專利名稱：核酸衍生物及其制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用核酸衍生物的一種新穎制備方法。
核酸是核糖等的糖結(jié)合在嘌呤環(huán)或者嘧啶環(huán)上，由磷酸介于它們之間，并以鏈相連而成。
核酸中的RNA(核糖核苷酸聚合物)是鏈狀高分子化合物，它具有核糖作為糖，糖部分以磷酸二酯鍵相連結(jié)。在構(gòu)成核酸的堿(例如肌苷、腺苷、胞苷、尿苷等)的嘌呤環(huán)或者嘧啶環(huán)部分，兩條鏈以所謂互補(bǔ)的方式由氫鍵相連構(gòu)成螺旋狀的立體結(jié)構(gòu)。由于這種含有二條鏈的核酸可期待具有有效的生理活性，因此迄今為止已對(duì)此進(jìn)行了大量研究[BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications58(1974)等]。
在本說明書中，其中把作為合成雙鍵RNA的多聚肌苷酸·多聚胞苷酸衍生物稱為“polyI·polyC”衍生物，而將其的構(gòu)成單元，即多聚肌苷酸和多聚胞苷酸分別稱為“polyI”和“polyC”。
近年來，人們業(yè)已知道，各種天然或合成的雙鏈RNA具有干擾素產(chǎn)生能(フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.581004(1967)。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.582102(1967)。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.61340(1968)。タィテルウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.581719(1967)。フィ-ルドウ。J.Gen.Physiol.56905(1970)。デクラ-クウ。MethodsinEnzymology78.291(1981)]。
綜上所述，現(xiàn)歸納如下
作為干擾素，誘導(dǎo)物的合成核酸衍生物一覽表(Ⅰ)均聚物·均聚物復(fù)合體(以polyI·polyC作為基體的雙鏈核酸聚合物)(1)改性堿多聚肌苷酸·多聚(5-溴代胞苷酸)，多聚肌苷酸·多聚(2-硫代胞苷酸)，多聚(7-脫氮雜肌苷酸)·多聚胞苷酸，多聚(7-脫氮雜肌苷酸)·多聚(5-溴代胞苷酸)。
(2)改性糖多聚(2′-疊氮肌苷酸)·多聚胞苷酸。
(3)改性磷酸多聚肌苷酸·多聚[胞苷基(シチジン)-5′-硫代磷酸]。
(Ⅱ)交替變換共聚物多聚(腺苷酸-尿苷酸)。
(Ⅲ)均聚物·共聚物復(fù)合體多聚肌苷酸·多聚(胞苷、尿苷酸);多聚肌苷酸·多聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)。
(Ⅳ)合成核酸與聚陽離子的復(fù)合體多聚肌苷酸·多聚胞苷酸·多聚-L-賴氨酸(稱為“polyICLC”)。
(Ⅴ)其他多聚肌苷酸·多聚(1-乙烯基胞苷酸)。
如上所述，近年來已發(fā)表了許多有關(guān)雙鍵RNA，特別是以polyI·polyC作為基體的衍生物的報(bào)告。而且，有人綜述了有關(guān)含有它們的一系列核酸衍生物及其結(jié)構(gòu)活性[デクラ-クウ。TexasReportsonBiologyandMedicine4177(1982)]。
本發(fā)明人以現(xiàn)有技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)，polyI·polyC，以及以它作為基體的各種衍生物，在以全部分子的大小分布作為沉降定值時(shí)，通過將該值調(diào)整為4S～13S(堿基數(shù)為50-10，000左右)，則它們既保持了以下所述的生理活性，而其毒性又大為降低，對(duì)此本發(fā)明人提出了專利申請(qǐng)[特愿昭62-167433號(hào)，以及根據(jù)該申請(qǐng)?zhí)岢龅膰?guó)內(nèi)優(yōu)先權(quán)聲明]。
