專利名稱：一種籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬動物基因工程及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用隨機擴增多態(tài)性 DNA標(biāo)記技術(shù)，快速篩選出自咬水貂群體與健康水貂群體的差異基因，并利用測序擴增區(qū)段標(biāo)記技術(shù)對其進行進一步驗證的方法。
背景技術(shù)：
水貂皮已成為國際裘皮貿(mào)易的三大支柱產(chǎn)品之一。其具有針毛挺直、靈活華麗、絨毛豐厚、保暖性強、皮板輕薄、柔韌結(jié)實等諸多優(yōu)點，因而成為小毛細毛類毛皮中的當(dāng)家品。 近年來水貂的養(yǎng)殖在北方地區(qū)特別是東北三省呈現(xiàn)積極的養(yǎng)殖態(tài)勢。而對于種貂的個體鑒定，除繁殖方面的指標(biāo)外，更重要的是要強調(diào)毛絨品質(zhì)。留選毛絨品質(zhì)較好的水貂，這對改善和提高全群貂皮質(zhì)量很有好處。正所謂種瓜得瓜，種豆得豆，因此要獲得高質(zhì)量的水貂皮必須選擇優(yōu)良的水貂為基礎(chǔ)。自咬癥是危害籠養(yǎng)水貂的一種慢性疾病，由于自咬癥的發(fā)生，導(dǎo)致了水貂皮張的損壞、等級下降，已成為水貂養(yǎng)殖業(yè)中的突出問題之一。我國1967-1970年已有水貂自咬癥發(fā)病的報道。國內(nèi)每年水貂自咬癥的發(fā)病率約為5% 10%。全世界每年僅水貂皮的生產(chǎn)量約為5000萬張，由于自咬癥導(dǎo)致的等級下降的皮張在200萬 300萬張，給養(yǎng)貂業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前，人們對自咬癥的致病原因還不夠清楚，國內(nèi)外學(xué)者眾說不一。但有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生自咬癥的個體其后代自咬癥的發(fā)病率較高，自咬癥的發(fā)病率與遺傳有顯著的相關(guān)性。趙元楷等報道水貂自咬癥與遺傳有直接的關(guān)系，純種繁育的后代有半數(shù)發(fā)生自咬癥現(xiàn)象。有養(yǎng)殖戶反映，自咬癥具有隔代遺傳傾向。然而，目前自咬水貂在未出現(xiàn)臨床癥狀之前是無法診斷的，人們對自咬水貂個體的診斷都是通過臨床觀察才診斷出來的。這樣就耗費了大量的人力、物力和財力，因此急需一種有效、快速的診斷方法來鑒別自咬水貂個體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用隨機擴增多態(tài)性標(biāo)記快速診斷出籠養(yǎng)水貂的自咬個體，并利用結(jié)合測序擴增區(qū)段標(biāo)記技術(shù)進一步驗證差異標(biāo)記基因是否為自咬水貂所特有的基因，為快速剔除籠養(yǎng)水貂自咬癥個體提供簡便易行的方法。本發(fā)明包括下列步驟1.提取籠養(yǎng)水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物，具體包括1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的OD26tZOD28tl比值在1. 6 1. 8之間的DNA質(zhì)量，可滿足實驗要求，根據(jù)記錄的OD26tl數(shù)值及稀釋倍數(shù)，換算出待測DNA的濃度，并作相應(yīng)的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，并在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構(gòu)成一個總基因池DNA，再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，制成兩組不同的DNA池；
1. 3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條， 用混合成的總基因池做模板，篩選出多態(tài)性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5 次重復(fù)，進一步篩選主帶重復(fù)性好的引物。2.獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標(biāo)記基因，具體包括2. 1用篩選出來多態(tài)性豐富且條帶清晰、主帶重復(fù)性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應(yīng)至少3次重復(fù)，并設(shè)立不含模板的陰性對照；2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產(chǎn)物，加3 μ L的Loading Buffer混勻后上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；為使試驗誤差減到最低程度，操作過程中采用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行， 并使用相同規(guī)格的電泳槽和統(tǒng)一的電壓，另外每次PCR反應(yīng)體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；2. 3對出現(xiàn)明顯的差異標(biāo)記序列，再進行2次重復(fù)擴增分析、確認。3.克隆差異標(biāo)記基因片段和分析SCAR轉(zhuǎn)化，具體包括3. 1將最終確定的隨機擴增多態(tài)性差異標(biāo)記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到PMD-18T載體中，然后將連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆后的菌液或質(zhì)粒送到生物公司進行測序；3. 