專利名稱：擴增dna片段的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及區(qū)分在鄰近3，末端處具有特定序列的核酸分子與在分子內(nèi) 嵌入相同序列或不含該序列的核酸分子。本發(fā)明還涉及區(qū)分在鄰近3'末端 處具有不同序列的核酸分子。本發(fā)明具體涉及在共有相同靶序列的未裂解 DNA的存在下選擇性擴增裂解DNA的方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(PCR)基于雙鏈DNA變性、接著寡核苷酸引物與DNA模 板退火并通過DNA聚合酶進行引物延伸這三個步驟的重復循環(huán)(參見例如 Mullis & 美國專利4,683,195、 4,683,202和4，800， 159)。 PCR所用寡核苷 酸引物被設計成與DNA的互補鏈退火，且所處的位置能使一個引物經(jīng)DNA 聚合酶-催化的延伸產(chǎn)物可用作另一個引物的模板鏈。PCR擴增法導致分離 的DNA呈現(xiàn)出指數(shù)增加，所述DNA的長度受寡核苷酸引物的5'末端限制。
在其標準應用中，選定的引物與耙基因組內(nèi)的序列匹配，并側(cè)翼于待 擴增的DNA區(qū)域。此外，大量的PCR變異形式已被描述，其中接頭與DNA 片段的末端相連接，然后接頭中的序列被用于引發(fā)DNA擴增。連接-介導 PCR先被用于DNA足跡法和測序反應，其中通過DNaseI消化或化學裂解 (Mueller and Wold, 1989 and Pfeifer et al. 1989)產(chǎn)生DNA末端，并延伸至通 過限制性消化形成的末端(Steigerwaldetal. 1990)。通過聯(lián)合使用針對特定靶 區(qū)域的引物與靶向添加的接頭的引物即可獲得特異性。技術的變異形式具 有下述的一系列用途基因組測序和DNA甲基化分析、染色體步查、鑒定 染色體整合或重組位點、研究突變斷裂點和mRNA末端。連接-介導PCR 也可用于完整基因組的擴增，其中擴增的是具有連接末端的整個分子群體 (Sch畫aker et al., 2006)。
盡管連接—介導PCR具有廣泛的用途，但目前仍需要改良的基于PCR 的方法學，所述方法學能選擇性擴增具有3，末端的DNA,并具有簡單方便、 特異性強的優(yōu)點。發(fā)明簡述
本發(fā)明提供了區(qū)分在鄰近3，末端處具有特定序列的核酸分子與在分子 內(nèi)嵌入相同靶序列或不含該序列的核酸分子的方法。3 ，末端可以源自例如限 制性酶裂解或其它特異性的酶解或化學裂解，或者，3'末端也可以是PCR 產(chǎn)生的擴增子的游離末端，以及諸如染色體、病毒或噬菌體之類的天然DNA 的游離末端，或者，3，末端也可以由RNA模板逆轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生，或通過任何 其它能產(chǎn)生具有3'末端的核酸的方法而產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本文也將其稱為"末端-特異性PCR"或 ES-PCR,位于核酸分子3'末端鄰近處的核苦酸序列被用于引發(fā)擴增反應， 所述反應僅當這些序列鄰近于3'末端時才會發(fā)生，而當這些序列嵌入核酸 分子內(nèi)部時則不會發(fā)生。
為了達到區(qū)分的目的，所使用的寡核苷酸(下文的"模板寡核苷酸") 應具有與靶序列互補的3，部分，以及當寡核苷酸與核酸退火時能形成5，尾 的5'部分。當模板寡核苷酸與位于3，末端鄰近處的靶序列退火時，在適當 的聚合酶存在下，通過游離3，末端的延伸可以復制5，尾。當模板寡核苷酸 與嵌入核酸分子內(nèi)的靶序列退火時，由于缺乏游離的3，末端，不會發(fā)生5' 尾的復制。由于其5，尾被用作位于3'末端鄰近處的靶序列3'延伸的模板， 因此本文將目前所述的寡核苷酸稱為模板寡核苷酸。
當靶序列鄰近于3'末端時，5'尾的復制導致靶向的核酸分子的3'末端 添加了新序列，它可用于在3，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子隨后的選 擇性擴增。
例如，當3，末端是限制性酶裂解產(chǎn)物時，將會發(fā)生越過未裂解的DNA 而僅選擇性地擴增裂解的DNA。
在一個實施方案中，模板寡核苷酸摻入了使寡核苷酸的3，延伸延遲的 修飾，與此同時，其5，尾通過靶序列延伸而進行的復制無阻礙地繼續(xù)進行。 因此，可以選擇模板寡核苷酸3，區(qū)域的核酸序列，以使在所用條件下，與 靶序列的雜交不穩(wěn)定，進而，在5'尾不復制的情況下，模板寡核苷酸與嵌 入核酸分子內(nèi)的靶序列的雜交受到抑制。同模板寡核苷酸與嵌入核酸分子 內(nèi)的靶序列的退火(5 ，尾不會復制)相比，5 ，尾的復制增強了模板寡核苷酸與
鄰近于3'末端的靶序列的退火。
模板寡核苷酸增強的退火反過來會提高模板寡核苷酸3，延伸發(fā)生的效率，籍此，聯(lián)合另一個在反方向上引發(fā)的模板寡核苷酸，或與靶向核酸分 子內(nèi)別處的序列互補的反向引物，使靶序列的擴增得以進行，從而特異性 檢測或擴增所需的分子，即在鄰近于3'末端處具有靶序列的核酸分子。
靶向核酸分子3'末端(通過寡核普酸5'尾的復制)新?lián)饺氲男蛄幸部捎?于擴增靶向核酸分子。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，使樣品與模板寡核苷酸一起保溫，
所述寡核苷酸的3'部分含有與鄰近于靶向核酸分子3，末端的靶序列基本上 互補的序列，其5，部分形成5，尾。模板寡核苷酸摻入了使自其3'末端起的 延伸延遲的修飾。在適當聚合酶的存在下，模板寡核苷酸的5'尾通過自3， 末端起的靶序列延伸而被復制。靶序列的3'延伸導致以下結(jié)果同其與嵌 入核酸分子內(nèi)的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸的退火有所增強，因此， 當模板寡核苷酸與鄰近于3'末端的靶序列退火時，可促進其3，延伸。隨后， 模板寡核苷酸自身或新?lián)饺氲男蛄?本文稱之為"第三寡核苷酸")可單獨使 用，或與耙向分子內(nèi)的序列聯(lián)合使用，從而特異性檢測或擴增所需的靶序 列，即鄰近于3，末端的序列。
本發(fā)明的方法與連接-介導PCR的不同之處在于本發(fā)明無需連接步 驟，序列特異性直接摻入靶向核酸3，末端的模板寡核苷酸。
因此，本發(fā)明的一個方面提供了在含有非鄰近于3，末端而是嵌入分子 內(nèi)部的靶序列的分子存在時，從樣品中選擇性擴增在鄰近于3'末端處具有 靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括
(i) 使樣品與模板寡核苷酸接觸，所迷寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3'末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3'末端鄰 近處或嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5， 尾為靶序列的3，末端延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡 核苷酸5，尾互補的序列，導致在輩巴序列中添加與5'尾互補的序歹'J; 和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了所述模板寡核苷酸的3'延伸；
(ii) 使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核苷酸接觸，所述第二 寡核苷酸用于在與模板寡核苷酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核苷 酸與模板寡核苷酸的5，尾共享核苷酸序列；和進行樣品的擴增，其中
(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸延遲的情況下，通過自耙序列3，末端 起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5'尾，使得同模板寡核普酸與非 鄰近于3，末端的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸與鄰近于3，末 端的靶序列的退火被穩(wěn)定化；和
(b) 與和非鄰近于3，末端的靶序列退火的模板寡核苦酸的延伸相 比，隨之而來的模板寡核苷酸與鄰近于3，末端的靶序列的穩(wěn)定化退 火增強了模板寡核苷酸的3'延伸效率；和
(c) 使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的聯(lián)合 進行擴增，導致在含有嵌入分子內(nèi)部的靶序列的核酸分子存在時， 選擇性擴增鄰近于3'末端的靶序列。
核酸分子可以是DNA(包括cDNA)或RNA,或者可以是含有脫氧核糖 核苷酸、核糖核苷酸和/或天然核苷酸類似物之組合的分子。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在共有相同靶序列的未裂解DNA核酸分子的 存在下選擇性擴增裂解的核酸分子，其中裂解導致靶序列鄰近于3'末端。
因此，本發(fā)明另一方面提供了在含有嵌入分子內(nèi)部的靶序列的未裂解 分子存在時，從樣品中選擇性擴增由于分子的裂解而在鄰近于3'末端處具 有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括
(i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3，末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與裂解或未裂解 的核酸分子退火時，能形成游離的5，尾，5，尾為靶序列的3'末端延 伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5，尾互補的序 歹'J，導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了模板寡核苷酸的3'延伸；
(ii) 使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核苷酸接觸，所述第 二寡核苷酸用于在與模板寡核苷酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核 普酸與模板寡核苷酸的5'尾共享核苷酸序列；和
(iii) 進行樣品的擴增，其中
(a)在模板寡核苷酸的3，延伸延遲的情況下，通過自靶序列3，末端 起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5，尾，使得同模板寡核苷酸與未裂解的核酸分子中非鄰近于3'末端的靶序列的退火相比，模板寡核 苷酸與由于核酸分子的裂解而鄰近于3，末端的靶序列的退火被穩(wěn)
定化；和
(b) 與和未裂解的核酸分子退火的模板寡核苷酸的延伸相比，隨之 而來的模板寡核香酸與裂解的核酸分子的穩(wěn)定化退火增強了模板 寡核普酸的3'延伸效率；和
(c) 使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的聯(lián)合 進行擴增，導致選擇性擴增鄰近于3 ，末端的靶序列而不是嵌入核酸 分子內(nèi)部的靶序列，導致選擇性擴增裂解的核酸分子而不是未裂解 的核酸分子。
在一個實施方案中，裂解和未裂解的核酸分子是DNA分子。 除了區(qū)分具有鄰近于3，末端的靶序列的核酸分子與具有嵌入分子內(nèi)部 的靶序列的核酸分子外，模板寡核苷酸還可區(qū)分不同之處在于鄰近于3，末 端的序列的核酸分子，即區(qū)分3，末端。這是因為模板寡核苷酸的3'區(qū)域含 有特異于靶序列的核苷酸序列，常的情況是序列-特異性的寡核苷酸引物。 因此，即可從樣品的多個3'末端中選定鄰近于3，末端的靶序列。值得注意 的是，由于模板寡核苷酸與核酸分子退火時形成了 5，尾，模板寡核苷酸與 鄰近于3，末端的核酸序列之間的錯配會阻礙5'尾的復制，靶DNA序列3' 末端的延伸也同樣會受到阻礙。可使用這樣的排列來設計模板寡核苷酸， 該寡核苷酸不僅能區(qū)分鄰近于3，末端的靶序列和嵌入分子內(nèi)部的靶序列(經(jīng) 由5，尾)，還能區(qū)分鄰近于3'末端的序列有差別的3'末端。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了在混合3'末端群體的存在下，從樣品 中選擇性擴增在3，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包 括
(i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于3'末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與鄰近于3'末端 的輩巴序列退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3'末端延伸 提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序列， 導致在耙序列中添加與5'尾互補的序列；和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了所述寡核苷酸的3，延伸；(ii)使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核苷酸接觸，所述第 二寡核芬酸用于在與模板寡核苷酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核
苷酸與模板寡核芬酸的5'尾共享核苷酸序列；和
(m)進行樣品的擴增，其中
