專利名稱：稻瘟病抗性基因Pik-p及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pik-P的克隆及其 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則采取多種防御策略 以保護(hù)自身，避免受其侵襲。植物中一個(gè)最重要的防御機(jī)理就是能夠識(shí)別專性致病微生物 的存在并啟動(dòng)自身的防御應(yīng)答系統(tǒng)。植物對(duì)病原菌的識(shí)別由抗病基因所介導(dǎo)。因此，抗病 基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析與研究，是了解植物抗病機(jī)制的基礎(chǔ)，對(duì)于植物病害的預(yù)防和控制也 具有重要的指導(dǎo)意義。迄今為止，已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物中分離了 80多個(gè)抗病基因。對(duì)這些抗 病基因的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，雖然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、細(xì)菌、病 毒和線蟲等差異，但抗病基因的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物卻有許多共同的結(jié)構(gòu)特征，如C-端存在富亮氨 酸重復(fù)序列(leucine-rich r印eat，LRR)，N-端存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site, NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zipper, LZ)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil，CC)，跨膜 結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM)，蛋白激酶(protein kinase,PK)，以及果蠅 Toll 蛋白 及哺乳動(dòng)物白介素-1受體(Toll andinterleukin-1 receptor, TIR)等。根據(jù)它們所編碼 蛋白的結(jié)構(gòu)特征，可將抗病基因分為7類(Hammond-Kosack & Jones，1997 ；Dangl & Jones 2001 ；Iyer & McCouch2004)。第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hml，它是第1個(gè)被克隆的植物 抗病基因，它控制對(duì)真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hml編碼的解毒酶能鈍化 病原真菌所產(chǎn)生的HC毒素，而HC毒素是真菌C. carbonum小種1產(chǎn)生的致病因子，它決定該 病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類抗病基因。它們編碼 的蛋白近N端為 NBS，而近C端則由 LRR組成。如 RPS2(Bent et al. , 1994) ,RPMl (Grant et al. , 1995) >12 (Simon et al.，1998) ；RPP5 (Parker et al.，1997)、N(Dodd et al. ,2001) > L6(Lawrence et al.，1995)、Mlal(Zhou et al.，2001)、Mla6(Halterman et al. ,2001) ；/K 稻的抗病基因如 Xal (Yoshimura et al.，1998)、Pib (Wang et al.，1999)、Pita (Bryan et al. ,2000)等。第三類，PK類抗病基因。如番茄Pto基因，其產(chǎn)物是一種位于細(xì)胞內(nèi)的絲氨 酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結(jié)構(gòu)域(Martin et al.，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基 因。番茄抗葉霉病不同生理小種的基因Cf-2 (Dixon et al.，1996)、Cf_4 (Thomas et al.， 1997)、Cf-5 (Dixon et al.，1998)、Cf-9 (Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基 因Hslpra-1 (Cai et al. , 1997)等。第五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因 Xa2KSong et al. , 1995)為代表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有 完整的CC和NBS結(jié)構(gòu)域(Xiao et al.，2001)。第七類，以水稻的xa5基因?yàn)榇恚渚幋a 的蛋白為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TFIIAy) (Iyer & McCouch, 2004) 編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病基因，根據(jù)NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又可將該類基因分為兩大類TIR-NBS-LRR(TNL) 禾口 CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers et al. ,2002 ；Pan et al. ,2000 ；Cannon et al. ,2002 ； Richly et al.，2002)。TNL類抗病基因主要發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物，至今還沒在單子葉植物基 因組中發(fā)現(xiàn)(Bai et al. ,2002 ；Meyers et al.，2002)。目前在單子葉植物中鑒定到的抗 病基因主要編碼CNL類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量的CNL類抗病基因，相對(duì)而言， 單子葉植物中的CNL類抗病基因比雙子葉植物中的更豐富多樣(Cannon et al.，2002)。
