核酸分析裝置及使用其的核酸分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)已被標(biāo)記為多種顏色的試樣進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的核酸分析裝置及使用其的核酸分析方法，尤其涉及對(duì)DNA、蛋白等進(jìn)行檢測(cè)的核酸分析裝置及使用其的核酸分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]用于人、動(dòng)物、植物或細(xì)菌、病毒等各種生物的快速鑒定(即核酸序列解析、或特征性基因組序列的堿基長(zhǎng)度解析等)的分析裝置包括例如使用了毛細(xì)管電泳法的AppliedB1systems 3500 遺傳分析儀(Life technologies 公司)等。
[0003]此外，為了便于解析，正在推進(jìn)完全集成化(即，將從樣品輸入至結(jié)果輸出集成化)的用于靶核酸分析的機(jī)器及技術(shù)的開(kāi)發(fā)。
[0004]靶核酸序列分析技術(shù)能夠使最終用戶進(jìn)行臨床檢查、法醫(yī)學(xué)鑒定等判斷。例如，多種常見(jiàn)的人類疾病能夠基于作為靶部位的小于約1000堿基的DNA序列堿基對(duì)進(jìn)行診斷，而根本不必進(jìn)行完整的人基因組解析。同樣，利用短鏈縱列重復(fù)序列分析(short tandemrepeat analysis，以下稱為STR分析)而形成的20個(gè)左右的特征性基因組序列的堿基長(zhǎng)度解析的準(zhǔn)確測(cè)定已經(jīng)逐漸用于供體的個(gè)體識(shí)別。
[0005]因此，已經(jīng)逐漸能夠根據(jù)目的在大學(xué)、醫(yī)院的研究室、患者身邊(bedside)或法醫(yī)學(xué)鑒定或環(huán)境測(cè)定的現(xiàn)場(chǎng)等在各種條件下實(shí)施靶核酸分析。
[0006]但是，為了進(jìn)行解析，伴隨有手工操作上繁雜的樣品調(diào)制、或由具備專業(yè)知識(shí)的研究人員等進(jìn)行的數(shù)據(jù)解析。
[0007]因此，作為努力降低專業(yè)性、使解析更易于進(jìn)行的例子，公開(kāi)了如下的方法:在使用DNA測(cè)序儀的堿基序列解析中，因異質(zhì)接合出現(xiàn)難以解釋的雙峰時(shí)，可高效地進(jìn)行解釋的方法(參照專利文獻(xiàn)I)。其為如下方法:對(duì)于堿基序列解析時(shí)檢測(cè)到雙峰的色譜圖，基于事先準(zhǔn)備的設(shè)定，來(lái)實(shí)施來(lái)自父母的多態(tài)性序列解析的方法。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2006 - 84471號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明要解決的課題
[0012]上述專利文獻(xiàn)I所述的方法雖然在實(shí)施異質(zhì)接合中的多態(tài)性序列解析方面有用，但是也設(shè)想在不進(jìn)行序列解析而是進(jìn)行多重PCR(Polymerase Chain React1n:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、對(duì)多種顏色(5?6種顏色)的熒光進(jìn)行檢測(cè)的STR分析中，以同一時(shí)機(jī)對(duì)多種顏色且彼此的峰高度的相對(duì)比例無(wú)關(guān)地檢測(cè)真信號(hào)。
[0013]但是，上述文獻(xiàn)中沒(méi)有考慮拔起峰所引起的假信號(hào)的去除，雖然也考慮了由拔起峰所導(dǎo)致的錯(cuò)誤解析，但留下了本來(lái)欲解析的真正的峰被去除的課題。即，產(chǎn)生了如果不是由具有專業(yè)知識(shí)的人進(jìn)行解析則不能進(jìn)行高精度解析的制約。
[0014]進(jìn)而，除了上述例子以外，如下所述，還存在必須由具備專業(yè)知識(shí)的操作者進(jìn)行數(shù)據(jù)解析的情況。
[0015]例如，多數(shù)情況下，STR分析使用以多個(gè)序列區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)的擴(kuò)增(多重PCR)進(jìn)行分析。這樣的分析中，通常對(duì)由生物試樣提取的基因組DNA濃度加以規(guī)定，在該規(guī)定范圍內(nèi)實(shí)施多重PCR并進(jìn)行電泳，由獲得的信號(hào)反復(fù)進(jìn)行解析，例如進(jìn)行個(gè)人識(shí)別的分析。在這樣的信號(hào)解析中，基因組DNA的量過(guò)少時(shí)，存在等位基因的峰高度的平衡被擾亂、信號(hào)在檢測(cè)閾值以下等課題。