2設(shè)計測序擴增區(qū)段標(biāo)記特異引物根據(jù)測得的差異標(biāo)記序列結(jié)果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內(nèi)，再延長8-12個bp，設(shè)計2-4對引物；3. 3利用SCAR標(biāo)記技術(shù)，用設(shè)計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結(jié)果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標(biāo)記。水貂作為一種特種經(jīng)濟動物，其籠養(yǎng)狀態(tài)下常發(fā)生的自咬癥目前尚無有效的治療辦法，自咬癥的發(fā)生導(dǎo)致了水貂皮張的損壞、等級下降，已成為水貂養(yǎng)殖業(yè)中的突出問題之一，而養(yǎng)殖水貂的主要目的是獲得高質(zhì)量的水貂皮，因此提高毛皮質(zhì)量成了水貂飼養(yǎng)過程中最緊迫的因素。本發(fā)明用隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記結(jié)合測序擴增區(qū)段標(biāo)記技術(shù)方法篩選籠養(yǎng)水貂自咬群體，可在籠養(yǎng)水貂剛出生時即鑒別出健康與自咬個體，為自咬水貂的早期淘汰提供新方法。用本發(fā)明提供的籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法鑒定水貂等毛皮動物是否健康時，可以在PCR產(chǎn)物中直接加入EB，然后在紫外燈下觀察有無熒光反應(yīng)來判斷PCR擴增反應(yīng)結(jié)果，同時可隨機抽取部分PCR擴增結(jié)果呈陽性的產(chǎn)物，進行電泳來檢驗快速判斷的正確性。因此，在實際生產(chǎn)中，可以用此簡化方法對水貂群體進行大規(guī)模鑒定，既快速簡便，又大幅度降低成本，本發(fā)明為初步建立籠養(yǎng)水貂自咬癥基因診斷平臺、為快速清除自咬水貂群體、提高水貂的皮張等級數(shù)量奠定基礎(chǔ)，也為今后水貂的免疫育種、抗病育種和疾病預(yù)防提供指導(dǎo)依據(jù)。
具體實施例方式本發(fā)明包括下列步驟1.提取籠養(yǎng)水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物，具體包括1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的0D26(1/0D28(1比值
4在1. 6 1. 8之間的DNA質(zhì)量，可滿足實驗要求，根據(jù)記錄的OD26tl數(shù)值及稀釋倍數(shù)，換算出待測DNA的濃度，并作相應(yīng)的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，并在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構(gòu)成一個總基因池DNA ；再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，制成兩組不同的DNA池；1. 3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條， 用混合成的總基因池做模板，篩選出多態(tài)性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5 次重復(fù)，進一步篩選主帶重復(fù)性好的引物。2.獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標(biāo)記基因，具體包括2. 1用篩選出來多態(tài)性豐富且條帶清晰、主帶重復(fù)性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應(yīng)至少3次重復(fù)，并設(shè)立不含模板的陰性對照；2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產(chǎn)物，加3 μ L的Loading Buffer混勻后上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；操作過程中采用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行，并使用相同規(guī)格的電泳槽和統(tǒng)一的電壓，另外每次PCR反應(yīng)體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；2. 3對出現(xiàn)明顯的差異標(biāo)記序列，再進行2次重復(fù)擴增分析、確認。3.克隆差異標(biāo)記基因片段和分析SCAR轉(zhuǎn)化，具體包括3. 1將最終確定的隨機擴增多態(tài)性差異標(biāo)記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到PMD-18T載體中，然后將連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆后的菌液或質(zhì)粒送到生物公司進行測序；3. 2設(shè)計測序擴增區(qū)段標(biāo)記特異引物根據(jù)測得的差異標(biāo)記序列結(jié)果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內(nèi)，再延長8-12個bp，設(shè)計2-4對引物；3. 3利用SCAR標(biāo)記技術(shù)，用設(shè)計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結(jié)果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.一種籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法，其特征在于包括下列步驟(1)提取籠養(yǎng)水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物；(2)獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標(biāo)記基因；(3)克隆差異標(biāo)記基因片段和分析SCAR轉(zhuǎn)化。
