專利名稱：：一種用于多重pcr小分子擴增片段的高效分離方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種方法，具體地說，涉及一種方法。本發(fā)明可以成功的對多重PCR小分子擴增片段進行高效分離，多重PCR產(chǎn)物經(jīng)過磁珠純化后，可以更好的用毛細管電泳對其進行分離。
背景技術：
：轉(zhuǎn)基因食品的安全性已成為全球關注的熱點問題之一，為了標識轉(zhuǎn)基因作物，通常不僅要篩選和檢測出轉(zhuǎn)基因作物的CaMV35S啟動子及N0S終止子，還要鑒定轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的品系和定量轉(zhuǎn)基因成分。深加工產(chǎn)品PCR分子檢測技術的研究一直是檢測技術研究的難點和熱點，因為其基因組DNA片段因為加工過程中高壓高溫以及機械力的破壞，已經(jīng)降解成很小片段了(<100bp)，并且含量非常微小，因此傳統(tǒng)的PCR-瓊脂糖凝膠電泳無法對這些小目的片段實現(xiàn)有效地檢測，經(jīng)常會出現(xiàn)假陰性的結果。目前，已有采用多重PCR反應技術對這些小片段基因進行擴增，以提高檢測特異性。但由于多重PCR反應體系較為復雜，對后續(xù)的分離方法要求更加嚴格，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳進行分離分析，其分辨率有限，無法達到對多重PCR小分子擴增片段檢測的要求。因此，需要研究一種能快捷高效地對多重PCR小分子擴增片段進行分離的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檢測PCR小分子擴增片段的方法的缺陷，提供一種操作簡便、快速高效的分離多重PCR小分子擴增片段的方法。本發(fā)明提供的用于多重PCR小分子擴增片段的高效分離方法，其先用磁珠純化法對多重PCR小分子擴增片段進行純化，然后再采用毛細管電泳法進行分離。本發(fā)明所述樣品為食品領域內(nèi)任何含有玉米成分的原料產(chǎn)品以及深加工產(chǎn)品。由于多重PCR反應體系較為復雜，具有一些可能會干擾到后續(xù)毛細管電泳的雜質(zhì)，因此需要對其進行純化處理。本發(fā)明采用磁珠純化法。磁珠是一種包被有生物活性基團的功能化載體，可分散于基液中形成磁性液體材料，它兼有液體的流動性和固體磁性顆粒材料的雙重特點，從而使固-液相的分離變得十分方便快捷。磁珠純化法特異性地把DNA分離技術和富集技術有機的結合為一體，通過簡單的洗脫即可以得到純度很高的靶物質(zhì)DNA。毛細管電泳(C即illaryElectrophoresis,CE)也叫高效毛細管電泳(HPCE)，毛細管電泳法是近年來發(fā)展迅速的分離分析技術之一，毛細管電泳克服了傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳分辨率較低、過程復雜、樣品需要量大、重現(xiàn)性差，其最主要的特點是高效、快速和微量。本發(fā)明采用的是無膠篩分毛細管凝膠電泳(NGE)，它采用的是可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分介質(zhì)，它能避免空泡的形成，比凝膠柱的制備要簡單、方便。早在1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作為DNA分離介質(zhì)的報道。但是其黏度大，操作又比較繁瑣，且不是十分穩(wěn)定。故在其后幾年，PEO、PDMA、PVP在熔融石英毛細管壁單獨具有動態(tài)涂層作用的線性3高分子物質(zhì)陸續(xù)被報道。經(jīng)過試驗研究，本發(fā)明選擇分離介質(zhì)為羥乙基纖維素(HEC)。所述磁珠純化法采用BIO-V公司購買的磁珠進行純化。依次采用磁珠吸附、洗滌以及洗脫步驟。所述磁珠純化法的步驟為1)取多重PCR產(chǎn)物加入磁珠結合液(向100,1/LTris-Cl，10,1/LEDTA溶液中加入2.0mol/LNaCl丄Omol/LMgC12、15%的PEG6000和15X的PEG8000，pH值為6.5)和30uLlmol/L的DTT溶液(二硫蘇糖醇溶液)；2)向其中加入保持均勻懸浮狀態(tài)的磁珠，使磁珠保持懸浮狀態(tài)5min;3)將離心管置于磁架上進行磁性分離，吸去液體；4)然后加入70%的乙醇進行洗滌，混勻；進行磁性分離，吸去液體；5)重復步驟4)一次；6)在磁性條件下，室溫晾干，并吸去液體；7)加入TE(100,1/LTris-Cl，10,1/LEDTA，pH8.0)溶液，混勻;8)磁性分離，吸取液體，所得液為純化的PCR產(chǎn)物。