在上述研究的同時(shí)，為了高效率地取得上述目的物，本發(fā)明人對(duì)于下述操作進(jìn)行了各種研究(1)將分子大小的分布統(tǒng)一在50-10，0000左右堿基數(shù)范圍內(nèi)的操作[在本說明書中，將分子大小的分布調(diào)整在一定范圍內(nèi)的操作稱為“分級(jí)”。此外在本發(fā)明中，由于伴有低分子化現(xiàn)象，故分級(jí)也意味著“短鏈化”);
(2)用二種單鏈核酸聚合物使之成雙鏈核酸聚合物的操作(在本說明書中，稱為“退火”(アニ-リニグ)。
表示核酸分子大小的單位常用的堿基對(duì)(或稱“bp”)，是由核酸的堿基數(shù)來表示其分子的大小(10bp系指具有10個(gè)堿基的雙鏈聚合物)。在本說明書中，因?yàn)檫€要處理雙鏈聚合物以外的核酸聚合物，故而使用“堿基數(shù)”的術(shù)語來代替bp(例如，所謂“10堿基數(shù)”則表示具有10個(gè)堿基的核酸聚合物)。
在要使核酸分子的大小特定時(shí)，則廣泛地使用通常的沉降定值(S值)，本發(fā)明人把具有已知分子大小的雙鏈DNA(M13噬菌體片段)作為對(duì)照群，采用下述的使用凝膠過濾柱的高效液相色譜法(HPLC)或者電泳法，通過與其對(duì)照群進(jìn)行比較換算，即可求得上述的堿基數(shù)。
以往，在表示核酸高分子的分子量時(shí)，廣泛地使用S值?，F(xiàn)在市售的核酸高分子也以S值表示。但是，由于近年來實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，采用了凝膠電泳、凝膠過濾色譜、離子交換色譜等方法，建立了更為精確地測(cè)定分子量的手段，現(xiàn)在已經(jīng)可以對(duì)其鏈長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。這里有一個(gè)S值表示與鏈長(zhǎng)表示的關(guān)系問題，由于用S值表示時(shí)，各核酸分子選用固有值，因而作為表示核酸分子量的方法，S值表示和鏈長(zhǎng)表示是否能正確地相對(duì)應(yīng)，從這個(gè)角度上看，并非沒有問題。
在本發(fā)明的說明書中，當(dāng)表示分子量時(shí)，本發(fā)明人按照至今的核酸化學(xué)的慣例，也記載了S值表示。但是，由于S值是將核酸高分子作為整個(gè)分子團(tuán)(或者分子形態(tài))來進(jìn)行測(cè)定的方法，鑒于今后有必要更明確他表現(xiàn)分子量分布的界限，故將基于鏈長(zhǎng)(在本說明書中為“堿基數(shù)”)測(cè)定的表示方法也一并加以記載。
上面是從polyI·polyC及以其作為基體的各種衍生物的所謂分級(jí)的觀點(diǎn)出發(fā)，在制備分級(jí)的雙鏈核酸聚合物時(shí)，或采用使已存在的雙鏈核酸聚合物低分子化的方法，亦即采用在單鏈核酸聚合物退火后使其低分子化的方法。但是，在以往的方法中，分級(jí)需花費(fèi)時(shí)間，因而不能快速地處理，故對(duì)于以工業(yè)規(guī)模來制備目的物方面有其不足之處。而且從收率角度上看也未必能使人滿足。
一方面，分級(jí)后，有必要使單鏈核酸聚合物進(jìn)行硫化時(shí)，以往是用硫化氫硫化后，使硫化氫從溶劑中揮發(fā)逸出。亦即用真空泵從硫化后的反應(yīng)液中抽出吡啶的同時(shí)，也將硫化氫一起除去，但這種方法由于硫化氫的揮發(fā)性，以工業(yè)規(guī)模實(shí)施這樣的反應(yīng)將會(huì)帶來公害對(duì)策上的問題。此外，除去吡啶后的水層則進(jìn)入滲析器，流水滲析，由此得到目的物，但這種方法的全部操作過程至少需要三天，而且收率至多達(dá)80%左右，因而在收率、費(fèi)用和所需時(shí)間的諸多方面存在技術(shù)上的困難。
此外，分級(jí)技術(shù)的本身也未必沒有問題。