(a) 在模板寡核苷酸的3，延伸延遲的情況下，通過自靶序列3，末端 起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5'尾，使得同模板寡核苷酸與鄰 近于3'末端的非互補序列的退火相比，模板寡核苷酸與鄰近于3， 末端的靶序列的特異性退火被穩(wěn)定化；和
(b) 與和鄰近于3，末端的非互補序列退火的模板寡核苷酸的延伸相 比，隨之而來的模板寡核普酸與鄰近于3'末端的靶序列的穩(wěn)定化退 火增強了模板寡核苷酸的3'延伸效率；和
(c) 使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的聯(lián)合 進行擴增，導致在混合3，末端群體的存在下選擇性擴增鄰近于3， 末端的靶序列。
在一個實施方案中，核酸分子是DNA分子。
模板寡核苷酸的3'區(qū)域內(nèi)可包括經(jīng)修飾的堿基，當在核酸分子的3，末 端處雜交時，該修飾會阻斷核酸分子的3'延伸。
優(yōu)選地，延遲模板寡核苷酸3'延伸的3'修飾包括摻入3'末端核苷酸錯 配、在模板寡核芬酸靠近3'末端的3'區(qū)域處缺失或插入、它們的組合、或 任何其它能導致模板寡核苷酸3 ，延伸延遲的修飾。
通過靶序列3'末端延伸而進行的5'尾復制導致在3'末端鄰近處具有靶 序列的核酸分子的選擇性擴增。當5'尾不復制時，由于模板寡核苷酸3，區(qū) 域的修飾延遲或阻礙了 3'延伸，使模板寡核苷酸的退火不穩(wěn)定，退火的模 板寡核芬酸的3，延伸要么不發(fā)生，要么就以不顯著的速率發(fā)生。因此，5， 尾的復制會增強退火，從而提高模板寡核苷酸3，延伸的效率。
通過阻斷模板寡核苷酸的3'延伸，也可選擇性擴增鄰近于3'末端的靶 序列。當模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷時，將另一個與模板寡核苷酸的5' 尾共享序列的第三寡核苷酸用于擴增反應，以使熱循環(huán)擴增得以進行下去。 因此，由于延伸被阻斷，但更重要的是由于未發(fā)生5，尾復制，與嵌入核酸 分子內(nèi)部的靶序列退火的模板寡核苷酸的3，延伸不會發(fā)生，結(jié)果，使用第 三寡核芬酸的核酸擴增不會擴增出位于核酸分子內(nèi)部的靶序列。另一種會發(fā)生模板寡核普酸的3'延伸，但仍可以實現(xiàn)本發(fā)明的選擇性 擴增的不同方法包括使用在靶序列內(nèi)被修飾的模板寡核苷酸，以防止通過 擴增沿著寡核苷酸的反方向進行復制。防止復制的修飾包括在模板寡核苷 酸的3'區(qū)域插入能通過試驗中所用的特定聚合酶阻礙或阻斷寡核苷酸復制 的一個或多個堿基類似物或一個或多個脫堿基位點，或它們的任意組合。
結(jié)果，模板寡核苷酸的延伸產(chǎn)物在隨后的PCR循環(huán)中不能被復制。例如， 如果在DNA擴增中使用Taq DNA聚合酶，用RNA核香酸，如2-0-曱基 RNA核芬酸取代DNA核苷酸仍可以使模板寡核苷酸與靶序列雜交。然而， 由于存在經(jīng)修飾的核苷酸，沿著模板寡核苷酸的反方向進行的復制會被阻 斷或失效。不完整的拷貝不會參與下一步的擴增循環(huán)。為了使熱循環(huán)進行 下去，可利用與模板寡核苷酸的5，尾共享序列的第三寡核苷酸，因此，僅 僅會擴增出在3，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子，所述3，末端是被延伸 的與5'尾互補的3'末端。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了在含有非鄰近于3，末端而是嵌入分子 內(nèi)部的耙序列的分子存在時，從樣品中選擇性擴增在鄰近于3，末端處具有 靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括
(i) 使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3，末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3'末端鄰 近處或嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5， 尾為靶序列的3'末端延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡 核苷酸5，尾互補的序列，導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列； 和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所迷修飾阻斷了所述模板寡核苷酸的3，延伸， 或在模板寡核香酸的雜交區(qū)域具有修飾，所述修飾允許3，延伸，但 阻礙或阻斷了所述寡核苷酸3，區(qū)域中所述寡核苷酸的復制；
(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所迷第二寡核苷酸用于在與模板寡核 苦酸相反的方向上引發(fā)；
(iii) 使DNA樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核苷酸與模板寡核 苷酸的5'尾共享核苷酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去；
和(iv)進行樣品的擴增，其中
(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苦酸的3，延伸雖
未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或被阻斷的情況下，當模板
寡核苷酸與鄰近于3'末端的靶序列退火，而不是當模板寡核苷酸與
嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，模板寡核苷酸與樣品中的核酸
分子退火之后，模板寡核苷酸的5'尾發(fā)生復制；和
(b) 用第二和第三寡核苷酸進行擴增，利用復制的5，尾選擇性擴增 鄰近于3'末端的靶序列，由于5，尾不復制，模板寡核苷酸的3，延 伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，嵌入核酸分子內(nèi)部的靶 序列的擴增無法進行下去。
因此，本發(fā)明另 一方面提供了在含有嵌入分子內(nèi)部的耙序列的未裂解 核酸分子存在時，從樣品中選擇性擴增由于分子的裂解而在鄰近于3'末端 處具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括
(i)使DNA樣品與模板寡核普酸接觸，所述寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3'末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與裂解或未裂解 的核酸分子退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3'末端延 伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序 歹寸，導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾阻斷了所述模板寡核苷酸的3，延伸， 或在模板寡核芬酸的雜交區(qū)域具有修飾,所述修飾允許3，延伸，但 阻礙或阻斷了所述寡核香酸3 ，區(qū)域中所述寡核苷酸的復制；
(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡 核香酸相反的方向上引發(fā)；
(iii) 使樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核苷酸與模板寡核苷酸 的5，尾共享核苷酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去；和
(iv) 進行樣品的擴增，其中
(a)在模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的3'延伸雖 未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或被阻斷的情況下，在模板 寡核苷酸與因核酸分子的裂解而產(chǎn)生的3，末端鄰近處的靶序列退 火之后，而不是當模板寡核苷酸與嵌入未裂解的核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，模板寡核苷酸的5'尾發(fā)生復制；和
(b)用第二和第三寡核苷酸進行擴增，利用復制的5，尾序列選擇性
擴增鄰近于3，末端的靶序列，由于5'尾不復制，模板寡核苷酸的3， 延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，嵌入未裂解分子內(nèi)部 的靶序列的擴增無法進行下去，導致選擇性擴增裂解的核酸分子而 不是未裂解的核酸分子。 因此，本發(fā)明的另一方面提供了在具有不同3'末端的混合分子群體的
存在下，從樣品中選擇性擴增在3'末端鄰近處具有靶序列的核酸分子的方
法，所述方法包括
(i) 使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苦酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于3'末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3'末端鄰 近處的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3，末端 延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核普酸5'尾互補的序 歹ll，導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和
(c) 3'區(qū)域的修飾，所述修飾阻斷了模板寡核苷酸的3，延伸，或在 模板寡核芬酸的雜交區(qū)域具有修飾,所述修飾允許3，延伸，但阻礙 或阻斷了所述寡核苷酸3 ，區(qū)域中所述寡核苷酸的復制；
(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡核 苷酸相反的方向上引發(fā)；
(iii) 使DNA樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核苷酸與模板寡核 芬酸的5，尾共享核苷酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去； 和
(iv) 進行樣品的擴增，其中
(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的3，延伸雖 未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或:f皮阻斷的情況下，當模板 寡核苦酸與鄰近于3，末端的靶序列退火，而不是當模板寡核苷酸與 鄰近于3，末端的非互補序列退火時，模板寡核苷酸與靶序列的特異 性退火之后，模板寡核苷酸的5'尾發(fā)生復制；和
(b) 用第二和第三寡核苷酸進行擴增，利用復制的5，尾序列選擇性 擴增鄰近于3'末端的靶序列，由于5'尾不復制，模板寡核苷酸的3，延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，鄰近于3，末端的非互 補序列的擴增無法進行下去，導致在混合3，末端群體的存在下選擇
性擴增出鄰近于3'末端的草巴序列。 在一個實施方案中，核酸分子是DNA分子。
模板寡核苷酸可在其3，區(qū)域內(nèi)包括經(jīng)修飾的堿基，當在核酸分子的3， 末端處雜交時，該修飾可阻斷該分子的3'延伸。
優(yōu)選地，能阻斷模板寡核苷酸的3'延伸的3，修飾包括在3'末端摻入一 個或多個不可延伸的組成成分或核苷酸類似物，例如單個3，末端不可延伸 的堿基或堿基類似物，3'末端不可延伸的堿基與模板寡核普酸靠近3'末端的 3'區(qū)域的核苦酸錯配的組合，或在模板寡核苷酸靠近3'末端的3，區(qū)域摻入 脫堿基位點。更優(yōu)選不可延伸的堿基選自2',3，雙脫氧核苦酸、3'C3，C18或 其它長度的間隔區(qū)、3'磷酸化核苷酸、"肽核酸"堿基、"鎖定核酸"(LNA) 堿基、核苷酸胺衍生物、用尿嘧啶DNA糖基化酶處理過的尿嘧啶、RNA 或2，0-曱基RNA殘基、或其組合。
本領域技術人員應理解根據(jù)所用聚合酶的特性，也可使用其它阻斷 延伸的方法。例如，當需要使用校正聚合酶時，可聯(lián)合使用硫代磷酸堿基 和核苷酸錯配來阻斷延伸。
優(yōu)選第二寡核苷酸是另 一個模板寡核苷酸，即具有模板寡核苷酸的特 征，或是非-模板寡核苷酸，例如，在模板寡核苷酸的3，延伸僅被延遲而不 被阻斷的情況下，由與模板寡核苦酸延伸產(chǎn)物互補的核苷酸序列的單個區(qū) 域組成，或在模板寡核苷酸的3，延伸被阻斷的情況下，由與第三寡核苷酸 延伸產(chǎn)物互補的核苷酸序列的單個區(qū)域組成。
在優(yōu)選實施方案中，通過ES-PCR擴增的DNA分子的3'末端是由序列 -特異性限制性內(nèi)切核酸酶裂解產(chǎn)生的。更優(yōu)選限制性內(nèi)切核酸酶是序列-特異性曱基化敏感型限制性酶，.所述酶可允許根據(jù)本發(fā)明的方法選擇性擴 增未被曱基化的DNA而不是甲基化的DNA,或者反之，這取決于使用的 限制性酶是受DNA甲基化抑制的酶，如HpaII， Hhal, Bstul, Notl, Smal和 SacII，還是選擇性切割甲基化DNA的酶，如GlaI和BisI。按照此方式，本 發(fā)明的方法可以檢測兩個DNA樣品之間曱基化狀態(tài)的差異，從而提供一種 用于檢測患病組織的方法，所述組織中曱基化的改變與患病狀況有關。例 如，既涉及到DNA的脫曱基化，也涉及到其它特異性DNA序列的過度曱