具體操作步驟如下1)取多重PCR產(chǎn)物于1.5mlE卯endorf離心管中。加入等體積的磁珠結合液(向100,1/LTris-Cl，10,1/LEDTA溶液中加入2.0mol/LNaCl、1.0mol/LMgCl2、15，PEG6000和15%的PEG8000，pH值為6.5)和30uLlmol/L的DTT溶液。2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必須先渦旋振蕩裝磁珠的試劑瓶30s，以保證磁珠懸浮狀態(tài)均勻。用取液器反復吹打或用漩渦混合儀充分混勻，使磁珠始終保持懸浮狀態(tài)5min。3)將離心管放置于磁架上靜置30s，待磁珠完全吸附于離心管靠磁架一側時方可吸去液體，液體盡量吸取干凈。4)從磁架上取下離心管，往離心管中加入lmL70%的乙醇進行洗滌，震蕩混勻lmin。將離心管放置于磁架上，磁性分離30s，盡量吸去液體。5)重復步驟4)一次。6)離心管始終放在磁架上，室溫晾干1015分鐘，每隔5min，可能會從磁珠中滲出液體，聚集在離心管底部，用取液器將這些液體及時取出。7)向離心管加入TE(100mmol/LTris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0)溶液，震蕩混勻510min，使磁珠始終保持懸浮狀態(tài)。8)磁分離，將離心管放置于磁架上靜置約30s，使磁珠完全吸附于離心管靠磁架一側時小心吸取液體放入新的離心管中，所得液即為純化的PCR產(chǎn)物。羥乙基纖維素(HEC)是本發(fā)明的主要研究對象。本發(fā)明用HEC的線性高分子溶液作為毛細管中的填充介質(zhì)。運用毛細管無膠篩分和毛細管動態(tài)涂漬區(qū)帶電泳模式建立對多重PCR產(chǎn)物篩分的方案。本發(fā)明毛細管電泳分離法所用篩分溶液體系由篩分介質(zhì)和基體緩沖液組成。篩分介質(zhì)為羥乙基纖維素(HEC)，基體緩沖液由89mol/LTrisbase(三羥甲基氨基甲烷)、332mol/L硼酸和2mol/LEDTA(乙二胺四乙酸)組成，pH在7.27.5之間，進一步優(yōu)選為7.4。其中，Tris、硼酸和EDTA至少是分析純級別。4所述的篩分介質(zhì)HEC為水溶性高分子物質(zhì)，優(yōu)選的質(zhì)量濃度范圍在1.01.5%，進一步優(yōu)選為1.2%。毛細管內(nèi)徑為75ym。經(jīng)過優(yōu)化后確定，每次使用長度為48.5cm，檢測窗口至電極末端的距離為8.5cm，故毛細管有效長度為40cm。運行電壓為負壓，大小在15kv20kv之間，進一步優(yōu)化為-16.5kv。具體地說，本發(fā)明所述毛細管電泳分離過程為1)配制電泳緩沖液以30mL溶液為例，稱取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去離子水定容至30mL，用1.Omol/L的硼酸調(diào)節(jié)Kl值至7.27.5。2)將1)中的電泳緩沖液分裝出15mL來配制分離緩沖液。向其中加入質(zhì)量濃度為1.01.5%的HEC，由于HEC的黏度較大，故不易溶解，可以采用漩渦震蕩器震蕩后，再放入水浴鍋中溫浴使之完全溶于電泳緩沖液中，冷卻至4°C密封保存。3)將1)和2)的溶液過45iim濾膜，4。C保存。4)毛細管的內(nèi)徑為75iim，在8.28.5cm處灼燒毛細管，作為檢測窗口，毛細管長度為48.5cm，有效長度為40cm。5)灼燒毛細管的頭和尾處，使其穿過電極浸入電泳緩沖液中。6)新毛細管的前處理的條件如下0.1Omol/L的氫氧化鈉運行5min;去離子水運行10min;分離緩沖液運行10min。7)毛細管電泳儀運行的參數(shù)如下毛細管溫度為20°C，_5kv下進樣20s，-16.5kv的電壓下運行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm條件下檢測。本發(fā)明的用于多重PCR小分子擴增片段的高效分離方法，可以先從樣品中提取植物基因組；然后進行多重PCR擴增。本發(fā)明從樣品中提取植物基因組DNA采用CTAB(溴代十六烷基三甲胺)法。具體步驟如下1)將含有玉米成分的鍋巴樣品于液氮中研磨成粉末狀。2)稱取200mg加入到1.5mLE卯endof離心管(安全微量離心管)中。