在該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，核酸聚合物的低分子化歷來是采用與甲酰胺共存加熱的方法，通過調(diào)節(jié)這一反應(yīng)的時(shí)間和溫度而獲得鏈長(zhǎng)更為合適的目的物，此后，借助于使反應(yīng)溶液進(jìn)行滲析等手段，除去低分子化過度的不需要物質(zhì)。然而，在以往這種方法中，由于作為原料的核酸聚合物的性質(zhì)關(guān)系，即使在相同的反應(yīng)條件下，有時(shí)也會(huì)引起具有不同分子量分布的分級(jí)現(xiàn)象，因而在重現(xiàn)性方面尚存在問題。據(jù)認(rèn)為這是因?yàn)橛妹阜磻?yīng)來調(diào)制，原料分子的大小往往不能保持恒定的緣故。另外，適用于此處的滲析工藝，從原理上看，不能除去比目的物的鏈更長(zhǎng)的核酸聚合物，人們期待著根本的解決辦法。
本發(fā)明人繼續(xù)作各種研討，以①能以迅速操作取得作為目的物的經(jīng)分級(jí)的雙鏈核酸聚合物，②其收率要高，③可工業(yè)化且不產(chǎn)生公害等污染，④能定量地實(shí)現(xiàn)一系列操作且再現(xiàn)性高等作為目的不斷研究結(jié)果，才好不容易完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于①在退火之前，先要使各自的單鏈核酸聚合物分級(jí)，②當(dāng)上述(1)的分級(jí)時(shí)，通過使用HPLC(凝膠過濾高效液相色譜)替代目前的電泳法，使分子大小分布數(shù)值化，并利用由此容易知道分子大小分布的變化，進(jìn)而要確定能迅速取得4S～13S(堿基數(shù)約為50～10，000)這一分子大小分布范圍內(nèi)的目的物的方法，③確立以下方法，即在分級(jí)后的處理中，把以前用滲析取得目的物的做法，通過添加低級(jí)醇類等進(jìn)行處理的這一極其單純的操作來提高收率，④確立以下方法，即當(dāng)分級(jí)后有必要使單鏈核酸聚合物硫化時(shí)，把以前用硫化氫硫化后使硫化氫直接從溶劑中揮發(fā)的做法，通過添加芳香醇進(jìn)行離心處理這一極其單純的操作來提高收率，⑤作為調(diào)整分級(jí)后的單鏈核酸聚合物的分子量分布，并進(jìn)一步使其分布集中的方法，適用了離子交換樹脂。
以下將對(duì)上述的各點(diǎn)作詳細(xì)地說明。
退火是一種使彼此互補(bǔ)的單鏈核酸聚合物成雙鏈的過程，是本來就容易進(jìn)行的操作。若在退火后進(jìn)行分級(jí)，則會(huì)產(chǎn)生硫化度波動(dòng)等誤差，建以定量取得。故而，想到分級(jí)要在退火之前進(jìn)行，并這樣執(zhí)行的結(jié)果獲得了極其良好的結(jié)果。
上述的(1)與(2)有密切關(guān)系。用由電泳法測(cè)知其分子量的目前的手段，最低需要一夜(泳動(dòng)及染色)，難以做到迅速處理。本發(fā)明人通過把HPLC凝膠過濾法用于其中，就能夠極其迅速地知道產(chǎn)生作為目的的分子大小分布的物質(zhì)(即，為4S～13S，堿基數(shù)約為50～10，000的物質(zhì))的反應(yīng)時(shí)間。
本發(fā)明中，當(dāng)測(cè)知分級(jí)反應(yīng)終止后即使反應(yīng)停止，之后，加低級(jí)醇類進(jìn)行處理。低級(jí)醇類中最好用乙醇。
當(dāng)使用乙醇沉淀法時(shí)，例如由polyC獲得L-polyC(經(jīng)分級(jí)的以下“L-”的意義相同)的反應(yīng)中，可以以93%的高收率得到目的物，在由polyI獲得L-polyI的反應(yīng)中，可以以78%的高收率得到目的物。