[0016]此外，試樣基因組過(guò)多時(shí)，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生增大了的影子帶(stutter)、產(chǎn)生非特異性條帶、不完全的非模板添加、及包含拔起峰的假象(7—尹47 7夕卜)。這些現(xiàn)象有時(shí)與STR譜圖的解釋錯(cuò)誤密切相關(guān)。
[0017]此外，在解析多個(gè)樣品方面，還存在由于平行進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)而必須考慮串?dāng)_的影響的課題。
[0018](I)因此，期待一種使用容易，不需要如研究人員那樣具有專業(yè)知識(shí)的人員的核酸序列解析及特征性基因組序列的堿基長(zhǎng)度解析的機(jī)器。
[0019]例如，對(duì)于省略掉所有的手動(dòng)處理的系統(tǒng)存在需求。效果是經(jīng)過(guò)少量訓(xùn)練即可，例如，迫于像護(hù)士、警察等最初應(yīng)對(duì)人員遭遇那樣的困難環(huán)境的個(gè)人，也能夠容易地操作解析系統(tǒng)。
[0020]除了上述降低專業(yè)性以外，對(duì)于核酸序列解析或特征性基因組序列的堿基長(zhǎng)度解析，還謀求以下列舉的改進(jìn)。
[0021](2)期待快速獲得解析結(jié)果的解析系統(tǒng)。
[0022]對(duì)于醫(yī)院等為了確定合適處置方法而需要確定感染病原體序列等臨床用途而言，患者由于突發(fā)而入院后，為了在短時(shí)間內(nèi)實(shí)施抗菌性及抗病毒性藥物療法的處置，需要在短時(shí)間內(nèi)(例如，90分鐘以內(nèi))進(jìn)行解析。對(duì)于警察的緊急搜查中的個(gè)人識(shí)別而言，至獲得結(jié)果為止的期望時(shí)間在使用現(xiàn)有技術(shù)時(shí)為數(shù)天至數(shù)周，需要縮短為足夠短的時(shí)間(例如，90分鐘以內(nèi))。即使這些用途之外，也需要在短時(shí)間內(nèi)形成能夠解析的數(shù)據(jù)。此外，快速解析可期待同時(shí)使樣品處理量增加的效果。
[0023](3)期待解析裝置的小型化。
[0024]多數(shù)核酸序列解析系統(tǒng)需要研究所整體及相關(guān)支持。近年出現(xiàn)的具有高處理會(huì)K 力白勺 MiSeq (i I Iumina 公司)、1ntrrent PGM (Life technologies 公司)、FLX (RocheDiagnosis公司)等核酸序列解析系統(tǒng)在設(shè)置上僅需要工作臺(tái)，但為了進(jìn)行解析所必須的樣品調(diào)制，則需要大型解析設(shè)備。例如，序列解析、STR分析通常需要進(jìn)行如下的樣品調(diào)制的設(shè)備，所述樣品調(diào)制為:由生物試樣提取基因組DNA、濃度調(diào)整、利用核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行靶部位的擴(kuò)增或制備解析文庫(kù)。因此，小型化對(duì)于研究所及處置場(chǎng)所中的使用、以及現(xiàn)場(chǎng)操作兩者都是重要的。此外，對(duì)于每個(gè)樣品的成本降低而言也是重要的課題。
[0025]因此、本發(fā)明的目的在于，提供使用容易，能夠進(jìn)行快速解析，小型且能夠收容多個(gè)樣品的核酸分析裝置及使用其的核酸分析方法。
[0026]用于解決課題的手段
[0027]為了解決上述課題，本發(fā)明的核酸分析方法的主要特征如下所述。
[0028](I)所述方法的特征在于，具有下述工序:對(duì)包含多個(gè)DNA片段的分析樣品照射光的工序，在規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)使用攝像元件檢測(cè)由分析樣品被激發(fā)出的與DNA片段對(duì)應(yīng)的熒光的工序，對(duì)處于攝像元件所具有的能夠檢測(cè)的熒光強(qiáng)度的范圍內(nèi)的、分析樣品的分析中所需的熒光強(qiáng)度的下限值進(jìn)行設(shè)定的工序，以下限值為基礎(chǔ)取得每個(gè)DNA片段的熒光強(qiáng)度的工序，檢測(cè)對(duì)每個(gè)DNA片段取得的熒光強(qiáng)度的峰、確定與該峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間信息的工序，以及，將熒光強(qiáng)度與時(shí)間信息的對(duì)應(yīng)關(guān)系按照每個(gè)DNA片段來(lái)顯示的工序；在顯示中，顯示具有第I熒光強(qiáng)度的第I峰、和包含具有比第I熒光強(qiáng)度弱的熒光強(qiáng)度的第2峰的至少一個(gè)以上的峰時(shí)，使用規(guī)定值調(diào)整下限值，將以調(diào)整后的下限值作為攝像元件所具有的下限值進(jìn)行測(cè)定時(shí)的熒光強(qiáng)度，再設(shè)定為包含第2峰的至少一個(gè)以上的峰的熒光強(qiáng)度，從而對(duì)包含第2峰的至少一個(gè)以上的峰是否為假信號(hào)的峰進(jìn)行判別。