3)加入1000iiLCTAB溶液，振蕩均勻，65。C溫育40min，其間至少混勻5次，在4。C下12000rpm離心10分鐘。4)小心吸取上清到另一新管中，加入與上清等體積的Tris飽和酚三氯甲烷異戊醇(25:24:1)，充分振蕩均勻，4。C下12000rpm離心15min。5)重復步驟4)一次。6)小心吸取上清到另一新管中，加入與上清等體積的三氯甲烷異戊醇(24:1)，振蕩均勻，在4。C下12000rpm離心15min。7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3體積的異丙醇，1/10體積的乙酸鈉。-20。C條件下靜置2h。在4。C下12000rpm離心15min。8)棄去上清液，加入適量的70%乙醇溶液洗滌沉淀。9)棄去上清液，吹干沉淀。用100uL無菌超純水溶解沉淀。10)加入3iilRNA酶溶液，37。C水浴環(huán)境中消化30min。本發(fā)明所述的樣品可以為鍋巴，也可以是食品領域內(nèi)任何含有玉米成分的深加工產(chǎn)品以及深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。本發(fā)明的多重PCR小分子片段的擴增過程為PCR反應體系如下(30iiL):10XPCR緩沖液3iiL(10XPCR緩沖液100mmol/LTris-HCl，500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2);2.5mmol/LdNTP:2.4iiL;引物濃度為10iiM，共三對引物，每對引物的上、下游引物分別加入liiL;TaqDNA聚合酶0.4yL，提取的DNA加入1Pl作為模板，用ddH20水補足至30iil。PCR的擴增條件如下預變性:94。C5min;變性:94。C30s;退火:60。C30s;延伸:72°C30s;最后延伸72°C7min;共設35個循環(huán)。本發(fā)明采用磁珠法純化PCR產(chǎn)物，高效快速的去除了反應體系中的雜質(zhì)，使其適合于進行毛細管電泳，將經(jīng)過純化后的PCR產(chǎn)物稀釋后上樣，出現(xiàn)了銳峰，可見磁珠純化有助于毛細管電泳的操作，大大的提高了樣品的純度。本發(fā)明中采用的磁珠純化法區(qū)別于普通的DNA試劑盒純化法，普通的純化法利用高鹽濃度下的硅類基質(zhì)對DNA獨特吸附的原理，清除凝膠與其它雜質(zhì)，對小于lOObp的DNA片段的回收率較低。而本發(fā)明中使用的磁珠純化法以磁珠獨特的分離作用為依據(jù)，提供了一個極其簡便的操作程序磁珠吸附、洗滌以及洗脫。在最適的試劑及操作條件下，可獲得高質(zhì)量的DNA。本發(fā)明所采用磁珠純化方法具有簡便、快捷和高效的特點，整個提取純化過程中無須使用苯酚、氯仿等有機溶劑。本發(fā)明提供了用于分離小片段PCR產(chǎn)物的毛細管電泳法，該方法在紫外檢測條件下可以在10.6min內(nèi)成功的分離出大小分別為51bp、74bp和88bp的多重PCR小分子擴增片段。表1本發(fā)明與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳的實施效果比較方法優(yōu)點缺點瓊脂糖凝膠電泳法毛細管電泳法成本較低靈敏度高，分離效率高，分離效果好，自動化程度高，使用中無有毒物質(zhì)耗時，上樣量大，分離效果差，且含有GoldView等有毒物質(zhì)成本較上法略高本發(fā)明彌補了現(xiàn)有技術對多重PCR小分子擴增片段檢測的不足，成功的建立了一種用于深加工產(chǎn)品PCR分子檢測的快速篩查方法。多重PCR技術具有節(jié)約模板、節(jié)省試劑和時間的高效性；磁珠法對多重PCR產(chǎn)物進行處理可以有效的除去PCR反應體系中的雜質(zhì)，使其更適合于進行毛細管電泳；毛細管電泳具有檢測限低、靈敏度高和檢測時間短的特點。本發(fā)明應用安全，可以成功的對多重PCR小分子擴增片段進行分離鑒定，檢測時間控制在10.6min，可廣泛地應用于食品衛(wèi)生檢疫以及臨床檢驗等領域中。圖1為本發(fā)明瓊脂糖凝膠電泳驗證基因組DNA提取圖；M:ADNA/EcoRI+HindIIIMarker,1、2均為CTAB法提取的鍋巴食品DNA電泳圖譜6圖2為本發(fā)明瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR產(chǎn)物；M:DL2000DNAMarker,1、2均為多重PCR產(chǎn)物圖3為本發(fā)明毛細管電泳分離多重PCR產(chǎn)物；圖4為圖3出峰部分的放大圖。