257 0.0840 ****南川西蘇河四陜江蘇江陜南群禾丹參與江蘇陽(yáng)馬丹參的遺傳距離最大為0.0840，四川中江丹參與江蘇陽(yáng)馬丹參 的遺傳距離最小為0.0257。各地供試材料間的遺傳一致性平均為0.9245，遺傳 距離平均為0.0788，顯示丹參種質(zhì)親緣關(guān)系很近，說明丹參的不同居群內(nèi)既蘊(yùn) 藏了遺傳變異又保持了較高的遺傳穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，其特征在于是根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST和內(nèi)含子的保守序列設(shè)計(jì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，其特征在于 所述的引物包括固定引物和隨機(jī)引物，該固定引物根據(jù)目標(biāo)EST設(shè)計(jì)，該隨 機(jī)引物的核心序列為CACGC。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，其特征在于所述的固定引物的序列如下El: 5'ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5,TATCTTGACCAGGCGAGACCT 3V CV17湧4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，其特征在于所 述的隨機(jī)引物的序列如下C1: 5 ， GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5 ， GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5, GACTGCGTACGCACGC AAC3 ，。
5. —種如權(quán)利要求1所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記的分析方法，其特征在于分析方法包括以下步驟(1) .設(shè)計(jì)固定引物和隨機(jī)引物；(2) .合成引物應(yīng)用DNA合成儀合成設(shè)計(jì)好的引物；(3) . DNA提??；(4) .PCR擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的引物和提取的DN模板，選擇反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行PCR;(5) .擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(6) .數(shù)據(jù)的采集與分析非熒光標(biāo)記引物銀染以顯示擴(kuò)增條帶，將條帶進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)，用于數(shù)據(jù)分析；熒光標(biāo)記引物直接在共聚焦熒光掃描儀上掃描檢測(cè)， 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記的分析方法，其特 征在于所述的隨機(jī)引物和固定引物的組合為C1/E1， Cl/E2; C2/E1, C2/E2; C3/E1， C3/E2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記的分析方法，其特 征在于所述的固定引物和隨機(jī)引物可以應(yīng)用熒光標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開一種保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，是根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST和內(nèi)含子的保守序列設(shè)計(jì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析檢測(cè)而得到DNA多態(tài)性。本發(fā)明所提供的保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、模板需要量少、產(chǎn)量中等、重復(fù)性高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，可研究植物、動(dòng)物、人類以及微生物的遺傳多態(tài)性、種質(zhì)資源、親緣關(guān)系和分子標(biāo)記輔助選擇育種等許多方面，是一種可廣泛應(yīng)用的普適技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101225439SQ200710150329
公開日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者張伯禮, 王慶浩, 陳愛華, 馬金鵬, 高秀梅 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)