以前，是把反應(yīng)溶液送入滲析管作滲析處理的，但這時(shí)的收率約為60%，在由polyI獲得L-polyI的反應(yīng)溶液只能期望達(dá)到大約40%，而且操作要求大約三天。采用乙醇沉淀法(在反應(yīng)溶液中添加其兩倍數(shù)量的乙醇，經(jīng)攪拌使目的物析出，之后離心分離，收集沉淀物，洗凈且干燥的方法)，則可以在1小時(shí)之內(nèi)處理。
上述(3)是構(gòu)成本發(fā)明的要旨的重點(diǎn)。分級(jí)后由硫原子置換單鏈核酸聚合物中的核酸中的氮原子(例如，以一定的比例由巰基置換polyC中胞苷殘基的氨基)而變成其他的核酸的反應(yīng)(本說明書中稱之“硫化”)，是合成共聚物時(shí)常常使用的方法。另外，本發(fā)明的目的還在于在所說的硫化共聚物的合成中，添加芳香醇并加以處理來達(dá)到目的[上述(4)]。
可以使用諸如苯酚作為芳香醇。
使用苯酚時(shí)，例如在混有吡啶、水和硫化氫氣體的反應(yīng)溶液中，添加一半數(shù)量的苯酚，經(jīng)攪拌及離心分離，水層和苯酚層清楚地分開，使反應(yīng)溶液的顏包和副產(chǎn)物硫等也遷移到苯酚層。之后，分離水層，由鹽水、醇處理使目的物析出再離心分離，通過洗凈醇，可以獲得純的目的物。
如果采用這種方法，由于硫化氫大部分包含在溶液的沉淀上的清液中，故而可以容易地去除。
例如，采用使用苯酚的本發(fā)明的方法，操作在1小時(shí)之內(nèi)完畢，收率幾乎為100，而且可以定量地獲得目的物。
上述的本發(fā)明中的獨(dú)特的方法(2)～(4)為實(shí)現(xiàn)在退火之前進(jìn)行分級(jí)是重要的，并且是為了能充分地應(yīng)用所謂退火前分級(jí)的手法上，能應(yīng)用自如的方法。
以下是本發(fā)明的另一特征，將說明分級(jí)與退火之間的大小限定的方法與[上述(5)]。
該方法中，利用離子交換樹脂。作為核酸系高分子中適用了離子交換樹脂的實(shí)例有在t-RNA施用的DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、苯?；疍EAE-纖維素等[BBA，47，193(1961)、BBRC10，200(1963)、Biochem.6，3043(1967)]。該例中，至多不過在堿基數(shù)約為80的低分子核酸的精制中施用離子交換樹脂。
本發(fā)明人對(duì)在以高分子核酸聚合物的堿基數(shù)作為指標(biāo)的精制時(shí)是否可能應(yīng)用離子交換樹脂所具有的吸附電荷的本性，進(jìn)行了各種研討結(jié)果，確立了本發(fā)明。本發(fā)明，由于其目的物質(zhì)作藥物是極其有用的，故而確信應(yīng)用該離子交換樹脂的大小限定(本說明書中還稱之“離子交換法”)具有顯著的進(jìn)步性。
在本發(fā)明離子交換法中，離子交換樹脂僅與核酸聚合物共處同一容器內(nèi)就可達(dá)到目的(分批法)，而通常應(yīng)用柱色譜進(jìn)行分界(柱法)。把離子交換樹脂裝入柱等中，使溶解了核酸聚合物的液體流入，一旦使其吸附在離子交換樹脂中，其后一邊使食鹽-三羥甲基氨基甲烷緩沖液等的洗脫液通過柱，一邊使其食鹽濃度變成線性或者分段，得到一定量流出液，然后與以前同樣地用HPLC凝膠過濾法把含有各種餾分的核酸聚合物的堿基數(shù)，以指示器為指標(biāo)測(cè)知，從而可以獲得目的物的經(jīng)洗脫的餾分。
為了用上述的離子交換法達(dá)到目的，柱中填充的離子交換樹脂的種類和洗脫液的種類成為極重要的因素。
例如，把polyI溶解于鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，再使其吸附在用于polyI的大小限定的QAE(第四級(jí)氨基乙基)載體中而進(jìn)行離子交換法的結(jié)果，即使洗脫液的鹽濃度極濃，也未能得到目的物。這是因?yàn)橹灰赒AE載體中的polyI適中洗脫液鹽濃度狀態(tài)中，polyI本身不溶?？梢杂勺鳛閜olyI的構(gòu)成單位的肌苷酸，在結(jié)構(gòu)上更具有疏水性來說明。這里，適中洗脫液鹽濃度是與polyC比較而定的。