20基化的曱基化狀態(tài)的改變與細胞向癌癥狀態(tài)轉(zhuǎn)化有關。因此，另一方面，
本發(fā)明提供了 一種試劑盒，用于從含有裂解和未裂解DNA的DNA樣品中 選擇性擴增裂解的DNA，根據(jù)本發(fā)明，該試劑盒含有(i)模板寡核香酸，(ii) 第二寡核苷酸，和(iii)第三寡核苷酸。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，選擇DNA的裂解位點以區(qū)分限制性位點 的存在或缺乏，從而檢測出DNA樣品之間的序列差異，如4企測出單核苷酸 多態(tài)性或突變。因此，本發(fā)明的方法可以進行基因型分型，其目的是進行 基因指紋分析，或診斷與基因組序列改變有關的遺傳病，或檢測可能是癌 細胞標志的特異性突變。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，可以檢測簡單核苷酸重復，包括單核 苷酸重復的不穩(wěn)定性，如一個或多個堿基對的缺失?？梢岳脝魏似账嶂?復附近限制性酶識別序列的存在來區(qū)分缺失變體的存在，所述限制性酶在 距其識別序列外側(cè)特定距離處具有裂解位點，本文稱之為"側(cè)翼切割者 (flanking cutter)"。如果該限制性位點不是方便地位于單核苷酸重復附近， 可通過例如第一輪PCR導入該限制性位點。當裂解位點和識別序列之間出 現(xiàn)堿基對缺失時，未發(fā)生缺失的重復DNA的消化產(chǎn)物3'末端的核苷酸序列 與發(fā)生缺失的重復DNA的消化產(chǎn)物3'末端核苷酸序列會有所不同。這是因 為一個或多個堿基對的缺失會導致裂解位點3，方向上的移位，必然導致裂 解位點序列的改變。因此，可使用與缺失變體特異性退火的模板寡核苷酸
設計來檢測該變體。
例如，可在模板寡核苷酸中摻入一段互補的單核苷酸重復，該重復與 消化缺失變體所得的DNA片段中的單核苷酸重復相匹配，其中所述變體的 重復序列中缺失了至少 一 個堿基對。模板寡核苷酸的重復序列可與鄰近于 消化片段3，末端的互補重復序列退火，但僅允許缺失變體消化片段進行3， 延伸。這是因為由未缺失的重復DNA產(chǎn)生的片段必然具有不同于缺失變體 所產(chǎn)生片段的核苷酸序列，導致模板寡核苷酸與消化片段3'末端之間的一 個或多個錯配，從而防止未缺失重復DNA的消化片段進行3，延伸。該才莫板 寡核苷酸設計不僅不會改變其選擇性擴增鄰近于3，末端的靶DNA而不是嵌 入DNA分子內(nèi)部的相同靶序列的能力，還表現(xiàn)出另外的能力，即區(qū)分具有 某種3'末端的DNA的能力。
無論限制性位點位于重復序列內(nèi)部還是重復序列下游，重復序列長度的變化會導致限制性酶裂解位點的改變，導致所產(chǎn)生片段的序列不同于未
經(jīng)缺失的重復DNA所產(chǎn)生的片段。
檢測單核苷酸重復的不穩(wěn)定性，如一個或多個重復的缺失提供了一種 方法，該方法可用于測定腫瘤細胞微衛(wèi)星中出現(xiàn)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。本領 域技術人員應理解本發(fā)明的此特定技術方案同樣適用于檢測二核芬酸或其 它重復，如三核苷酸和四核苷酸重復的不穩(wěn)定性，所述重復中按上文所述 適當安置(或?qū)?了限制性酶識別位點。
利用側(cè)翼切割者的本發(fā)明的實施方案也可用于檢測核酸分子中堿基對 的4翁入。
當堿基對插入導致產(chǎn)生核酸變體時，5，方向會發(fā)生裂解位點的移位， 從而導致與不存在插入相比，因裂解產(chǎn)生的3'末端的鄰近處具有不同序列。 本領域技術人員清楚地知道可使用側(cè)翼切割者檢測任何核酸分子中的缺失 或插入，側(cè)翼切割者的使用不限于檢測單核苷酸重復序列中的缺失，同樣 可用于因一個或多個堿基對的缺失或插入而產(chǎn)生的任何核酸分子。
因此，本發(fā)明的另 一方面提供了檢測樣品中的核酸分子是否存在缺失 或插入的方法，其中缺失或插入發(fā)生在限制性酶識別位點與其位于識別位 點外側(cè)特定距離處的裂解位點之間，所述方法包括
(i) 用限制性酶消化樣品，所述限制性酶在距其識別序列外側(cè)特定距離 處具有裂解位點，和
(ii) 測定通過裂解產(chǎn)生的3'末端鄰近處的核苷酸序列，其中3'末端鄰近 處的核苷酸序列取決于是否存在缺失或插入，其中當存在缺失或插入時， 分別在3'或5'方向上出現(xiàn)裂解位點的移位。
通過ES-PCR或通過其它選擇性擴增方法，可測定因側(cè)翼切割者的裂 解而產(chǎn)生的3'末端鄰近處的核普酸序列。
在另一個實施方案中，可使用本發(fā)明的方法測定和定量RNA轉(zhuǎn)錄物變 體。復制成cDNA的mRNA根據(jù)其相應的5， mRNA序列將會含有具有一系 列不同3，末端的cDNA群體。在已知外顯子序列的情況下，根據(jù)第一個外 顯子的序列同一性可制備出模板寡核苷酸，在可變剪接的mRNA之間，所 述寡核苷酸有所區(qū)別。
僅當模板寡核芬酸與3，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子退火時，本 發(fā)明模板寡核苷酸的5，尾為靶序列3'末端的延伸提供模板。與模板寡核苷酸5，尾互補的靶序列3，末端的延伸導致在耙序列中添加了與5，尾互補的序
列。因此，在允許模板寡核苷酸與靶序列退火，以及與模板寡核苷酸5，尾 互補的靶序列進行3'延伸的反應條件下，樣品中原先在3'末端鄰近處具有 靶序列的核酸分子現(xiàn)在在靶序列的5'方向上還包括與模板寡核苷酸5，尾互 補的其它序列。可使用與5'尾互補的該序列檢測樣品中原先存在的在3，末 端鄰近處具有靶序列的分子。
因此，本發(fā)明另一方面提供了檢測樣品中在3'末端鄰近處具有靶序列 的核酸分子的方法，所述方法包括
(i) 使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有
(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3'末端的靶序列基本上互補；
(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與鄰近于3'末端 的靶序列退火時，能形成游離的5'尾，5'尾為靶序列的3'末端延伸 提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序列， 導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和
(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了所述模板寡核苦酸的3'延伸；
(ii) 提供允許模板寡核苷酸與樣品退火的反應條件，其中模板寡核苷酸 與3，末端鄰近處靶序列的退火能使與5'尾互補的靶序列進行隨后的3， 延伸；
(iii) 在所述寡核苦酸的3，延伸被延遲或阻斷的情況下，提供允許與5， 尾互補的靶序列進行3，延伸的反應條件；和
(iv) 通過下述方法一全測在3'末端鄰近處具有靶序列的核酸分子
(1) 檢測因3'末端鄰近處靶序列的3'延伸而產(chǎn)生的與模板寡核苷 酸5，尾互補的核酸序列；或
(2) 利用因3，末端鄰近處靶序列的3，延伸而產(chǎn)生的與模板寡核苷 酸5'尾互補的核酸序列來復制在3'末端鄰近處具有靶序列的核 酸分子。
通過任何已知的檢測已知序列核酸分子的方法，可以檢測與模板寡核 苷酸5'尾互補的核酸序列，所述方法例如用放射性標記或熒光標記的核苷 三磷酸，如a32P-dCTP或Cy5-dCTP或生物素化的核苷三磷酸直接標記與5， 尾互補的靶序列的3'延伸反應產(chǎn)物，或通過雜交用序列特異性探針捕獲摻 入的互補序列，或直接捕獲與模板寡核苷酸5，尾互補的核酸序列。可通過多種方法將與模板寡核苷酸5'尾互補的核酸序列用于復制在3， 末端鄰近處具有靶序列的核酸分子。例如，可使用與摻入序列互補的引物
來引發(fā)沿著靶序列反方向延伸的合成?；蛘?，模板寡核苦酸的5'尾可為諸 如T7 RNA聚合酶的聚合酶提供啟動和起始位點，使得5，尾互補序列的添 加為通過聚合酶沿著靶序列進行的復制提供模板。通過任何已知的檢測已 知序列核酸分子的方法，如上文上述的包括雜交和PCR的方法，可以纟企測 被復制的在3 ，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子。
本領域技術人員非常清楚由RNA復制的cDNA是適用于本發(fā)明的核酸。
除非另有說明，整個說明書中的術語"含有"、"包含"、"包括"應被 理解成暗指包括提到的一個或一組步驟或成分，但并不排除任何一個或一 組其它步驟或成分。
本文所用冠詞"一個"指的是一個或一個以上(即至少一個)冠詞語法上 的賓語。例如，"一個成分"指的是一個成分或一個以上的成分。
附圖筒述


圖1:以圖解的方式概述了選擇性擴增裂解DNA而不是未裂解DNA 的末端-特異性PCR的原理。
圖2:經(jīng)BstIU-裂解的DNA和未裂解DNA(人21號染色體21q22.3.帶 上的串聯(lián)重復序列)上21 qTFMLHC/T和21 qTRC的《1物位點，對應于根據(jù) 本發(fā)明實施方案的具有3，末端核苷酸錯配的末端-特異性寡核苷酸引物，以 及在反方向上引發(fā)的第二寡核苷酸引物。
圖3:顯示出下述物質(zhì)Ct值的擴增曲線和表格(i)完全曱基化的DNA (CpGenome , Chemicon International, Inc.)和K562曱基化不足的DNA (hypomethylated DNA); (ii)分別得自匹配的正常組織樣品和結(jié)腸直腸腫瘤組 織樣品29/99和30/99的DNA; (iii)分別得自匹配的正常組織^f羊品和結(jié)腸直 腸腫瘤組織樣品34/03和35/03的DNA。
圖4A:皆為末端-特異性模板寡核苷酸的正向引物21qTFMLHC/T和反 向引物21qTRM13的引物位點，所述位點位于人21號染色體21q22.3.帶上
的串聯(lián)重復序列中。
圖4B:顯示出Ct值的表格和SYBR Green擴增曲線，所述曲線表明在檢測到完全曱基化的K562DNA之前，早就能檢測到甲基化不足的K562 DNA。在先于僅含完全曱基化DNA的樣品7個循環(huán)之前，即可清楚地檢測 到0.1% K562 DNA樣品水平(一個基因組當量)。
圖5A:具有3'末端核苷酸錯配的末端-特異性模板寡核苷酸MycRMl 和反向引物MycFCl的引物位點，所述位點位于在HpaII位點處被耙向的 Myc基因內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸直腸癌中的HpaII位點曱基化不足(Sharrard et al. 1992)。
圖5B: Ct值表格和擴增曲線，所述曲線表明與完全曱基化的DNA CpGenomeTM相比，4全測到K562 DNA中曱基化不足的myc DNA;與其匹 配的正常樣品34/03相比，檢測到結(jié)腸直腸腫瘤組織35/03中HpaII位點處
減少的曱基化。
圖6A:耙向LINE逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座因子的5'(啟動子)區(qū)域的引物位點，其 對應于用作正向和反向擴增引物的插入模板寡核苷酸，以及HEX-標記的 LPAHex探針的核苦酸序列。
圖6B:用SYBR Green或HEX-標記的探針檢測到的、由實質(zhì)上甲基化 不足的K562 DNA或完全曱基化DNA擴增得到的擴增曲線和顯示出Ct值 的表格。
圖7A:根據(jù)本發(fā)明的實施方案，用通過磷酸基團阻斷3'延伸的模板寡 核苷酸(對應于在反方向上引發(fā)的第二寡核苷酸引物)和在正方向上引發(fā)的 JOELUX引物靶向Alu元件共有序列中第一個BstUI位點的引物位點。
圖7B:由實質(zhì)上曱基化不足的K562 DNA或曱基化CpGenome DNA 擴增得到的擴增曲線和顯示出Ct值的表格。
圖8A:通過hMLHl基因CpG島內(nèi)的Glal位點靶向曱基化DNA的引 物位點。模板寡核苷酸的3'末端摻入了 3個錯配，當用尿嘧啶DNA糖基化 酶消化時，其中兩個錯配轉(zhuǎn)變成脫堿基位點，對應于根據(jù)本發(fā)明實施方案 的MLHRev3反向引物和正向LUX引物。
圖8B:由曱基化CpGenome DNA或非曱基化DNA擴增得到的擴增曲 線和顯示出Ct值的表格。
圖9A:檢測BRAF基因中的點突變。根據(jù)突變位點T—A顛換的存在(靶 序列中的下劃線部分)，第一輪PCR引物BRFMX可用于導入Xbal限制性 位點。圖9B:檢測BRAF基因中的點突變。ES-PCR引物BRFU與外部重疊 JOELUX引物和反向引物BRF2聯(lián)合使用。
圖9C:顯示出結(jié)腸直腸癌細胞系WiDr中突變BRAF基因的選擇性擴
增的擴增曲線。
圖10A(i):鄰近于Bbr71限制性位點的單核苷酸重復的限制性酶裂解產(chǎn)物。
圖10A(ii)和10A(iii):裂解分子下方的那條鏈使用末端轉(zhuǎn)移酶的延伸產(chǎn) 物，以及與延伸產(chǎn)物退火的引物。
圖10A(iv):與圖10A(i)所示的短和長分子經(jīng)裂解后下方的那條鏈進行 ES-PCR退火的模板寡核苦酸。
圖IOB(i):在鄰近于Mmel限制性位點處具有9或10個重復的A的分子。
圖10B(ii):用Mmel裂解圖10B(i)所示分子的產(chǎn)物。
圖IOB(iii):顯示出源自具有9個A的分子(圖10B(i))的圖10B(ii)所示 分子裂解末端特異性連接的接頭連接。
圖10B(iv):與"9"和"10"分子經(jīng)裂解后下方的那條鏈進行ES-PCR 退火的模板寡核苷酸。
圖11 A(i):顯示出MboII位點位置和反向引物序列的NR22微衛(wèi)星區(qū)域。