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1用CTAB法從鍋巴中提取基因組DNA1)將含有玉米成分的鍋巴樣品于液氮中研磨成粉末狀。2)稱取200mg加入到1.5mLEppendof離心管中，同時需設立陰性對照。3)加入1000iiLCTAB溶液，振蕩均勻，65。C溫育40min，其間至少混勻5次，在4。C下12000rpm離心10分鐘。4)小心吸取上清到另一新管中，加入與上清等體積的Tris飽和酚三氯甲烷異戊醇(25:24:1)，充分振蕩均勻，4。C下12000rpm離心15min。5)重復步驟(4)一次。6)小心吸取上清到另一新管中，加入與上清等體積的三氯甲烷異戊醇(24:1)，振蕩均勻，在4。C下12000rpm離心15min。7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3體積的異丙醇，1/10體積的乙酸鈉。-20。C條件下靜置2h。在4。C下12000rpm離心15min。8)棄去上清液，加入適量的70%乙醇溶液洗滌沉淀。9)棄去上清液，吹干沉淀。用100uL無菌超純水溶解沉淀。10)加入3illRNA酶溶液，37。C水浴環(huán)境中消化30min。11)消化后，跑1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的基因組進行驗證。如圖1所示，結果表明，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳時后發(fā)現(xiàn)，采用CTAB法可以提取出鍋巴中的基因組DNA，上樣量為5iiL。其中基因組的大小在ADNA/EcoRI+HindIIIMarker的21kb左右的位置。基因組的條帶彌散，這是采用深加工技術對樣品進行處理后的結果，樣品點樣孔中基本沒有蛋白殘留，以本發(fā)明的方法提取得到的基因組均可用于PCR擴增。實施例2對實施例1提取的DNA做PCR檢測用實施例1提取的DNA為模板，以設計的引物(如表2)擴增鍋巴的基因組。PCR反應體系如下(30iiL):10XPCR緩沖液3iiL(10XPCR緩沖液100mmol/LTris-HCl，500mmol/LKC1，15,1/LMgCl2);2.5mmol/LdNTP:2.4iiL;引物濃度為10iiM，共三對引物，每對引物的上、下游引物分別加入L;TaqDNA聚合酶0.4yL，提取的DNA加入1ii1作為模板，用ddH20水補足至30iU。PCR的擴增條件如下預變性94。C5min;變性94°C30s;退火60。C30s;延伸72。C30s;最后延伸72。C7min;共設35個循環(huán)。表2引物設計<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>如圖2所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR產(chǎn)物，上樣量為8i!L。結果表明，用瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR產(chǎn)物，多重PCR擴增的目的DNA片段大小分別為51bp、74bp和88bp，產(chǎn)物以團狀形式聚集在DL2000DNAMarker的lOObp以下的部分，可見傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳無法對其進行有效的分離。其中DL2000DNAMarker從上到下依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。實施例3采用磁珠純化法對多重PCR小分子擴增片段進行純化1)取多重PCR產(chǎn)物于1.5mlE卯endorf離心管中。加入等體積的磁珠結合液(向100mmol/LTris-Cl，10mmol/LEDTA溶液中加入2.Omol/LNaCl、1.Omol/LMgC12、15X的PEG6000和15%的PEG8000，pH值為6.5)和30uLlmol/L的DTT溶液；2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必須先渦旋振蕩裝磁珠的試劑瓶30s，以保證磁珠懸浮狀態(tài)均勻。用取液器反復吹打或用漩渦混合儀充分混勻，使磁珠始終保持懸浮狀態(tài)5min。