在本發(fā)明人所作的其他實(shí)驗(yàn)中，在QAE載體中polyI的適中洗脫液食鹽濃度的緩沖液中，溶解的polyI呈白濁狀，可以觀察到產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。因此，本發(fā)明離子交換法中，選擇離子交換樹脂的種類以及洗脫鹽濃度成為極其重要的要素。
也就是說，在polyI的情況下，使用DEAE載體，得到非常良好的結(jié)果。在polyI情況下，不管QAE載體，不管DEAE載體都能獲得良好的結(jié)果。洗脫可以通過采用食鹽的線性濃度梯度或者分段的濃度梯度，以鏈長(zhǎng)的順序使聚合物分界洗脫。
例如，用polyC(38毫克，S208.6)，吸附在DEAE-Toyopearl 650C(φ10×130毫米)中，以線流速1.32厘米/分，175滴/餾分洗脫、A＝OMNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)B＝0.5MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)各用100毫升，以B%0→100，采用線性濃度梯度結(jié)果，按下列的鏈長(zhǎng)的順序可清楚地洗脫。
餾分堿基數(shù)333403447035740361000371500另外，若把同樣的試樣以分段的濃度梯度進(jìn)行，則在0.3MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)(50毫升)時(shí)，可以分界出500堿基數(shù)以下的，接著在0.5MNaCl/100mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)(50毫升)，可以分界出500～1500堿基數(shù)的。
同樣，在同一條件下以線性濃度進(jìn)行，則可按下列的順序洗脫poly I(7.8毫克1，S207.3)。
餾分堿基數(shù)35303614037230383503946040540另外，若同樣的試樣以分段的濃度梯度進(jìn)行，則在0.3MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)(50毫升)可以分界出3000堿基數(shù)以下的，接著在0.5MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH0.7)(50毫升)，分界出300～600堿基數(shù)的。
這樣，通過選擇任意的食鹽濃度，連高分子的核酸都可分界出鏈長(zhǎng)被限定的核酸。
如上述的兩例所示，本發(fā)明的離子交換法的最大目的在于以任意地且大規(guī)模地從由各種鏈長(zhǎng)構(gòu)成的核酸高分子混合物中分出具有在藥效上適合作藥物的性質(zhì)的鏈長(zhǎng)分布的物質(zhì)(主要成分)。
可是，在制備作為注射劑的藥物時(shí)，業(yè)已知道，不可缺少所謂去除在劑中不可以混入的熱原(發(fā)熱物質(zhì)，已知它由多糖構(gòu)成)的操作。在與本發(fā)明有關(guān)的核酸衍生物中，當(dāng)把它作為注射劑給藥于人時(shí)，這也必然成為必須要解決的問題。
本發(fā)明人通過采用上述的離子交換法，幸運(yùn)地發(fā)現(xiàn)了去除這種熱原的方法。
本發(fā)明人繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，目的在于更仔細(xì)地驗(yàn)證上述偶然發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)單鏈核酸衍生物，不管其鏈長(zhǎng)如何，都可用離子交換法去除熱源，從而完成本發(fā)明。
因此，這也是本發(fā)明的重要目的之一。
把由單鏈RNA(市售polyC以及使其短鏈化的物質(zhì))的試驗(yàn)的內(nèi)毒素的定量試驗(yàn)的結(jié)果示于下表。