圖11A(ii)和11 A(iii):在用MboII消化后，用于擴增NR22微衛(wèi)星中不 同長度的單核苷酸重復的兩個模板寡核苷酸FlNR22-0和J5NR22-4的序列。
圖11B(i)和11B(ii):顯示出血液DNA和NR-22微衛(wèi)星內(nèi)攜有缺失的 HCT116細胞DNA的擴增結(jié)果的擴增曲線。
圖12A:圖解顯示了用限制性酶進行的消化，所述酶在距其識別序列 外側(cè)特定距離處具有裂解位點，由于識別序列和裂解位點之間插入了 4bp， 裂解位點發(fā)生了移位。僅當識別序列和裂解位點之間存在插入時，才會發(fā) 生經(jīng)消化DNA的3 ，延伸，這是因為模板寡核苷酸中存在2 ， O-甲基核苷酸(下 劃線)，當2， O-曱基核苷酸與經(jīng)消化DNA的3，末端雜交時，會阻斷經(jīng)消化 DNA的3，延伸。當DNA中具有插入時，裂解位點發(fā)生了移位，使得模板 寡核苷酸的2，0-甲基核苷酸不再與3，末端雜交。
圖12B:用于ES-PCR選擇性擴增lbp或4bp插入突變的寡核苷酸。模 板寡核苷酸利用2，0-曱基核苷酸阻斷經(jīng)裂解靶DNA3，末端的3'延伸。
26圖12C:顯示出包括lbp或4bp插入的DNA,而不是不具有插入的 DNA,即"正常，，DNA的選#^生擴增的擴增曲線。
圖UA和UB:以"未裂解"和"裂解，，DNA表示的受試DNA序歹寸，
在一系列評價模板寡核苷酸修飾(圖13B)對ES-PCR的影響的ES-PCR實驗
中使用的、在其3，末端通過磷酸阻斷延伸的參照模板寡核芬酸AluPhB，以 及第二和第三寡核苷酸。
圖13C:顯示出使用圖13B給出的不同模板寡核苷酸得到的ES-PCR 結(jié)果的擴增曲線。
定義
本發(fā)明上下文中所用的術語"樣品"指的是任何含有核酸分子(一般為 DNA和/或RNA)的生物樣品。樣品可以是組織、細胞或其拔」取物，或者可 以是核酸分子的純化樣品。術語"樣品，，的使用并未暗示鄰近于核酸分子3， 末端或嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列的存在。為了選擇性擴增鄰近于3'末端 的靶序列，不需要樣品中存在嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列。因此，使用模 板寡核苷酸來擴增在鄰近于3'末端處具有靶序列的核酸分子，而不用管樣 品中是否也存在嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列。
本發(fā)明上下文中所用的術語"靶序列"指的是本發(fā)明的模板寡核苷酸 與之特異性退火的核酸序列，所述退火憑借的是模板寡核苷酸的3'區(qū)域具 有與草巴序列基本上互補的核苷酸序列。當所處位置鄰近于3'末端時，靶序 列就是通過ES-PCR選擇性擴增的典型核酸分子。
本發(fā)明上下文中所用的術語"鄰近于3，末端"指的是緊接核酸分子3， 末端的5'側(cè)并向3'末端的5'側(cè)延伸的核苷酸區(qū)域， 一般包括末端核苷酸。 自具有3'末端的核酸分子的末端核苷酸起始的"鄰近于3'末端的"區(qū)域在 長度上對應于與靶序列互補的模板寡核苷酸的3 ，區(qū)域。
本發(fā)明上下文中所用的術語"嵌入核酸分子內(nèi)部"指的是所處位置不 是上述的3'末端鄰近處，而是從3，末端往3'末端的5'側(cè)移位了至少一個核 苦酸。因此，嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列可位于核酸分子內(nèi)距離3'末端一 個或多個核苷酸的位置。
本發(fā)明上下文中所用的術語"靶向的分子"或"靶向的核酸分子"指 的是在鄰近于3'末端處具有靶序列，因此可通過本發(fā)明的方法選擇性擴增的核酸分子。
本發(fā)明上下文中所用的術語"裂解的核酸分子"欲指已被限制性內(nèi)切 核酸酶或任何其它能產(chǎn)生具有3，末端的核酸的酶消化的分子，其包括已被
限制性內(nèi)切核酸酶或其它能產(chǎn)生3'末端的酶消化的DNA。
本發(fā)明上下文中所用的術語"模板寡核苷酸"指的是含有5，區(qū)域的核 酸寡核苷酸，當其3'區(qū)域與核酸退火時可形成5'尾，并使得與其退火的位 于核酸分子3'末端鄰近處的靶序列能進行3'延伸。在本發(fā)明的某些實施方 案中，由于發(fā)生了寡核苷酸的3，延伸，模板寡核苷酸被摻入PCR擴增子。 此時，模板寡核苷酸被用作正向引物。
在其它實施方案中，由于寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或由于寡核苷酸3， 區(qū)域的復制被阻斷，模板寡核苷酸未被摻入PCR擴增子。在這些設置中， 另一個與模板寡核苷酸5，尾共享序列的"第三"寡核苷酸被用作正向引物。
本發(fā)明的模板寡核苷酸可含有為了延遲或阻斷3，延伸、或為了阻斷寡 核苷酸的復制可被摻入寡核苷酸的非-DNA核苷酸，如RNA核苷酸、核苷 酸類似物或其它非-核酸分子。本領域技術人員應懂得任何延遲或阻斷寡 核芬酸3，延伸或阻斷寡核苦酸復制的方法都可用于本發(fā)明的模板寡核苷 酸，只要選定的方法不會阻止靶序列的3，延伸即可。
本發(fā)明上下文中所用的術語"基本上互補"指的是核酸之間的互補性， 所述互補性使得足夠的雜交能夠發(fā)生，從而根據(jù)本發(fā)明選擇性擴增具有位 于3'末端鄰近處，而不是嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列的核酸分子。因此， 不是寡核苷酸中的所有堿基都需要與其欲雜交的分子區(qū)域互補，寡核苷酸 僅需要含有足夠多的互補堿基，使得寡核苷酸能識別其"靶"分子并與之 雜交即可。因此，術語"基本上雜交，，包含摻入了一個或多個錯配、缺失、 插入、缺失和插入的組合或任何其它不會阻止核酸特異性退火的序列修飾 的核酸。
本發(fā)明上下文中所用的術語"延遲的3，延伸"指的是模板寡核苷酸3， 延伸的進行受阻但未被阻斷，使得與不存在延遲3，延伸的修飾時相比，寡 核苷酸3，延伸發(fā)生的效率降低。因此，在此設置中，模板寡核苷酸將被用 作擴增反應中的正向引物。
本發(fā)明上下文中所用的術語"阻斷的3，延伸"指的是模板寡核苷酸的3， 延伸實際上不存在，使得擴增反應不會進行，或以不可使用的速率進行，除非在反應中加入另一個"第三，，寡核香酸，該寡核香酸與模板寡核芬酸 的5'尾共享序列，由此會發(fā)生3'延伸。
本發(fā)明上下文中所用的術語"擴增"指的是制備一個或多個拷貝的靶
向分子，包括但不限于通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增核酸分子。PCR指的是 DNA的指數(shù)擴增，除此之外，也可指DNA的線性非指數(shù)擴增，本領域^支 術人員應能意識到任何形式的擴增都適用于本發(fā)明。
本發(fā)明上下文中所用的術語"側(cè)翼切割者"指的是限制性內(nèi)切核酸酶， 該酶在距其識別序列特定距離處裂解核酸。
發(fā)明詳述
圖1顯示了本發(fā)明具體體現(xiàn)的末端-特異性PCR或ES-PCR的原理。 ES-PCR取決于使用至少一種寡核苷酸，本文稱之為模板寡核苷酸，它的延 伸在某種程度上部分或完全地被阻斷。模板寡核苷酸被設計成與通過例如 限制性消化產(chǎn)生的核酸分子的3'末端重疊。模板寡核苷酸的3'部分與鄰近 于核酸分子裂解末端的特定序列基本上匹配，而5'部分含有通過模板寡核 苷酸與核酸分子退火可形成尾的核酸序列。
通過模板寡核苷酸與裂解的核酸分子退火，模板寡核苷酸的延伸被延 遲或阻斷，但耙向分子的3，末端能被延伸，以復制模板寡核苷酸的5，尾。 嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列由于例如未被限制性酶在所需的限制性位點裂 解，因此雖可與模板寡核苷酸退火，然而，因在退火位點缺乏3，末端，不 會發(fā)生靶序列的3，延伸，進而也不能復制模板寡核苷酸的5，尾。重要的是， 通過與模板寡核苷酸5'尾互補的游離3'末端的延伸而添加到靶序列中的核 苦酸序列隨后被用于擴增靶向的核酸分子。添加的序列也允許進行ES-PCR 修飾，例如，摻入諸如生物素化核苷酸的標記物，所述標記物可用于選擇 性捕獲含有延伸的3'序列的分子。本文示范使用了兩種不同類型的模板寡 核苷酸，然而，本領域技術人員清楚地知道本發(fā)明的方法可使用任何摻入 模板寡核苷酸的3'末端，導致延伸被延遲或阻斷的設計特征。
通常，本發(fā)明分析的核酸分子含有DNA。然而，本領域技術人員容易 意識到本發(fā)明的方法也適用于其它核酸分子，如RNA,前提是要提供適當 的試劑，例如適于擴增或復制RNA的RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。本領域技 術人員也容易意識到通過復制模板寡核苷酸5，區(qū)域而形成的摻入的尾可被直接;險測，或用于通過非熱循環(huán)的其它方法來復制靶核酸序列。
在一個實施方案中，模板寡核苷酸能與靶序列微弱退火，但它被設計
成由于其3'末端具有精心設計的與靶序列的錯配，使得模板寡核普酸的3， 延伸非常微弱。然而，如果模板寡核苷酸與鄰近于3，末端的把序列退火， 使用模板寡核苷酸作為模板，可使核酸，如基因組DNA進行3，延伸。隨后， 模板寡核苦酸與靶向核酸分子之間雜交區(qū)域長度的增加使得模板寡核苦酸 的雜交穩(wěn)定化，大大增強了其目前引發(fā)和在靶核酸分子上延伸的效率。一 旦錯配的模板寡核苷酸摻入擴增子，PCR會有效地繼續(xù)進行，因為原先錯 配的模板寡核苷酸現(xiàn)在與其輩巴序列完全匹配。在一個實施例中，通過聯(lián)合 模板寡核苷酸的短3'區(qū)域和模板寡核苷酸上的末端錯配，未裂解DNA上的 引發(fā)受到限制。除了末端錯配外，還可以使用其它方法來限制模板寡核苷 酸的引發(fā)。
在本發(fā)明利用末端錯配的實施方案中，除非模板寡核苷酸5'尾的復制 已經(jīng)發(fā)生，否則延伸是無效的。可使用任何其它能減弱或延遲模板寡核苷 酸延伸的修飾來進行ES-PCR，例如在模板寡核苷酸中摻入精心設計的短缺 失或插入。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可用不可延伸的堿基使模板寡核苷酸 在其3，末端終止，或模板寡核苷酸可包括阻止3，延伸的修飾。對于末端完 全被阻斷的ES-PCR寡核苷酸而言，反應還需要另一個第三寡核苷酸，以最 終延伸耙向的核酸分子。所述第三寡核苷酸由模板寡核苷酸5，尾的核酸序 列組成，或者可與靶序列重疊以包括一些靶-特異性序列。如果用于擴增的 第三寡核苷酸引物僅由模板寡核苷酸5，尾的序列組成，就可以使用一套基 因或片段-特異性的，但含有共有延伸的模板寡核苷酸多重擴增不同的核酸 分子。在此實施方案中，可使用任何阻斷延伸的方法，包括但不限于C3間 隔區(qū)，用雙脫氧核苷酸終止，磷酸化，使用胺、脫堿基位點、尿嘧啶(與尿 嘧啶DNA糖基化酶一起保溫)和/或2， O-曱基RNA殘基。當使用不能被DNA 聚合酶復制的DNA類似物時，不論模板寡核苷酸3，延伸是否進行，都可進
板寡核苦酸。
模板寡核苷酸可在其3，區(qū)域內(nèi)包括修飾的堿基，所述堿基當與核酸分 子3，末端雜交時，會阻斷該分子的3，延伸。這樣就可以選擇性擴增在其3'末端鄰近處具有靶序列的靶DNA,所述靶DNA的3，末端不與模板寡核芬 酸經(jīng)修飾的堿基雜交，因此其3，延伸不會被阻斷。
模板寡核苷酸可含有與靶序列互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列跨 越一個以上可能會發(fā)生核酸分子3，末端雜交的位置。因此，根據(jù)模板寡核 苦酸上3'末端的雜交位置，所得的模板寡核普酸5，尾可包括也可不包括與 靶向核酸分子互補的序列。阻斷雜交核酸分子3'末端的3'延伸的經(jīng)修飾堿 基可定位于模板寡核苷酸中一個或多個可能的位置，所述位置為以非-靶向 核酸分子3'末端雜交為代表的3'末端雜交位置，以使核酸分子3'延伸的發(fā) 生僅從不同于靶向核酸分子3'末端的雜交位置開始。
至于其它擴增方法，諸如退火時間、延伸時間和溫度的條件取決于特 異性的序列并需要分別進行優(yōu)化。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)兩個或多個對PCR反應有 用的階段，在設計ES-PCR時有更大的靈活性。 一般說來，第一階段一般使 用較低的雜交溫度和較長的保溫時間，因為預期在通常較短(低Tm)的模板 寡核苷酸部分上引發(fā)靶會相對無效。對于錯配和插入/缺失模板寡核苷酸而 言，第一階段一般會延長保溫時間，從而在通過靶序列的3'延伸而使結(jié)合 穩(wěn)定化之后，能進行最終的延伸。最初的5個循環(huán)之后，PCR有望主要由 在其整個長度上與其靶匹配的寡核苷酸驅(qū)動，因此，第二階段使用較高的 溫度(通常保溫時間較短)。第二階段可使用較短的變性時間(有時使用較低 的溫度-這些實施例中未顯示)，因為目前在反應中占優(yōu)勢的PCR產(chǎn)物比在 第一階段顯得重要的不同DNA分子更容易變性。變性時間較短的好處在于 Taq DNA聚合酶較不易失活。
然而，ES-PCR不需要使用兩個階段。通過使用模板寡核苷酸，特別是 完全被阻斷的模板引物中較長的互補區(qū)域，可開發(fā)出一-階段PCR。
在ES-PCR之前，可在分開的反應中進行樣品的限制性酶消化，也可 在單個消化-擴增反應混合物中進行所述消化，隨后立即進行PCR。
至于在〗寺擴增的DNA末端添加共有序列的其它方法(Elnifro, EM et a. 2000; Wittwer, CT et al. 2001)，可以容易地使ES-PCR適合于多重PCR。
通過本領域技術人員眾所周知的標準方法可一全測到ES-PCR產(chǎn)物，所 述方法包括但不限于凝膠電泳，使用非-特異性DNA結(jié)合染料，如 SYBRGreen實時監(jiān)測，序列特異性熒光探針或與微陣列雜交。
為了易于理解本發(fā)明并將其具體實施，下文將通過非-限制性的實施例描述特別優(yōu)選的實施方案。
