一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物、探針及檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物、探針及檢測方法和試劑盒，所述的引物由上游引物Yeast?F1和下游引物Fungus?R1組成，所述的上游引物Yeast?F1的堿基序列為GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物Fungus?R1的堿基序列為TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。所述探針的堿基序列為TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。本發(fā)明提供的引物和探針具有良好的靈敏度和特異性。本發(fā)明整個反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進行，避免了其他核酸檢測方法易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結(jié)果；由于對PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于同時檢測常見腐敗酵母菌的核苷酸片段的引物和探針序列 及檢測方法和試劑盒。 -種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物、探針及檢測 方法和試劑盒

【背景技術(shù)】
[0002] 大量酵母的存在可引起食品風(fēng)味下降或變質(zhì)，由酵母引起的食品腐敗越來越受到 重視。酵母不僅在低濕度、低pH值或高鹽高糖的食品中抵抗力較強，同時對防腐劑、冷凍、 電離輻射照射的抵抗力強，隨著食品防腐劑及電離輻射照射等相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用，普通致病 性或腐敗性細菌被有效殺滅，酵母則成為引起食品變質(zhì)的優(yōu)勢菌酵。在常見的發(fā)酵食品、海 產(chǎn)食品、腌制食品等食品中很容易發(fā)生酵母引起的腐敗，腐敗酸奶中可分離出漢遜德巴利 酵母（Debaryomyces hansenii)、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)、解脂耶 羅維亞酵母（Yarrowia lipolytaca);在半軟和軟奶酪中，假絲酵母屬、薔薇酵母屬和隱球 酵母等會引起臭味、軟化、產(chǎn)氣、變色和漲袋；誕沫假絲酵母（Candida zeylanoides)、遜德 巴利酵母（Debaryomyces hansenii)、清酒假絲酵母（Candida sake)等酵母都能引起火腿、 香腸等肉制品感官品質(zhì)的改變引起腐敗。食品中常見腐敗酵母如表1所示，酵母引起的食 品變質(zhì)和腐敗給食品工業(yè)造成巨大的安全風(fēng)險，因此尋找一個快速簡便、能同時檢測多種 食品種腐敗性和致病性酵母的檢測方法意義重大。
[0003] 目前檢測酵母菌的方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、抗體抗原免疫法、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR) 技術(shù)等。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法方便、成本低，但所需時間至少要5天，無法適應(yīng)現(xiàn)代高通量快速檢 測的需求；抗體抗原免疫法具有較高的靈敏度和特異性，但存在成本較高、篩選抗體困難和 不能同時檢測多種抗原的能力，無法滿足食品中多種食品種腐敗性和致病性酵母同時檢測 的要求。傳統(tǒng)PCR特異性強、靈敏度高、快速、簡便，但有易受到污染，需要使用有毒試劑EB 等缺點，實時熒光定量PCR是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，不但具備傳 統(tǒng)PCR的優(yōu)點，而且克服了易受到污染，需要使用有毒試劑EB等缺點，該檢測方法具有快 速、簡便、直觀、定量準確等優(yōu)勢，已被成功應(yīng)用于臨床疾病診斷、動物疾病檢測、食品安全、 科學(xué)研究等多種領(lǐng)域的研究檢測。
[0004] 表1食品中常見腐敗型酵母
[0005]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物由上游 引物Yeast F1和下游引物Fungus R1組成，所述的上游引物Yeast F1的堿基序列為 GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物 Fungus R1 的堿基序列為 TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。
2. -種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的探針，其特征在于，所述探針的堿基序列為 TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。
3. -種腐敗酵母菌核苷酸片段的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分：
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分：
5. -種腐敗酵母菌核苷酸片段的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 按照權(quán)利要求1和2的序列設(shè)計引物和探針； (2) 按照DNA提取試劑盒提取待測樣品中酵母基因組DNA作為模板； (3) 建立反應(yīng)體系 利用上述引物和探針進行反應(yīng)體系的建立，確定采用的熒光PCR反應(yīng)體系，以20μ 1體 系計，所需各組分及相應(yīng)濃度如下：
(4) 選擇儀器的檢測通道 在進行熒光PCR反應(yīng)時，應(yīng)對所用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進行設(shè)置，選擇的熒 光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致； (5) 上機檢測 將上述20 μ 1的反應(yīng)體系進行熒光PCR檢測；經(jīng)檢測，若待測樣品中含有腐敗酵母則顯 示陽性擴增曲線；若待檢培養(yǎng)液中不含有酵母菌則無擴增信號。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR條件選擇如下：95°C lmin， 1個循環(huán)； 95°C 5sec，6(TC 40sec，40 個循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光PCR反應(yīng)體系如下，以 20 μ 1體系計：
8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述腐敗酵母菌為假 絲酵母屬（Candida)、隱球酵母屬（Cryptococcus)、地絲菌屬（Geotrichum)、薔 薇酵母屬（Rhodotorula)、接合酵母屬（Zygosaccharomyces)、德克/酒香酵母 (Dekkera/Brettanomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)或異常畢赤酵母 (Wickerhamomyces(Pichia)anomala)〇
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述腐敗酵母菌為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis)、斯巴達畢赤酵 母（Pichia Sparta)、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)或淺紅酵母（Rhodotorula pallida Lodder)〇
【文檔編號】C12N15/11GK104109711SQ201410201044
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】肖性龍, 萬松華, 余以剛, 吳暉, 李曉鳳, 胡雙芳 申請人:華南理工大學(xué)