[0029]此外，本發(fā)明的核酸分析裝置的主要特征如下所述。
[0030](2)所述裝置的特征在于，具備:對(duì)包含多個(gè)DNA片段的分析樣品照射光的光照射部，在規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)使用攝像元件檢測(cè)由分析樣品被激發(fā)出的與DNA片段對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的檢測(cè)部，保存熒光強(qiáng)度的下限值的存儲(chǔ)部，所述熒光強(qiáng)度的下限值為處于攝像元件所具有的能夠檢測(cè)熒光強(qiáng)度的范圍內(nèi)的、分析樣品的分析中所需的熒光強(qiáng)度的下限值，控制各部且進(jìn)行運(yùn)算處理的運(yùn)算控制部，顯示運(yùn)算控制部的結(jié)果的顯示部；在檢測(cè)部中，以下限值為基礎(chǔ)，取得每個(gè)DNA片段的熒光強(qiáng)度；運(yùn)算控制部檢測(cè)對(duì)每個(gè)DNA片段取得的熒光強(qiáng)度的峰，確定與該峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間信息；顯示部將熒光強(qiáng)度和時(shí)間信息的對(duì)應(yīng)關(guān)系按照每個(gè)DNA片段來(lái)顯示；顯示部中顯示具有第I熒光強(qiáng)度的第I峰、和包含具有比第I熒光強(qiáng)度弱的熒光強(qiáng)度的第2峰的至少一個(gè)以上的峰時(shí)，運(yùn)算控制部使用規(guī)定值調(diào)整下限值，將以調(diào)整后的下限值作為攝像元件所具有的下限值進(jìn)行測(cè)定時(shí)的熒光強(qiáng)度，再設(shè)定為包含第2峰的至少一個(gè)以上的峰的熒光強(qiáng)度，從而對(duì)包含第2峰的至少一個(gè)以上的峰是否為假信號(hào)的峰進(jìn)行判別。
[0031]發(fā)明的效果
[0032]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供使用容易、能夠進(jìn)行快速解析、小型且能夠收容多個(gè)樣品的核酸分析裝置及使用其的核酸分析方法。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為本實(shí)施例的毛細(xì)管電泳裝置的概略圖。
[0034]圖2為本實(shí)施例中的照射系統(tǒng)的概略圖。
[0035]圖3為示出電泳分析次序的流程圖。
[0036]圖4為示出熒光染料的發(fā)光光譜的一個(gè)例子的圖。
[0037]圖5為示出STR解析次序的流程圖。
[0038]圖6為示出本實(shí)施例中的STR解析次序的流程圖。
[0039]圖7為示出本實(shí)施例中的控制用計(jì)算機(jī)的輸入畫(huà)面的一個(gè)例子的圖。
[0040]圖8為本實(shí)施例中的反應(yīng)容器的概略圖。
[0041]圖9A為示出顯示本實(shí)施例的效果的信號(hào)波形的例子的圖。
[0042]圖9B為示出顯示本實(shí)施例的效果的信號(hào)波形的例子的圖。
[0043]圖9C為示出顯示本實(shí)施例的效果的信號(hào)波形的例子的圖。
[0044]圖9D為示出顯示本實(shí)施例的效果的信號(hào)波形的例子的圖。
[0045]圖10為示出本實(shí)施例中的報(bào)告輸出畫(huà)面的例子的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]以下使用附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
[0047]《毛細(xì)管電泳裝置》
[0048]圖1為本實(shí)施例的毛細(xì)管電泳裝置的概略圖。以下參照?qǐng)D1對(duì)本裝置的構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
[0049]裝置主體101通過(guò)通信電纜與控制用計(jì)算機(jī)125連接，操作者通過(guò)控制用計(jì)算機(jī)125對(duì)裝置所具有的各功能進(jìn)行控制，接收通過(guò)光學(xué)檢測(cè)器112檢測(cè)的數(shù)據(jù)?？刂朴糜?jì)算機(jī)具備用于顯示所接受的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)顯示畫(huà)面(未圖示)。
[0050]本實(shí)施例的毛細(xì)管電泳裝置由下述部分構(gòu)成:包含I根或多根毛細(xì)管102的毛細(xì)管陣列114，所述毛細(xì)管102含有用于對(duì)事先調(diào)制的解析試樣進(jìn)行分離的分