實施例l:使用單個錯配的模板寡核苷酸選擇裂解的DNA
靶向的區(qū)域是人染色體21的帶21q22.3上存在的串聯(lián)重復(共有序列大 小為74個;威基對，GCGTGGCTGTCTCCACTGAGTCCCGGGCACGGGTC
(2004年5月裝配)中，重復區(qū)域的基因組大小是2218個堿基對，chr21: 46536826-46539043。使用限制性酶Bstul在下劃線的CGCG位點切割基因 組DNA。 BstUI的切割因胞嘧啶曱基化而被阻斷，因此，僅有未甲基化的 DNA才能形成限制性末端。
在本實施例中，模板寡核苷酸也用作"正向，，引物，并具有與靶基因 組DNA的3，末端錯配。所用序列和引物示于圖2。正向的錯配引物和模板 寡核苷酸是21qTFMLHC/T， 5， CACTCCCACTCGGGAGGAATTTAATCTA 3，，反向的完全匹配的引物是21qTRC, 5, ACCCGTGCCCGGGACTCA 3 ，。下劃線的堿基是與最初的靶序列不匹配的堿基。
在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1， 2,7 mM MgCl2， 0.2mM dCTP， 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dA丁P， 0.4 mM dUTP, 200 nM引物，1/125,000稀 釋的SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563), 20 nM熒光素才交準染 料(BioRad), 1單位BstUI (New England Biolabs)和0.5單位Platinum Taq聚合 酶(Invitrogen)中進行PCR。將Corbett RotorGene 3000的運行i殳置為60°C 5 分鐘，95。C 2分鐘，然后95。C 15秒-65。C 3分鐘共5個循環(huán)，然后95°C 5 秒-65。C 30秒共40個循環(huán)。在最初的60。C保溫5分鐘時進行BstUI消化。 前5個循環(huán)中較長的延伸時間能使靶DNA在靶/引物退火不穩(wěn)定的條件下延
存在熒光素的原因是反應有時在BioRadlcycler中運行，該儀器的校準 需要痕量的熒光素(有時也可以是其它染料)。預期低水平的熒光素對結(jié)果不 會產(chǎn)生顯著的影響。
用于擴增的DNA是所有CpG位點都被酶促曱基化的CpGenome DNA (Chemicon),得自人慢性髓性白血病細胞系K562的DNA以及兩對匹配的 結(jié)腸直腸腫瘤DNA和鄰近的正常直腸DNA。圖3的第一部分顯示了完全 甲基化的DNA以及在很多重復序列處基本上曱基化不足的K562 DNA的擴增曲線。對于未曱基化的DNA而言，擴增具有高度選擇性，因為K562的 擴增領先于完全曱基化的CpGenome DNA約13個循環(huán)。圖3B和3C顯示 的兩個例子為結(jié)腸直腸癌DNA和分離自鄰近的正常組織的DNA。在這兩 個例子中，癌癥DNA較早的擴增(早2.5至3個循環(huán))表示其相對于正常組 織而言曱基化不足。
實施例2:正向和反向寡核普酸都是具有3，末端錯配的模板寡核苷酸
使用正向和反向錯配模板寡核苷酸為引物擴增得自染色體21q的相同 重復序列。PCR條件與實施例1中的相同，不同之處在于包括100nM探針 21qTRHEX 5， HEX- CCGTGCCCGGGACTCAGTGG BH1 (得自Sigma)，反 向引物是21qTRM13, 5， CCCTCACACTCGGTTAGCCTGACT. 3'。下劃線的 堿基是與最初的靶序列不匹配的堿基。
使用Corbett RotorGene 3000,以下述程序進行實時PCR: 60°C 5分鐘, 95。C 2分鐘，然后95°C 15秒-65°C 3分鐘共3個循環(huán)，然后95。C 5秒-65。C 15秒共60個循環(huán)。通過在TEX (10 mM Tris HCl pH8, 0.1 mM EDTA, 0.01% Triton X100)中稀釋制備出3 ng/uL人基因組DNA，其中含有不同比 例的K562 DNA (已知其CpG曱基化的水平降低)和CpGenome DNA (人工曱 基化DNA)。在每個25 )iL反應中加入1 DNA混合物。
SYBRGreen結(jié)果示于圖4。在此實驗中，通過使用特異性探針獲得的 額外的特異性未帶來什么好處，結(jié)果類似于SYBR Green結(jié)果，因此未在圖 中顯示。
檢測到K562 DNA的擴增領先于完全曱基化的DNA 20個循環(huán)以上， 在領先于僅含有完全曱基化DNA的樣品7個循環(huán)時，清楚檢測到0.1% K562 DNA樣品水平(3pg, —個基因組當量)。
實施例3:乾向 c國myc(單拷貝基因)內(nèi)的HpaII位,泉
在本實施例中，人基因組HG17 Build中的c-myc基因序列GAGCGCCA
CCCGGAGTTGGAAAA, chr8:128，822,153-128，822，223內(nèi)的HpaII位點(下劃 線)被靶向。Sharrard et al 1992發(fā)現(xiàn)結(jié)腸直腸癌中的HpaII位點甲基化不足。 圖5A顯示了該區(qū)域的序列和模板寡核苷酸(MycRMl)以及引物MycFCl 。
在分開的反應中用HpaII切割DNA樣品。于37°C在New England Biolabs緩沖液1 (10 mM Bis Tris丙烷-鹽酸(Propane-HCl)， 10 mM MgCl2, 1mM DTT (pH 7.0， 25°C)) + 100 ug/mj BSA中消化2小時。在30/iL的體積中 用5個單位的HpaII切割30ng DNA。 70°C熱處理20分鐘后，加入24 jiL TEX (10mM Tris pH7,4, O.lmM EDTA， 0.01% Triton X100)和6pL 50 mM EDTA, 使最終的鎂離子和EDTA濃度相等，最終的DNA濃度為0.5 ng/juL。將2^L 這些樣品用于每個PCR。
在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 50 mM KC1, 2.7 mM MgCl2, 0.2%甘 油，0.2mM dCTP， 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 0.4 mM dUTP, 200 nM引物， 1/125,000稀釋的SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563)， 20 nM焚 光素校準染料(BioRad)和0.5單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行 PCR。將Corbett RotorGene 3000的運4亍設置為95°C 2分鐘，然后95°C 15 秒- 65。C 3分鐘共5個循環(huán)，然后95。C 5秒-65°C 30秒共45個循環(huán)。
與完全曱基化的CpGenome DNA相比，在K562 DNA中，錯配引物 MycRMl能檢測到曱基化不足的myc DNA。與其匹配的正常樣品34/03相 比，在結(jié)腸直腸癌肺瘤樣品35/03中，錯配引物MycRMl還可4全測到HpaII 位點降低的曱基化。(參見圖5B)。
實施例4:插入模板寡核苷酸
本實施例顯示出無需使用引物中的3，末端錯配，使用距離3，末端幾個 核苷酸處安置的插入即可達到選擇的目的。這種"插入模板寡核苷酸"特 別適于在延伸點序列可能有所不同的重復序列中存在靶向限制性位點的情況。
當重復序列類別有很大的序列不均 一性時，針對共有序列設計的錯配 引物實際上與大量突變序列完全匹配。這會導致突變體的選擇性富集，并 會降低ES-PCR的選擇效力。針對這種情況，我們研究出改良的方法，所述 方法包括設計出引物，與重復類別的共有序列相比，所述引物具有短的插 入或缺失。4艮少有或沒有突變序列會在相同位置具有相同序列、相同長度 的缺失或插入，這一點已被詳細闡述。盡管一些3，堿基(在所示情況下為6 個)與革巴匹配，但缺失(或所示情況中的插入)會阻止3'末端適當定位，因此 會延遲延伸。
在本實施例中，LINE逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件5，(啟動子)區(qū)內(nèi)的兩個HpaII位 點被靶向。通過使用圖6A中所示的兩個插入模板寡核苷酸/引物即可選擇 出在兩個HpaII位點處已^皮切割的序列。
34檢測用Dral(識別位點TTTAAA ，不是曱基化每文感型)和HpaII(CCGG, 曱基化-敏感型)處理過的5ng DNA。在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1, 2.7 mM MgCl2， 400 mM甜菜堿，0.2mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 0.4 mM dUTP, 10nM MLHJ65選擇性引物，200 nM插入引物，50 nM HEX-標記的LPAHex探針，1/125,000稀釋的SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563), 20 nM焚光素校準染料(BioRad)和0.5單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。將Corbett RotorGene 3000的運行設置 為95。C 2分鐘，然后95°C 15秒，60°C 20秒，65°C 3分鐘共5個循環(huán)，然 后95°C 15秒，65°C 30秒共50個循環(huán)。
從圖6B中可以看出，基本上曱基化不足的K562DNA的擴增領先于完 全曱基化的DNA約14個循環(huán)。
實施例5: 3，阻斷的模板寡核苷酸
使用圖7A所示的模板寡核苷酸和引物靶向Alu元件共有序列中的第一 個BstUI位點。因被其3'末端的磷酸基團所阻斷，模板寡核苷酸BAFMLJ15 不能被延伸。方框內(nèi)的寡核苷酸部分具有與JOELUX "第三"寡核苷酸相 同的序列，并最終能將JOELUX摻入PCR產(chǎn)物。JOELUX攜有在3，末端附 近結(jié)合的JOE熒光組成成分，當存在于雙鏈DNA中時其熒光會增加。
在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1, 2.7 mM MgCl2, 0.2mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 0.4 mM dUTP， 40 nM AluRev21, 10 nM BAFMLJ15, 60 nM JOELUX引物，1/125,000稀釋的SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563), 20 nM熒光素校準染料(BioRad), 1單位 BstUI (New England Biolabs)和1單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行 PCR。將Corbett RotorGene 3000的運行設置為37。C 5分鐘，95。C 2分鐘， 然后95°C 1分鐘-60°C 40秒共5個循環(huán)，然后95。C 15秒-68°C 20秒共 45個循環(huán)。
使用被單個磷酸-阻斷的模板引物，相對于甲基化CpGenome DNA的擴 增而言，基本上甲基化不足的K562 DNA的擴增被延遲6個PCR循環(huán)以上。 實施例6:使用ES-PCR選擇甲基化DNA
被靶向的區(qū)域是hMLHl基因CpG島(hgl7 freeze中的chr3:3"7009233-37010360)內(nèi)的Glal位點(圖8A)。才艮據(jù)Sibenzyme公司的出版物(http:〃science. sibenzyme.com/article8 article 11 l.由ml), 4義當內(nèi)部的C被甲基化時，Glal才能切割序列GCGC。僅當其識別位點中的所有4個C都被曱基化時，才 能觀察到Glal的完整活性。因此，GlaI僅對CGCGCG位點處完全甲基化的 DNA表現(xiàn)出完整活性。已發(fā)現(xiàn)該位點位于hMLHl基因的CpG島內(nèi)的 chr3:37，009,348-37,009,353。
完全甲基化的DNA 'CpGenome，得自Chemicon。該DNA的所有CpG 位點已被酶促曱基化，使用Glal處理該DNA。從血液中分離未曱基化的 DNA并用限制性酶HhaI處理以用作對照。該酶識別相同的位點，但僅當該 位點未被曱基化時才會切割。(注此位置有兩個Hhal位點彼此相鄰。)用 于選擇切割末端的模板寡核苷酸是MLHJ65。該寡核苷酸具有5，延伸，允許 摻入JOE-標記的LUX引物JOELUX。其3'末端還具有3個錯配，當用尿嘧 啶DNA糖基化酶消化時，其中兩個錯配轉(zhuǎn)變?yōu)槊搲A基位點。未經(jīng)修飾的引 物MLHRev3被用作反向引物(參見圖8A)。
于37。C,在50 pL 1 xSE緩沖液Y (33 mM Tris匿乙酸(acetate)， 66 mM醋 酸鉀，10 mM醋酸鎂，1 mM 二硫蘇糖醇pH 7.9， 25。C) + 100嗎/ml牛血清白 蛋白中，用16單位Glal將1嗎完全甲基化的DNA(得自Chemicon)處理2 小時。此反應中也包括20單位第二種限制性酶Dral。該酶識別序列 TTTAAA，因此無論甲基化狀態(tài)如何都會切割DNA。熱滅活(70。C 15分鐘) 之后，加入140 |iL TEX (10 mM Tris HC1， 0.1 mM EDTA, 0.01% Triton X-100) 和10 50 mM EDTA,使最終的DNA濃度為5 ng/pL。用相同方法處理未 切割的對照，不同之處在于加入50。/。甘油替代限制性酶。按相同方法制備 用Hhal切割的血液DNA,不同之處在于使用的是New England Biolabs緩 沖液3 (50 mM Tris-HC1, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9， 25。C)和20單位Hhal。