表中EU代表家免發(fā)熱性試驗(yàn)的單位[內(nèi)毒素單位USPreferencestandardendotoxin(E.coli0113)]。
①代表注射用蒸餾水(空白)，②代表poly(市售商品-1)，③代表polyC(市售商品-2)，④代表下述實(shí)施例(5-4)中的物質(zhì)。

由上可見，離子交換法的去除熱原的效果是明顯的。
作為藥品，本發(fā)明的核酸衍生物的生理活性是極其有用的，如以下所述，本發(fā)明核酸衍生物具有強(qiáng)的抗癌作用。這種作用不過是本發(fā)明核酸衍生物所持有的幾種生理活性中的一種。
除了以polyI·polyC為基體的本發(fā)明核酸衍生物的生理活性之外，還可列舉TNF產(chǎn)生能、干擾素產(chǎn)生能、間白細(xì)胞素產(chǎn)生能、巨噬菌體活化能、對(duì)NK細(xì)胞的活化作用、腫瘤細(xì)胞增殖阻止作用、人腫瘤細(xì)胞在輸癌裸鼠中的增殖阻止作用、腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移抑制作用等。
本發(fā)明核酸衍生物與之前的polyI·polyC等的干擾素·衍導(dǎo)物相比，具有極高的安全性。因此，本發(fā)明的化合物可以作抗病素劑、抗腫瘤劑等。
上述的本發(fā)明核酸衍生物的生理作用在上述的專利申請(qǐng)(特愿昭62-1676433號(hào)及基于它的要求國(guó)內(nèi)優(yōu)先權(quán)的申請(qǐng))的說明書中已作詳細(xì)敘述。
以下揭示了有關(guān)本發(fā)明的核酸衍生物制備方法的實(shí)施例，以對(duì)本發(fā)明作更為詳細(xì)的說明。
實(shí)施例(1)L-polyI(分級(jí)化的polyI)的制備及提純?cè)谑惺鄣?0克polyI中，加入200毫升蒸餾水、250毫升甲酰胺，以及500毫升的5M食鹽水，在80℃下加熱4小時(shí)。
采用具有TSK凝膠G-DNA-PW柱(7.88毫米(直徑)×300毫米)的高效液相色譜法[洗脫液為50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH7.5)、0.3M食鹽、2mMETDA，流速為0.5毫升/分]，凝膠過濾，保留時(shí)間達(dá)到最大值21.86±0.2(分)時(shí)，終止反應(yīng)。
向反應(yīng)液加入2倍量的乙醇，用離心分離(3000轉(zhuǎn)/分，4℃)收集所生成的沉淀物，經(jīng)70%乙醇洗凈后，真空干燥，由此得到102克L-polyI。
另外，本實(shí)施例中全部使用滅菌狀態(tài)的水和水溶液，以下實(shí)施例同。
(2)L-polyC(規(guī)格化的polyC)的制備和提純?cè)?0克polyC中，加入200毫升蒸餾水、250毫升甲酰胺、50毫升5M的食鹽水，在80℃下加熱4小時(shí)左右。采用與上述(1)相同的高效液相色譜凝膠過濾手段，確認(rèn)反應(yīng)的終點(diǎn)(當(dāng)保留時(shí)為21.33±0.2分時(shí))。
向反應(yīng)液加入2倍量的乙醇，通過離心分離(3000轉(zhuǎn)/分，4℃)收集沉淀物，經(jīng)70%乙醇洗凈后，進(jìn)行真空干燥，由此即得9.5克的L-polyC。
(3)L-polyC的硫化將上述(2)所得的8.0克L-polyC溶解在240毫升水中，然后置于500毫升蒸餾釜內(nèi)，在冰冷卻下，加入硫化氫的吡啶溶液(12克/120毫升)，封管后，在50℃下加熱10小時(shí)左右。冷卻后，加入TE飽和酚(200毫升)，攪拌后，離心分離(3000轉(zhuǎn)/分，15℃，5分鐘)，在水層中加入1/10(水層量的1/10)量的5M食鹽水及2倍(水層量的2倍)量的乙醇，隨即產(chǎn)生沉淀。離心分離(3000轉(zhuǎn)/分，4℃，10分鐘)后，用70%乙醇洗凈，再經(jīng)真空干燥，即得到8.0克L-poly(C20S4U)(系指在分級(jí)的poly C中，每20個(gè)胞苷酸中有一個(gè)被4-硫代賴氨酸置換)。