3)將離心管放置于磁架上靜置30s，待磁珠完全吸附于離心管靠磁架一側時方可吸去液體，液體盡量吸取干凈。4)從磁架上取下離心管，往離心管中加入lmL70%的乙醇進行洗滌，震蕩混勻lmin。將離心管放置于磁架上，磁性分離30s，盡量吸去液體。5)重復步驟4)一次。6)離心管始終放在磁架上，室溫晾干1015分鐘，每隔5min，可能會從磁珠中滲出液體，聚集在離心管底部，用取液器將這些液體及時取出。7)向離心管加入TE(100mmol/LTris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0)溶液，震蕩混勻510min，使磁珠始終保持懸浮狀態(tài)。8)磁分離，將離心管放置于磁架上靜置約30s，使磁珠完全吸附于離心管靠磁架一側時小心吸取液體放入新的離心管中，所得液即為純化的PCR產(chǎn)物。實施例4用毛細管電泳分離多重PCR產(chǎn)物1)配制電泳緩沖液以30mL溶液為例，稱取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去離子水定容至30mL，用1.Omol/L的硼酸調(diào)節(jié)ffl值至7.4。2)將1)中的電泳緩沖液分裝出15mL來配制分離緩沖液。向其中加入180.Omg的HEC。由于HEC的黏度較大，故不易溶解，可以采用漩渦震蕩器震蕩后，再放入水浴鍋中溫浴使之完全溶于電泳緩沖液中，冷卻至4°C密封保存。3)將1)和2)的溶液過45iim濾膜，4。C保存。4)毛細管的內(nèi)徑為75iim，管內(nèi)壁無涂層，在8.28.5cm處灼燒毛細管，作為檢測窗口，毛細管長度為48.5cm，有效長度為40cm。5)灼燒毛細管的頭和尾處，使其穿過電極浸入電泳緩沖液中。6)新毛細管的前處理的條件如下0.10mol/L的氫氧化鈉運行5min;去離子水運行10min;分離緩沖液運行10min。7)毛細管電泳儀運行的參數(shù)如下毛細管溫度為20°C，_5kv下進樣20s，-16.5kv的電壓下運行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm條件下檢測。如圖3所示，結果表明，經(jīng)過磁珠純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過稀釋后，在-5kv的條件下進樣20s，毛細管電泳法可以成功分離出100bp以下的3個不同大小的PCR產(chǎn)物，目的DNA片段大小分別為51bp、74bp和88bp，毛細管電泳對其分離的分離度良好，樣品經(jīng)純化后進樣，峰形為銳峰，在10.6min內(nèi)達到分離，可見樣品的純度非常的高，磁珠純化法有助于進行毛細管的分離。本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因植物篩查的多重PCR反應體系，以轉(zhuǎn)基因玉米Btl76為研究對象，采用多重PCR技術，一次PCR反應同時擴增玉米的CaMV35S啟動子、NOS終止子以及ZSSIIb基因，以提高檢測效率和檢測特異性。并采用了磁珠法對多重PCR產(chǎn)物進行純化，該法快速、有效、操作簡便。同時提供了一種用于毛細管電泳分離上述多重PCR產(chǎn)物的毛細管無膠篩分體系，該篩分體系的電泳緩沖液為89mol/LTris，332mol/L硼酸，2mol/LEDTA，PH為7.4。篩分介質(zhì)為羥乙基纖維素(HEC)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。0107]序列表0108]〈110〉中國農(nóng)業(yè)大學0109]〈120〉一種用于多重PCR小分子擴增片段的高效分離方法0110]〈130〉KHP09113457.00111]〈160>60112]〈170>PatentInversion3.50113]〈210>10114]〈211>220115]〈212>DNA0116]〈213〉人工序列0117]〈400>10118]3ctgacgt朋gggatgacgc220119]〈210>20120]〈211>230121]〈212>DNA0122]〈213〉人工序列0123]〈400>20124]ggaagggtcttgcgaaggatagt230125]〈210>39〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3atgggtttttatgattagagtcccg〈210>4<211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>4agtttgcgcgctatattttgtttt<210>5〈211〉21〈212〉DNA<213>人工序列〈400>5cggtggatgctaaggctgatg〈210〉6〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6朋agggccaggttcattatcetc權利要求一種用于多重PCR小分子擴增片段的高效分離方法，其特征在于，其先用磁珠純化法對多重PCR小分子擴增片段進行純化，然后再采用毛細管電泳法進行分離。