檢測5 ng經(jīng)切割或未切割的DNA。在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 50 mM KCl， 4 mM MgCl2, 800 mM甜菜i威，0.2mM dNTP， 10nM MLHJ65選擇 性引物，200 nM MLHRev3反向引物，40 nM JOELUX熒光LUX引物, SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563), 20 nM熒光素校準染料 (BioRad)， 0.02單位尿嘧咬DNA糖基化酶(New England Biolabs)和0.5單位 Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。將Corbett RotorGene 3000的運 行設置為95°C 90秒，然后95。C 30秒，60。C 10秒，72。C 30秒共5個循環(huán)， 然后95。C 1秒，60。C 10秒，72。C 30秒共55個循環(huán)。同時進行三份相同的檢測。
已用Glal切割的曱基化DNA的擴增領先于未經(jīng)切割的曱基化DNA平 均6個循環(huán)。已用Hhal切割的對照非甲基化DNA的擴增領先于未經(jīng)切割 的DNA平均8.4個循環(huán)。數(shù)據(jù)表明與未經(jīng)切割的DNA相比，在DNA被 切割，產(chǎn)生特異性末端的兩種情形下，擴增顯著優(yōu)先。經(jīng)HhaI-切割的DNA 較早的擴增與Hhal和Glal酶不同的切割效率有關。
實施例7:檢測BRAF基因中的點突變
在結(jié)腸直腸癌中，BRAF基因中的突變是共同的，幾乎總是涉及由T 至A的顛換導致的V600E突變(Chan et al. 2003)。在兩步法中使用ES-PCR 以區(qū)分分別得自血液和結(jié)腸直腸癌細胞系WiDr的DNA中的突變和正常序 列。在第一輪PCR中，使用含有兩個錯配的引物BRFMX(圖9A(i);下劃線 的為錯配)5, CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCT￡IAG 3， 導入XbaI限制性位點，所述位點取決于突變位點A堿基的存在(圖9A(ii); 下劃線的為突變位點)。
在PCR中，同時使用引物BRPMX與反向引物BRFR1以擴增靶區(qū)域。 圖9A(iii)顯示了所得擴增DNA的序列，下劃線的是Xbal位點。
在第二輪中，聯(lián)合使用ES-PCR引物BRFU和外部重疊JOELUX引物 以及反向引物BRFR2 (圖9B)。圖9B中未顯示被復制的上方那條鏈，因為 Xbal提供了 4個堿基的突出端，當其被復制時會提供與選擇性寡核苷酸 BRFU的多個錯配，因此不應被包括在反應中。用Xbal切割和變性之后， 對于BRAF-A而言，下方的那條鏈以3，至5，的方向^C描述。通過3個末端 堿基錯配(下劃線)抑制BRFU寡核苷酸的延伸；此實驗中未使用尿嘧啶DNA 糖基化酶，因此BRFU的延伸僅被3個末端錯配抑制(圖9B)。
于37。C,在NEB2緩沖液+BSA中，用5單位Xbal將2pL 1/100稀釋 的各種第一輪產(chǎn)物消化2小時。將liiL各種經(jīng)消化的產(chǎn)物用于ESPCR。在 25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 50 mM KC1， 4 mM MgCl2, 0.2mM dNTP， 10nM BRFU選擇性寡核苷酸，100 nM BRFR2反向引物，40 nM JOELUX熒 光LUX引物，SYBR Green I (Molecular Probes目錄號S7563), 20 nM熒光 素校準染料(BioRad)和0.5單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。 將Corbett RotorGene 3000的運行設置為95°C 90秒，然后95°C 30秒，50°C 40秒，65。C 10秒共5個循環(huán)，然后95。C 5秒，65。C 15秒共40個循環(huán)。同時進行三份相同的檢測。
圖9C顯示了通過JOE熒光測定的擴增。在得自WiDr的樣品中觀察到 的較早的擴增表明可以使用ES-PCR來檢測突變。
實施例8:在產(chǎn)生3，末端鄰近處序列不同的核酸分子時使用在其識別 序列外側(cè)裂解DNA的限制性酶
多種限制性酶(n型，in型和iv型)在距其識別位點外側(cè)特定距離處裂
解DNA,本文稱之為"側(cè)翼切割者"。因此，不同位點之間由側(cè)翼切割者產(chǎn) 生的3，末端也有所不同，所述3'末端取決于酶識別位點的側(cè)翼序列。如果 在識別位點和裂解位點之間有堿基的插入或缺失，則所述酶也會在給定的 裂解位點產(chǎn)生不同的末端。在裂解位點鄰近處產(chǎn)生不同的序列為使用 ES-PCR或其它選擇性擴增法選擇性擴增缺失或插入形式提供了基礎。以 前，檢測缺失或插入的方法依賴于限制性酶消化之后DNA片段長度的變化。 本發(fā)明描述的方法利用的是限制性酶片段核酸序列的差異，產(chǎn)生所述差異 的原因是限制性酶識別序列和其裂解位點之間存在缺失或插入，導致在距 其識別序列特定距離處裂解的限制性酶裂解位點發(fā)生移位。 溯/定短的/^果浙,/Wnm) ^的^關4'插入
&/丄通過使用ES-PCR(圖10A(iv))(參見下文8.1丄l節(jié))或通過使用特異 性引物，然后使用末端轉(zhuǎn)移酶延伸3'末端(圖10A(ii)和10A(iii))，可以4企測 鄰近于Bbr71限制性位點(GAAGAC(7/11))(圖10A(i))的短的A同聚物序列中 的缺失或插入。圖10A(iii)中所示的引物與較短的原始DNA分子的產(chǎn)物相 匹配，它將能有效引發(fā)，而它與較長分子的產(chǎn)物形成3個堿基的錯配，將 不能引發(fā)。然后可使用來自序列內(nèi)部的適當反向引物擴增較短分子的產(chǎn)物。
S丄/.7遽過￡5*-尸0 ^增。短分子("短序列，，，圖10A(i))被裂解的下 方那條鏈將在模板寡核苷酸上有效引發(fā)，所述模板寡核苷酸的3'區(qū)域具有 互補的核酸序列，并具有被胺阻斷的3，末端。因靶向分子的3'延伸而新?lián)?入的末端序列可與在ES-PCR過程中用于擴增的內(nèi)部第二寡核苷酸聯(lián)合使 用。與之形成對照的是，長分子("長序列"，圖10A(i))的裂解末端具有3 個堿基的錯配，因此不會在模板寡核苷酸上引發(fā)，對擴增沒有反應。
&么圖IOB顯示出第二個例子。大多數(shù)在其識別序列外側(cè)具有切割位點 的酶裂解后給出錯列的末端，所述末端可用作接頭連接和隨后PCR的底物。 在本實施例中，Mmel位點(TCCGAC (20/18))鄰近于短的單核苷酸序列(圖10B(i))。對上方的鏈而言，切割位點距識別位點20個堿基，對下方的鏈而 言為18個堿基。圖中顯示了具有10或9個T的序列變體。圖10B(ii)顯示 了用Mmel切割時產(chǎn)生的末端。為了選擇性擴增"9"分子，如圖10B(iii) 所示，可連接如圖所示具有CA 3'延伸的接頭。通過PCR可4企測該分子， 其中正向引物具有圖10B(iii)所示的序列，同時，反向引物源自待擴增的區(qū) 域。可替換的"10"分子給出很難連接的錯配末端，其擴增可通過與引物 錯配進一步地折衷解決。
遞過ES-尸O #^#?；蛘?，可使用圖10C所示模板寡核香酸進ff ES-PCR來區(qū)分產(chǎn)生的3，末端。"9"分子與模板寡核普酸的3'區(qū)域精確匹配， 因此可在模板寡核苦酸上引發(fā)，而"10"分子在其3，末端產(chǎn)生錯配，籍此 阻止與模板寡核苷酸5，尾互補的3，延伸，因而在反應中不能被擴增。
在很多情況下，對于在其識別序列外側(cè)切割的限制性酶而言，內(nèi)源性 位點的位置并不合適。此時，可以使用引物導入突變以產(chǎn)生側(cè)翼于感興趣 區(qū)域的位點，從而導入適當?shù)奈稽c，并且按兩步法分析所得的PCR產(chǎn)物。 或者，如果有另一個位置很近的限制性位點，通過用第一種酶切割并與含 有所需酶位點的銜接子連接，即可導入新的位點。在圖IOB的例子中，所 示序列得自TGFRB2基因內(nèi)的位點，其中 一段10個A的序列中的單堿基缺 失在結(jié)腸直腸癌中是共有的。通過在側(cè)翼EcoRII位點切割并與含有Mmel 位點的銜接子連接，可在理論上導入Mmel位點。
微衛(wèi)星序列提供了臨床相關性的例子，其中通常需要通過檢測較短的 缺失形式的存在來檢測短的簡單重復的不穩(wěn)定性(實施例8.3.)。
如實施例8.4所示，也可檢測插入的存在。
8.3:檢測微衛(wèi)星NR22中的缺失
微衛(wèi)星NR-22由Suraweera et al (2002)描述。MboII限制性位點緊挨微 衛(wèi)星的單核苷酸重復(圖11A(i))。在上方的那條鏈上，MboII在距其識別位 點GAAGA(自其識別序列末端算起)8個核苷酸處切割，在下方的那條鏈上， 所述距離為7個核苷酸。鄰近于所得新末端的序列取決于單核苷酸重復的 長度。在圖11A(ii)和11A(iii)中，為了簡化的目的，只顯示了下方的那條鏈。 在實踐中，也應考慮上方的那條鏈，因為它在PCR過程中被復制，給出新 的可延伸的3，末端。圖中給出的例子長度為22(正常)、20、 1S和16個堿基 對。(得自結(jié)腸直腸癌細胞系HCT116的該區(qū)域的克隆和測序給出長度為l化p和l能p的NR-22單核苷酸重復。)
圖HA(ii)和11A(iii)分別顯示了兩個模板寡核苷酸，它們與得自長度不 等的(16至22個堿基)單核苷酸重復的MboII-切割DNA(下方的鏈)一起排 列。3'末端錯配的存在以及用尿嘧啶DNA糖基化酶裂解含U的寡核香酸之 后產(chǎn)生的脫堿基位點阻止或減弱了模板寡核苷酸在基因組DNA上的延伸。 圖11A(ii)顯示了對照模板寡核苦酸04FNR22-0。切割不同長度重復的產(chǎn)物 都能在F1M122-0上引發(fā)，隨后通過LUX引物FAMLUX1擴增延伸產(chǎn)物。 較短重復的擴增效率較低，因為其雜交區(qū)域長度較短。第二模板寡核苷酸 J5NR22-4經(jīng)設計可選擇性地僅從較短的重復序列開始擴增。長度為20或 22個堿基的重復序列經(jīng)MboII切割的DNA 3，末端的下劃線;咸基與模板寡核 苦酸形成錯配，會阻止其延伸。與之形成對照的是，得自16或18個堿基 的較短重復的末端可有效引發(fā)，導致隨后通過JOELUX5引物擴增并通過 JOE焚光4僉測。
簡單地說，NR-22微衛(wèi)星的正常長度有望在PCR中僅給出FAM熒光， 而NR-22的缺失，如4bp或6bp將同時給出FAM和JOE熒光。
在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 50 mM KC1, 4 mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 2 nM FlNR22-0， 10 nM J5NR22-4, 80 nM NR22R1, 80 nM JOELUX5 熒光LUX引物，20 nM FAMLUX1熒光LUX引物，0.04單位尿嘧啶DNA糖 基化酶(New England Biolabs),0.5單位MboII限制性內(nèi)切核酸酶(New England Biolabs)， 0.5單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。將 Corbett RotorGene 3000的運行設置為37°C 5分鐘，95。C 90秒，然后95°C 10 秒，60。C40秒，70°C IO秒共5個循環(huán)，然后95。C 5秒，70°C 15秒共60 個循環(huán)。監(jiān)測JOE和FAM熒光。同時進行兩份相同的斗全測。在反應中加入 5ng分離自細胞系HCT116或正常受試者血液的DNA。
從圖11B中可以看出，對于FAM熒光而言(圖11B(i)),血液DNA的擴 增領先于在微衛(wèi)星NR-22內(nèi)攜有缺失的HCT116細胞DNA。在反應結(jié)束時， 血液DNA的FAM熒光也較高。這表明該測定法可發(fā)展為不再需要實時PCR 儀器的終點測定法。對于HCT116而言，F(xiàn)AM和JOE反應都會發(fā)生，因為 此細胞系中的缺失使得兩種模板寡核苷酸都能在反應中復制。然而，特異 于攜有缺失的DNA的模板寡核苷酸以較高濃度被使用，因此偏向JOE反應。 由于反向引物NR22R1僅以80 nM的濃度被使用，因此兩個反應有望互相竟爭，從而可以解釋兩個輸入DNA之間最終FAM信號的差異。對JOE信 號而言(圖11B(ii))，只有得自HCT116的缺失DNA給出MboII-切割鏈，該 鏈能在J5NR22-4模板寡核苷酸上引發(fā)，其中J5NR22-4攜有允許JOELUX5 摻入的尾。
8.4:檢測插入
在圖12A中，為了簡單起見僅顯示了 DNA片段下方的那條鏈(但是應 記住限制性酶通常切割雙鏈DNA)。圖中顯示了限制性酶識別位點(未按比 例)的位置。在其識別位點外側(cè)切割的限制性酶例子是Acul,當考慮到"下 方"^!時，該酶在距其識別位點末端14個核苷酸處切割。
模板寡核苦酸被設計成在與切割末端雜交之后，通過一個或多個2，0-曱基核苦酸的存在來降低或阻斷模板寡核苷酸的延伸。其它阻斷延伸的方 法是本領域技術人員眾所周知的，例如在模板寡核苷酸中使用脫堿基位點 或使用4晉配(如本文所述)。此時由于切割DNA的3'末端不與DNA核苷酸 雜交而與2，0-曱基核普酸雜交，因此延伸被阻止。