2.按權(quán)利要求1所述的籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法，其特征在于步驟(1)中所述的提取籠養(yǎng)水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物包括下列步驟.1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的OD26tZOD28tl比值在 1. 6 1. 8之間的DNA質(zhì)量，可滿足實驗要求，根據(jù)記錄的OD26tl數(shù)值及稀釋倍數(shù)，換算出待測DNA的濃度，并作相應(yīng)的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，并在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構(gòu)成一個總基因池 DNA,再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，制成兩組不同的DNA池；.1.3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條，用混合成的總基因池做模板，篩選出多態(tài)性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5次重復(fù)，進一步篩選主帶重復(fù)性好的引物。
3.按權(quán)利要求1所述的籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法，其特征在于步驟O)中所述的獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標(biāo)記基因包括下列步驟.2.1用篩選出來多態(tài)性豐富且條帶清晰、主帶重復(fù)性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應(yīng)至少3次重復(fù)，并設(shè)立不含模板的陰性對照；.2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產(chǎn)物，加3 μ L的Loading Buffer 混勻后上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；操作過程中采用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行，并使用相同規(guī)格的電泳槽和統(tǒng)一的電壓，另外每次PCR反應(yīng)體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；.2.3對出現(xiàn)明顯的差異標(biāo)記序列，再進行2次重復(fù)擴增分析、確認。
4.按權(quán)利要求1所述的籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法，其特征在于步驟(3)中所述的克隆差異標(biāo)記基因片段和分析SCAR轉(zhuǎn)化包括下列步驟.3.1將最終確定的隨機擴增多態(tài)性差異標(biāo)記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到 PMD-18T載體中，然后將連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆后的菌液或質(zhì)粒送到生物公司進行測序；.3. 2設(shè)計測序擴增區(qū)段標(biāo)記特異引物根據(jù)測得的差異標(biāo)記序列結(jié)果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內(nèi)，再延長8-12個bp，設(shè)計2-4對引物；.3. 3利用SCAR標(biāo)記技術(shù)，用設(shè)計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結(jié)果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標(biāo)記。
全文摘要
一種籠養(yǎng)水貂自咬癥的分子標(biāo)記診斷方法屬動物基因工程及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明包括1.提取籠養(yǎng)水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物；2.獲得健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標(biāo)記基因；3.克隆差異標(biāo)記基因片段和分析SCAR轉(zhuǎn)化。本發(fā)明可對水貂群體進行大規(guī)模鑒定，既快速簡便，又大幅度降低成本，同時本發(fā)明可為初步建立籠養(yǎng)水貂自咬癥基因診斷平臺、快速清除自咬水貂群體、提高水貂的皮張等級數(shù)量奠定基礎(chǔ)，也為今后水貂的免疫育種、抗病育種和疾病預(yù)防提供指導(dǎo)依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102154457SQ20111000068
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者唐鴻宇, 姚紀(jì)元, 孫博興, 張晶, 房恒通, 李玉梅, 王鵬, 閆守慶 申請人:吉林大學(xué)