此外，上述所謂的TE，系在10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.5)中加入EDTA，使后者濃度達(dá)到1mM，由此所配制成的溶液稱為TE。
(4)退火一例從上述(3)中所得到L-poly(C20，S4U)中取出6.00克，而上述(1)中所得的poly I中取出6.44克，分別將它們?nèi)芙庠谟?0mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.5)和50mM食鹽水所組成的300毫升溶液中，然后進(jìn)行混合。將所得的混合液在水浴中加熱至70℃，保溫10分鐘后，原封不動(dòng)地冷卻過夜。經(jīng)酚處理和用乙醇沉淀后，在所生成的沉淀物中加水(約200毫升)，使其溶解，在水中滲析，溫度為4℃，將滲析液濃縮至干，即得12.4克退火的化合物。
(5)用離子交換法的大小限定以下的離子交換法可通過分級(jí)洗脫或線性梯度洗脫而進(jìn)行。若正確地選擇洗脫條件，則在任何情況下，收率及作為目標(biāo)的鏈長(zhǎng)幾乎可以保持不定。L-poly C和L-poly(C，S4U)的分級(jí)洗脫均用0.15M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)、10MNa Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)連續(xù)地進(jìn)行。
L-polyI的分級(jí)洗脫可參照下述實(shí)施例(5-1)。
L-polyI的線性梯度洗脫用A
，B
、B[濃度為1.0MNaCl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)]洗脫液，并在B液的百分?jǐn)?shù)為0至100的線性梯度洗脫條件下進(jìn)行洗脫。收集主峰洗脫過程中的級(jí)分，用高效液相色譜凝膠過濾法測(cè)定保留時(shí)間，所得的值為21.35±0.2分。在93%高收率下，得到一種L-polyC化合物，其中作為目標(biāo)的堿基數(shù)限定在100-1000的范圍內(nèi)。
(5-3)L-poly(C12，U)的大小限定將19毫克L-poly(C12，U)(系指每12個(gè)胞苷酸中有一個(gè)被尿苷酸置換)(采用同上的高效液相色譜法，測(cè)得的保留時(shí)間為18.67分)溶解在5毫升三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)中，然后使之吸附在DEAE-Toyopaerl(登記商標(biāo))650C(φ10mm×130mm)中，接著分別用100毫升的A[濃度為0.0M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)]、B[濃度為0.5M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)]洗脫液，從1.30厘米/分的線速度，并在B液的百分?jǐn)?shù)為0-100的線性梯度洗脫的條件下，進(jìn)行洗脫。收集主峰洗脫過程中的級(jí)分，并用高效液相色譜凝膠過濾法測(cè)定保留時(shí)間，所得的數(shù)值為18.97±0.2分。在87%的高收率下，得到一種L-poly(C12，U)，其中作為目標(biāo)的堿基數(shù)限定在100-1000的范圍內(nèi)。