圖12A的下方顯示了插入突變的例子。在外側(cè)切割者，如AcuI的識別 位點及其切割位點之間插入4個堿基對會將切割位置向左移動4個堿基對。 當所得切割DNA與含2， O-甲基的模板寡核苷酸雜交時，所得復合物具有一 段4個DNA-DNA匹配的核苷酸，因此允許經(jīng)切割的3'末端延伸。
通過利用合成的寡核苷酸獲得顯示該方法效力的數(shù)據(jù)，所述寡核苷酸 ^^莫擬不同的經(jīng)切割下方鏈，所述鏈通過切割"正常"DNA或含有1 bp或4 bp 插入的DNA而產(chǎn)生(圖12B)。
最后，通過兩個外側(cè)引物JOELUX和CommR5驅(qū)動PCR。 JOELUX是 用JOE標記的LUX引物。其匹配模板寡核苷酸的15個核苷酸，因此在模 板寡核苦酸被復制后即可被摻入。CommR5具有與受試寡核苷酸共有的11 個核苷酸，在JOELUX復制受試寡核苷酸之后即可被摻入。
在25微升20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1, 4 mM MgCl2， 0.2mM dNTP, 10nM模板寡核苷酸，40 nM JOELUX熒光LUX引物，200 nM CommR5， 108受試寡核苷酸，0.04單位尿嘧咬DNA糖基化酶(New England Biolabs), 0.5單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。將Corbett RotorGene 3000的運行設置為37。C 5分鐘，95°C 90秒，然后95°C 30秒， 55。C40秒，65°C 15秒共5個循環(huán)，然后95。C 5秒，65°C 15秒共55個循環(huán)。檢測JOE熒光。同時進行三份相同的檢測。37。C保溫5分鐘是為了用 尿嘧，定DNA糖基化酶進行消化。
從圖12C可以看出對應于用外側(cè)切割者切割后的"正常，，DNA下方 鏈的108受試寡核苷酸的擴增(連續(xù)的線)僅在循環(huán)30次后才變得明顯。對應 于插入1個堿基對(點線)或4個堿基對(虛線)的受試寡核苷酸的擴增領先約 10個循環(huán)，這表明可使用該實驗設置選擇性擴增插入突變體的DNA。
實施例9:模板寡核普酸設計
使用模型系統(tǒng)評價模板寡核苷酸的修飾對本發(fā)明方法的用處。制備兩 個受試DNA并將其用作靶。被稱為"經(jīng)切割的"靶DNA對應于已用限制 性酶BstUI切割的Alu元件的下方鏈。Alu元件在BstUI位點處的成功切割 僅當該位點未被曱基化時才會發(fā)生。在此實驗中由于利用了靶寡核苷酸"模 擬"而未使用限制性酶。第二個靶DNA被稱為"未經(jīng)切割的"，它是在不 同于BstUI切割位點的位置處被切割或打斷的片段的模擬物，其具有5個T 的延伸。圖13A中以3，至5，的方向顯示了這兩個靶寡核苷酸。AluRev是反 向引物。它與其靶序列完全匹配，也以3，至5'的方向表示。
AluPhB和一系列相關寡核苷酸被用作模板寡核苷酸(圖13A)。它們以5， 至3，的方向表示。3，末端磷酸而不是正常OH基團的存在阻止了 AluPhB延 伸。AluPhB具有5，尾(下劃線的，圖13A), —旦其通過鄰近于3'末端的靶 序列的延伸而被復制，即可摻入經(jīng)JOE標記的外側(cè)引物JOELUX。由于引 物摻入PCR產(chǎn)物，因此可通過JOE熒光監(jiān)測PCR擴增。
在25微升20 mM Tris-HC1 (pH 8.4), 50 mM KC1, 4 mM MgCl2, 0.2mM dNTP， lOnM模板寡核苷酸(AluPhB或其它)，40 nM AluRev, 40 nM JOELUX 焚光LUX引物，0.04單位尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolabs), 0.5 單位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)中進行PCR。將Corbett RotorGene 3000 的運行設置為37°C 5分鐘，95。C 2分鐘，然后95°C 10秒，60。C 40秒，70°C 5秒共5個循環(huán)，然后95°C 1秒，65°C 15秒共40個循環(huán)。檢測JOE熒光。 同時進行兩份相同的檢測。37。C保溫5分鐘只是為了使循環(huán)條件與其它在 PCR前需要限制性酶消化的實驗相同。這會使不同實驗結(jié)果的比較更加直 觀。在反應中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)以消化含有U核苷酸的模板 寡核苷酸。在每個反應中加入107經(jīng)切割或10"未經(jīng)切割的靶DNA。
參照模板寡核苷酸AluPhB具有23個堿基長的與"經(jīng)切割的"靶序列雜交的區(qū)域，通過其3，末端的磷酸可阻斷其延伸。圖13C(i)顯示了 107 "經(jīng)
切割的"分子的擴增，其量比"未經(jīng)切割的"分子高IOOO倍。如果沒有選 擇性，我們預期"經(jīng)切割的"分子的擴增會延遲約IO個循環(huán)。在相等循環(huán) 數(shù)時的擴增顯示出約1000倍的選擇性。通過延伸模板寡核苷酸(例如如果3， 磷酸被除去或如果模板寡核苷酸帶有切口)或通過在模板寡核苷酸上錯誤引 發(fā)"未經(jīng)切割的，，分子，在本實施例中是通過AluPhB上的錯誤引發(fā)，都可 限制選擇性的程度。已研發(fā)出另一種可替代的模板寡核苷酸，由于某些摻 入的特征，其顯示出改良的選擇性。
可替代的模板寡核苷酸系列的不同之處在于被設計用于阻止模板寡核 苦酸延伸的3'修飾。所示修飾包括摻入C7胺或C3間隔區(qū)或3個堿基的末 端錯配(AluUUG，其中兩個U在UDG處理后會形成脫堿基位點)和/或如果 存在自適當引發(fā)位點上游起的異常引發(fā)時可阻斷延伸的內(nèi)部修飾。這些修 飾包括AluMeAm和AluMeMult中的2， O-甲基修飾堿基(以黑體小寫字母表 示)，包括脫堿基位點(AluAbSp中的X)或通過用UDG處理會轉(zhuǎn)變?yōu)槊搲A基 位點的尿嘧咬堿基(圖13B)。
在模板寡核苷酸中摻入阻斷延伸的修飾基本上可抑制"未經(jīng)切割的" 分子的擴增，導致1000倍或更高的選擇性。比較AluMeAm和AluMeMult， 結(jié)果顯示出更多數(shù)目經(jīng)修飾堿基的選擇性，但所述堿基的存在也可能會降 低正確引發(fā)的效率。
AluHL序列的5，和3'末端可形成發(fā)夾結(jié)構，3'末端與"經(jīng)切割的"靶 分子具有多個會阻止其引發(fā)的錯配。發(fā)夾結(jié)構可能會防止模板寡核苷酸的 錯誤引發(fā)和模板寡核苷酸上"未經(jīng)切割的"核酸分子的錯誤引發(fā)。
這些實驗表明可使用不同方法阻止模板寡核苷酸延伸，降低或阻止模 板寡核苷酸雜交部分復制的修飾可增加ES-PCR的特異性。參考文獻
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權利要求
1. 在含有非鄰近于3’末端而是嵌入分子內(nèi)部的靶序列的分子存在時，從樣品中選擇性擴增在鄰近于3’末端處具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括(i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a)3’區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3’末端的靶序列基本上互補；(b)5’尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3’末端鄰近處或嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，能形成游離的5’尾，5’尾為靶序列的3’末端延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5’尾互補的序列，導致在靶序列中添加與5’尾互補的序列；和(c)3’區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了所述模板寡核苷酸的3’延伸；(ii)使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡核苷酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核苷酸與模板寡核苷酸的5’尾共享核苷酸序列；和(iii)進行樣品的擴增，其中(a)在模板寡核苷酸的3’延伸延遲的情況下，通過自靶序列3’末端起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5’尾，使得同模板寡核苷酸與非鄰近于3’末端的靶序列的退火相比，模板寡核苷酸與鄰近于3’末端的靶序列的退火被穩(wěn)定化；和(b)其中與和非鄰近于3’末端的靶序列退火的模板寡核苷酸的延伸相比，隨之而來的模板寡核苷酸與鄰近于3’末端的靶序列的穩(wěn)定化退火增強了模板寡核苷酸的3’延伸效率；和(c)其中使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的聯(lián)合進行擴增，導致在含有嵌入分子內(nèi)部的靶序列的核酸分子存在時，選擇性擴增鄰近于3’末端的靶序列。
2.在含有嵌入分子內(nèi)部的靶序列的未裂解分子存在時，從樣品中選擇 性擴增由于分子的裂解而在鄰近于3，末端處具有靶序列的核酸分子的方 法，所述方法包括(i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3'末端的靶序列基本上互補；(b) 5'尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與裂解或未裂解 的核酸分子退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3，末端延 伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序 歹'J，導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了模板寡核苷酸的3'延伸；(ii) 使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核苦酸接觸，所述第 二寡核苷酸用于在與模板寡核普酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核 苷酸與模板寡核苷酸的5'尾共享核苷酸序列；和(iii) 進行樣品的擴增，其中(a) 在模板寡核苦酸的3，延伸延遲的情況下，通過自靶序列3，末端 起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5'尾，使得同模板寡核苷酸與未 裂解的核酸分子中非鄰近于3，末端的靶序列的退火相比，模板寡核 普酸與由于核酸分子的裂解而鄰近于3'末端的靶序列的退火被穩(wěn) 定化；和(b) 其中與和未裂解的核酸分子退火的模板寡核苷酸的延伸相比， 隨之而來的模板寡核苷酸與裂解的核酸分子的穩(wěn)定化退火增強了 模板寡核苷酸的3，延伸效率；和(c) 其中使用模板寡核苷酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的 聯(lián)合進行擴增，導致選擇性擴增鄰近于3，末端的靶序列而不是嵌入 核酸分子內(nèi)部的靶序列，導致選擇性擴增裂解的核酸分子而不是未 裂解的核酸分子。
3.在具有不同3，末端的混合分子群體的存在下，從樣品中選擇性擴增 在3，末端鄰近處具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括 (i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于3'末端的靶序列基本上互補；(b) 5'尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與鄰近于3'末端 的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5，尾為靶序列的3'末端延伸 提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序列， 導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和(c) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾延遲了所述寡核苷酸的3'延伸；(ii) 使樣品與第二寡核苷酸，以及任選與第三寡核普酸接觸，所述第 二寡核苷酸用于在與模板寡核苷酸相反的方向上引發(fā)，所述第三寡核苷酸與模板寡核苷酸的5'尾共享核香酸序列；和(iii) 進行樣品的擴增，其中(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸延遲的情況下，通過自靶序列3'末端 起的延伸，復制了模板寡核苷酸的5'尾，使得同模板寡核苷酸與鄰 近于3，末端的非互補序列的退火相比，模板寡核苷酸與鄰近于3， 末端的靶序列的特異性退火被穩(wěn)定化；和(b) 其中與和鄰近于3，末端的非互補序列退火的模板寡核苷酸的延 伸相比，隨之而來的模板寡核苦酸與鄰近于3'末端的靶序列的穩(wěn)定 化退火增強了模板寡核苷酸的3，延伸效率；和(c) 其中使用模板寡核普酸和/或第三寡核苷酸與第二寡核苷酸的 聯(lián)合進行擴增，導致在混合3'末端群體的存在下選擇性擴增鄰近于 3'末端的靶序列。