2.根據(jù)權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述磁珠純化法依次采用磁珠吸附、洗滌以及洗脫步驟。3.根據(jù)權利要求1或2所述的分離方法，其特征在于，所述磁珠純化法的純化步驟為1)取多重PCR產(chǎn)物加入磁珠結合液和30uLlmol/L的DTT溶液；2)向其中加入保持均勻懸浮狀態(tài)的磁珠，使磁珠保持懸浮狀態(tài)5min;3)將離心管置于磁架上進行磁性分離，吸去液體；4)然后加入70%的乙醇進行洗滌，混勻；進行磁性分離，吸去液體；5)重復步驟4)一次；6)在磁性條件下，室溫晾干，并吸去液體；7)加入TE溶液，混勻;8)磁性分離，吸取液體，所得液為純化的PCR產(chǎn)物。4.根據(jù)權利要求l-3任意一項所述的分離方法，其特征在于，所述毛細管電泳法所用的篩分溶液體系由篩分介質(zhì)HEC和基體緩沖液組成。5.根據(jù)權利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述基體緩沖液由89mol/L三羥甲基氨基甲烷、332mol/L硼酸和2mol/LEDTA組成，pH為7.27.5。6.根據(jù)權利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述篩分介質(zhì)HEC為水溶性高分子物質(zhì)，質(zhì)量濃度為1.01.5%。7.根據(jù)權利要求l-6任意一項所述的分離方法，其特征在于，所述毛細管電泳法具體過程為1)配制電泳緩沖液89mol/L三羥甲基氨基甲烷，332mol/L硼酸，2mol/LEDTA，pH為7.27.5，其余為去離子水；2)將1)中的電泳緩沖液分裝出部分來配制分離緩沖液，向其中加入質(zhì)量濃度為1.01.5%的HEC，加熱溶解，之后冷卻至4。C密封保存；3)將1)和2)的溶液過0.45iim濾膜，4t:保存；4)毛細管的內(nèi)徑為75iim，在8.28.5cm處灼燒毛細管，作為檢測窗口，毛細管長度為48.5cm，有效長度為40cm;5)灼燒毛細管的頭和尾處，使其穿過電極浸入電泳緩沖液中；6)新毛細管的前處理的條件如下0.10mol/L的氫氧化鈉運行5min;去離子水運行10min;分離緩沖液運行10min;7)毛細管電泳儀運行的參數(shù)如下毛細管溫度為20°C，_5kv下進樣2040s，-15-20kv的電壓下運行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm條件下檢測。8.根據(jù)權利要求7所述的分離方法，其特征在于，電泳緩沖液的pH值為7.4。9.根據(jù)權利要求7或8所述的分離方法，其特征在于，HEC的質(zhì)量濃度為1.2%。10.根據(jù)權利要求7或8所述的分離方法，其特征在于，步驟7)中進樣時間為20s，電壓為-16.5kv。全文摘要本發(fā)明提供了一種用于多重PCR小分子擴增片段的高效分離方法，首先用磁珠純化法對多重PCR小分子擴增片段進行純化，然后再采用毛細管電泳法進行分離。本發(fā)明采用多重PCR方法與毛細管電泳結合的方法可以對轉(zhuǎn)基因植物進行快速的篩查。多重PCR具有節(jié)約模板、節(jié)省試劑和時間的高效性；磁珠法對多重PCR產(chǎn)物進行處理可以有效的除去PCR反應體系中的雜質(zhì)，使其更適合于進行毛細管電泳；毛細管電泳具有檢測限低、靈敏度高和檢測時間短的特點。本發(fā)明應用安全，可以成功的對多重PCR小分子擴增片段進行分離鑒定，檢測時間控制在10.6min，可廣泛地應用于食品衛(wèi)生檢疫以及臨床檢驗等領域中。文檔編號C12N15/10GK101705225SQ200910236730公開日2010年5月12日申請日期2009年11月5日優(yōu)先權日2009年11月5日發(fā)明者張春嬌,戴蘊青,王龑,羅云波,許文濤,黃昆侖申請人:中國農(nóng)業(yè)大學