(5-4)L-poly(C20，S4U)的大小限定將前述(3)所得的600毫克L-poly(C20，S4U)溶解在10毫升三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)中，然后使之吸附在QAE-Toyopearl(登記商標(biāo))550C(φ10mm×130mm)上，接著分別用100毫升A[濃度為0.0M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)]、B[1.0M Na Ca Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.0)]洗脫液，以1.30厘米/分的線速度，并在B液在百分?jǐn)?shù)為0-100的線性梯度洗脫條件下進(jìn)行洗脫。按照與上述(5-2)中所述的相同的高效液相色譜凝膠過濾法測(cè)定保留時(shí)間，所得的數(shù)值為21.35±0.2分。
在90%的高收率下，得到一種L-poly(C20，S4U)，其中作為目標(biāo)的堿基數(shù)限定的100-1000的范圍內(nèi)。
(6)退火(6-1)L-polyI和L-polyC將前述(5-2)中所得的大小限定的L-polyC3.0克和在(5-1)中所得的大小限定的L-polyI3.2克分別溶解在150毫升由三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩沖液(pH7.5)和50mM食鹽水所組成的溶液中，然后進(jìn)行混合。將所得的混合物在水浴中加熱至70℃，保溫10分鐘后，在原封不動(dòng)的狀態(tài)下冷卻過夜。經(jīng)酚處理后，用乙醇沉淀，在所生成的沉淀物中約加入400毫升水，使之溶解，然后在水中滲析，溫度為4℃。將滲析液濃縮至干后，即得到6.2克退火化合物。
(6-2)L-poly I和L-poly(C20，S4U)按上述(6-1)中的所述的同樣方法處理在前述(5-4)中所得的大小限定的L-poly(C20，S4U)1.46克和前述(5-1)中所得的大小限定的poly I1.57克，由此得到3.0克退火化合物。
權(quán)利要求
1.一種核酸衍生物的制備方法，其特征是在制備以RNA作為基體的，且沉降定值(以全體分子的大小分布為沉降定值)為4S-13S范圍內(nèi)的雙鏈核酸衍生物過程中，使各核酸聚合物在退火前分級(jí)。
2.一種核酸衍生物的制備方法，其特征是在制備以RNA作為基體的，且堿基數(shù)為50-10，000(在全部分子大小分布中分布量最大的分子)范圍的雙鏈核酸衍生物過程中，使各核酸聚合物在退火前分級(jí)。
3.一種單鏈共聚物的制備方法，其特征是在按權(quán)利要求1或2所述的方法，在分級(jí)后和退火前對(duì)構(gòu)成單鏈核酸聚合物的核酸進(jìn)行硫化的過程中，添加芳基醇進(jìn)行處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是用離子交換樹脂處理分級(jí)后和退火前的雙鏈核酸聚合物，使其分子大小的分布集中在一定范圍內(nèi)，從而對(duì)大小進(jìn)行限定。
5.一種去除熱原(パイロジェン)的方法，其特征是在以核酸衍生物為主要成分的注射劑制備過程中，用離子交換樹脂進(jìn)行處理。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核酸衍生物的新穎制備方法。該法主要包括(a)使單鏈核酸聚合物分級(jí)，使其分子大小限定在50—10,000個(gè)堿基對(duì)(或沉降定值為4S—13S)范圍內(nèi)；(b)退火，亦即使彼此互補(bǔ)的單鏈核酸聚合物形成雙鏈的過程。本發(fā)明可工業(yè)化，且不產(chǎn)生公害等污染。由本發(fā)明的方法所制備的核酸衍生物具有很強(qiáng)的抗癌作用和其他生理活性作用，而且副作用小，可用作抗腫瘤劑、抗病毒劑等。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1030424SQ88104080
公開日1989年1月18日 申請(qǐng)日期1988年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1987年7月3日
發(fā)明者矢野純一, 大木忠明 申請(qǐng)人:日本新藥株式會(huì)社