4. 根據(jù)權利要求1 -3中任一項的方法，其中模板寡核苷酸3，區(qū)域能延 遲寡核苦酸3'延伸的修飾選自(i) 摻入3，末端核苦酸錯配，(ii) 在模板寡核苷酸靠近3，末端的3'區(qū)域摻入一個或多個核苷酸錯配，(iii) 在模板寡核苷酸靠近3，末端的3，區(qū)域摻入缺失，(iv) 在^t板寡核苷酸靠近3'末端的3'區(qū)域摻入插入，和(v) 修飾(i)-(iv)的任意組合。
5. 根據(jù)權利要求4的方法，其中模板寡核苷酸3，區(qū)域的修飾是摻入3， 末端核苷酸錯配。
6. 根據(jù)權利要求4的方法，其中模板寡核苷酸3，區(qū)域的修飾是在模板 寡核苷酸靠近3，末端的3'區(qū)域摻入插入。
7. 在含有非鄰近于3'末端而是嵌入分子內(nèi)部的靶序列的分子存在時， 從樣品中選擇性擴增在鄰近于3，末端處具有靶序列的核酸分子的方法，所 述方法包4舌(i)使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3'末端的靶序列基本上互補；(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3'末端鄰近處或嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5， 尾為靶序列的3'末端延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡 核苷酸5，尾互補的序列，導致在靶序列中添加與5，尾互補的序歹'J;和(c) 3'區(qū)域的修飾，所述修飾阻斷了所述模板寡核芬酸的3，延伸， 或在模板寡核苷酸的雜交區(qū)域具有修飾，所述修飾允許3，延伸，但 阻礙或阻斷了所述寡核苷酸3 ，區(qū)域中的復制；(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡核 苷酸相反的方向上引發(fā)；(iii) 使DNA樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核香酸與模板寡核 苷酸的5'尾共享核香酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去； 和(iv) 進行樣品的擴增，其中(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的3，延伸雖 未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或被阻斷的情況下，當模板 寡核苷酸與鄰近于3，末端的靶序列退火，而不是當模板寡核苷酸與 嵌入核酸分子內(nèi)部的靶序列退火時，模板寡核苷酸與樣品中的核酸 分子退火之后，模板寡核苷酸的5，尾發(fā)生復制；和(b) 其中用第二和第三寡核苷酸進行擴增，利用復制的5，尾選擇性 擴增鄰近于3，末端的靶序列，由于5，尾不復制，模板寡核苷酸的3， 延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，嵌入核酸分子內(nèi)部的 耙序列的擴增無法進行下去。
8.在含有嵌入分子內(nèi)部的靶序列的未裂解核酸分子存在時，從樣品中 選擇性擴增由于分子的裂解而在鄰近于3'末端處具有靶序列的核酸分子的 方法，所述方法包括(i)使DNA樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于核酸分子3，末端的靶序列基本上互補；(b) 5'尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與裂解或未裂解 的核酸分子退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3'末端延 伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序 歹'],導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和(C) 3，區(qū)域的修飾，所述修飾阻斷了所述模板寡核芬酸的3，延伸，或在模板寡核苷酸的雜交區(qū)域具有修飾，所述修飾允許3'延伸，但 阻礙或阻斷了所述寡核苷酸3 ，區(qū)域中的復制；(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡 核苷酸相反的方向上引發(fā)；(iii) 使樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核苷酸與模板寡核苷酸 的5，尾共享核苷酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去；和(iv) 進行樣品的擴增，其中(a) 在模板寡核苷酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的3'延伸雖 未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或被阻斷的情況下，在模板 寡核苦酸與因核酸分子的裂解而產(chǎn)生的3'末端鄰近處的靶序列退 火之后，而不是當模板寡核苷酸與嵌入未裂解的核酸分子內(nèi)部的靶 序列退火時，模板寡核苷酸的5'尾發(fā)生復制；和(b) 其中用第二和第三寡核苷酸進行擴增，利用復制的5，尾序列選 擇性擴增鄰近于3'末端的靶序列，由于5，尾不復制，模板寡核苷 酸的3，延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，嵌入未裂解分 子內(nèi)部的靶序列的擴增無法進行下去，導致選擇性擴增裂解的核酸 分子而不是未裂解的核酸分子。
9.在3，末端混合群體的存在下，從樣品中選擇性擴增在3，末端鄰近處 具有靶序列的核酸分子的方法，所述方法包括(i) 使樣品與模板寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸具有(a) 3，區(qū)域，其與鄰近于3'末端的靶序列基本上互補；(b) 5，尾，其含有核酸序列，使得當模板寡核苷酸與位于3，末端鄰 近處的靶序列退火時，能形成游離的5，尾，5'尾為靶序列的3'末端 延伸提供了模板，所述靶序列中摻入與模板寡核苷酸5'尾互補的序 歹'J,導致在靶序列中添加與5'尾互補的序列；和(c) 3'區(qū)域的修飾，所述修飾阻斷了模板寡核苷酸的3'延伸，或在 模板寡核苷酸的雜交區(qū)域具有修飾，所迷修飾允許3，延伸，但阻礙 或阻斷了所述寡核苷酸3'區(qū)域中的復制；(ii) 使樣品與第二寡核苷酸接觸，所述第二寡核苷酸用于在與模板寡核 普酸相反的方向上引發(fā)；(iii) 使DNA樣品與第三寡核苷酸接觸，所述第三寡核苷酸與模板寡核苷酸的5，尾共享核芬酸序列，并且可以使3，延伸不受阻礙地進行下去； 和(iv) 進行樣品的擴增，其中(a) 在模板寡核香酸的3'延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的3'延伸雖 未被阻斷但隨后由其導致的復制受阻礙或被阻斷的情況下，當模板 寡核苷酸與鄰近于3，末端的靶序列退火，而不是當模板寡核苷酸與 鄰近于3，末端的非互補序列退火時，模板寡核苷酸與靶序列的特異 性退火之后，模板寡核普酸的5'尾發(fā)生復制；和(b) 其中用第二和第三寡核普酸進行擴增，利用復制的5，尾序列選 擇性擴增鄰近于3'末端的靶序列，由于5'尾不復制，模板寡核苷 酸的3，延伸被阻斷，或模板寡核苷酸的復制被阻斷，鄰近于3，末 端的非互補序列的擴增無法進行下去，導致在混合3'末端群體的存 在下選擇性擴增出鄰近于3'末端的靶序列。
10. 根據(jù)權利要求7-9中任一項的方法，其中模板寡核苷酸3'區(qū)域 能阻斷模板寡核苷酸3'延伸的修飾選自(i) 在其3'末端摻入一個或多個不可延伸的組成成分或核苷酸類似物，(ii) 摻入3'末端不可延伸的組成成分或核苷酸類似物與模板寡核苷酸 靠近3，末端的3，區(qū)域中的 一個或多個核苷酸錯配的組合，(iii) 在模板寡核苷酸靠近3'末端的3'區(qū)域摻入一個或多個脫堿基位點，和(iv) 摻入一個或多個脫堿基位點與模板寡核苷酸靠近3'末端的3'區(qū)域 中的一個或多個核苷酸錯配的組合。
11. 根據(jù)權利要求10的方法，其中一個或多個不可延伸的組成成分 或核苷酸類似物選自(i) 2，,3，雙脫氧核苷酸，(ii) 3 ， C3, C18或其它長度的間隔區(qū)，(iii) 3，磷酸化核香酸，(iv) 肽核酸^威基，(v) 胺接頭，(vi) —個或多個用尿嘧啶DNA糖基化酶處理過的尿嘧。定，(vii) RNA,(viii) —個或多個rO-曱基RNA殘基，和(ix) (i)-(viii)的任意組合。
12. 根據(jù)權利要求ll的方法，其中不可延伸的堿基是胺接頭。
13. 根據(jù)權利要求ll的方法，其中不可延伸的堿基是C3間隔區(qū)。
14. 根據(jù)權利要求11的方法，其中不可延伸的堿基是一個或多個用 尿嘧啶DNA糖基化酶處理過的尿嗜咬。
15. 根據(jù)權利要求11的方法，其中不可延伸的堿基是一個或多個2， 0-曱基RNA殘基。
16. 根據(jù)權利要求10的方法，其中不可延伸的4^基是模板寡核苷酸 靠近3，末端的3，區(qū)域的一個或多個脫石咸基位點。
17. 根據(jù)權利要求7-9中任一項的方法，其中允許3，延伸，但阻礙 或阻斷了所述寡核苷酸3，區(qū)域的復制的3，區(qū)域修飾選自(i) 在模板寡核苷酸的3'區(qū)域內(nèi)插入一個或多個堿基類似物，(ii) 插入一個或多個RNA核苷酸，(iii) 插入一個或多個脫石咸基位點，和(iv) (i)-(iii)的任意組合。
18. 根據(jù)權利要求17的方法，其中修飾是插入一個或多個堿基類似物。
19. 根據(jù)權利要求17的方法，其中修飾是插入一個或多個脫堿基位點。
20. 根據(jù)權利要求9的方法，其中樣品中包括靶向核酸分子3，末端的 核酸分子3，末端是用側(cè)翼切割者限制性內(nèi)切核酸酶消化樣品產(chǎn)生的。
21. 根據(jù)權利要求20的方法，其中3'區(qū)域阻斷所述模板寡核苷酸3， 延伸的修飾是在其3'末端摻入一個或多個堿基類似物、 一個或多個脫堿基 位點或其任意組合。
22. 根據(jù)權利要求20或21的方法，其中模板寡核苷酸的3'區(qū)域還摻 入了阻斷靶序列3'延伸的修飾。
23. 根據(jù)權利要求22的方法，其中修飾是在模板寡核苷酸的3'區(qū)域 摻入一個或多個堿基類似物。
24. 根據(jù)權利要求23的方法，其中模板寡核苷酸摻入了 3'末端核苷酸錯配， 一個或多個脫堿基位點并摻入了 一個或多個堿基類似物。
25. 根據(jù)權利要求1 - 24中任一項的方法，其中第二寡核苷酸是另一 個模板寡核苷酸。
26. 用于從含有裂解和未裂解DNA的DNA樣品中選擇性擴增裂解的 DNA的試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)權利要求1-25中任一項的方法限定 的(i)模板寡核苷酸，(ii)第二寡核苷酸，和(iii)第三寡核苷酸。
27. 根據(jù)權利要求1 - 26中任一項的方法，其中核酸分子含有DNA。
28. 根據(jù)權利要求2或權利要求8的方法，其中核酸分子的裂解是由 序列-特異性的限制性內(nèi)切核酸酶造成的。
29. 根據(jù)權利要求28的方法，其中限制性內(nèi)切核酸酶是序列-特異性 的曱基化敏感型限制性內(nèi)切核酸酶。
30. 根據(jù)權利要求29的方法，其中曱基化敏感型限制性內(nèi)切核酸酶 受DNA曱基化的抑制。
31. 根據(jù)權利要求30的方法，其中曱基化敏感型限制性內(nèi)切核酸酶 選自HpaII， Hhal, Bstul, Notl, Smal和SacII。
32. 根據(jù)權利要求29的方法，其中曱基化敏感型限制性內(nèi)切核酸酶 裂解曱基化的DNA。
33. 根據(jù)權利要求32的方法，其中曱基化敏感型限制性內(nèi)切核酸酶 選自GlaI和BisI。
34. 根據(jù)權利要求28的方法，其中選擇限制性內(nèi)切核酸酶以區(qū)分樣 品中的核酸分子內(nèi)存在還是缺乏限制性位點。
35. 根據(jù)權利要求2或8的方法檢測單核苷酸多態(tài)性或突變的方法。
36. 根據(jù)權利要求3或9的方法檢測單核苷酸重復中的不穩(wěn)定性的方法。
37. 根據(jù)權利要求20-24中任一項的方法檢測單核苷酸重復中的不 穩(wěn)定性的方法。
38. 根據(jù)權利要求24的方法檢測單核苷酸重復中的不穩(wěn)定性的方法。
39. 根據(jù)權利要求29至33中任一項的方法檢測含有核酸分子的樣品 的曱基化狀態(tài)的方法。
40. 檢測樣品中的核酸分子是否存在缺失或插入的方法，其中缺失或插 入發(fā)生在限制性酶識別位點與其位于識別位點外側(cè)特定距離處的裂解位點之間，所述方法包括(i) 用限制性酶消化樣品，所述限制性酶在距其識別序列外側(cè)特定距離 處具有裂解位點，和(ii) 測定通過裂解產(chǎn)生的3，末端鄰近處的核苷酸序列，其中3'末端鄰近處的核苷酸序列取決于是否存在缺失或插入，其中當存在缺失或插入時，分別在3，或5'方向上出現(xiàn)裂解位點的移位。
41. 根據(jù)權利要求40的方法，其中步驟(ii)是通過根據(jù)權利要求3或 權利要求9的方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測核酸分子的方法，所述核酸分子在鄰近3’末端處具有靶序列。本發(fā)明還提供了區(qū)分在鄰近3’末端處具有靶序列的核酸分子與在分子內(nèi)嵌入相同靶序列的核酸分子的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101443458SQ200780017220
公開日2009年5月27日 申請日期2007年3月28日 優(yōu)先權日2006年3月28日
發(fā)明者基思·蘭德, 彼得·L·莫洛伊 申請人:聯(lián)邦科學及工業(yè)研究組織