研究表明，NBS, CC、TIR結(jié)構(gòu)域可能參與信號(hào)傳導(dǎo)(Hammond-Kosack & J0neS1997)，盡管這類R蛋白不具有內(nèi)在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具 有結(jié)合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。TIR結(jié)構(gòu)可能參與植物抗病防 衛(wèi)反應(yīng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)(Jones et al.，1994)。最近的證據(jù)表明，亞麻的L族多樣性選擇 也發(fā)生在TIR區(qū)域，這個(gè)區(qū)域與相應(yīng)的LRR區(qū)域共進(jìn)化形成特異性(Luck et al.，2000)。 LRR結(jié)構(gòu)域的功能主要涉及到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和與配體的相互作用(Jones & Jones，1996 ； Kajava et al.，1998)，據(jù)推測(cè)是抗病基因產(chǎn)物直接和病原菌無毒基因編碼的產(chǎn)物或間接 產(chǎn)物相互作用的部位(Bent, 1996 ；Bakeret al.，1997)。Jia et al. (2000)通過酵母雙雜 交證明AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個(gè)176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小種特異性的 激發(fā)子，傳遞到植物細(xì)胞質(zhì)特異地與Pita受體的LRD區(qū)域結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)Pita介導(dǎo) 的防衛(wèi)反應(yīng)。當(dāng)Pita中的Ala變?yōu)镾er后Av-rPita176不能與LRD結(jié)合，因而表現(xiàn)感病。這 一結(jié)果直接證明了 LRR結(jié)構(gòu)域可能就是病原菌識(shí)別的區(qū)域；Pita與AvrPita的互作第一次 從分子水平驗(yàn)證了水稻與稻瘟病菌的“基因?qū)颉标P(guān)系。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病 原真菌Magnapothe oryzae (無性態(tài)=Pyricularia oryzae)引起的稻癌病是對(duì)水稻生產(chǎn)危 害最嚴(yán)重的病害之一，每年都造成嚴(yán)重的糧食損失。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的觀 點(diǎn)來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群體 的多樣性及易變性，加之人們?nèi)狈?duì)抗性基因的有效利用，以及對(duì)抗性機(jī)理缺乏充分的了 解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品 種的短命化而成為育種學(xué)家最為棘手的問題。因此，發(fā)掘、鑒定和克隆抗病基因并合理地應(yīng) 用于抗病育種計(jì)劃已成為農(nóng)業(yè)科研中優(yōu)先解決的重要問題。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，迄今，至少有80多個(gè)水稻稻瘟病主效抗性基因已經(jīng) 被報(bào)道，其中60個(gè)已經(jīng)被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被鑒定到稻瘟 病主效抗性基因之外，其余的11條染色體上均被鑒定到有主效抗性基因位點(diǎn)，并且有的 染色體上含有多個(gè)稻瘟病抗性位點(diǎn)，而且有些基因位點(diǎn)的抗性基因是成簇存在的。目前， 在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式報(bào)道的已有13個(gè)抗性基因，Pib (Wang et al., 1999), Pita (Bryan et al. ,2000), Pi9 (Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.,2006), Piz-t 和 Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36 (Liu et al.，2007a)，Pi37 (Lin et al. ,2007), Pik-m(Ashikawa et al.，2008)，Pit (Hayashi et al.，2009)，Pi5 (Lee et al. ,2009), Pid3(Shang et al.，2009)禾口pi21 (Fukuoka et al.，2009)?？寺】共』蚴菍?duì)水稻抗性機(jī)理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機(jī)理 可以更好地控制和降低稻瘟病菌對(duì)水稻的危害。同時(shí)，對(duì)克隆的抗病基因的修飾和改造，可 以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水稻稻瘟病抗性基因和包含調(diào)控這個(gè)基因的啟動(dòng)子的 DNA片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述抗性基因產(chǎn)生的分子標(biāo)記及其在選育對(duì)稻瘟病 具有抗病性的水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明從水稻K60中分離得到Pik-p基因，包括編碼兩個(gè)NBS-LRR類蛋白的基 因Pikp3、Pikp4，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示，它們分別編碼SEQ ID N0.3以及SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，結(jié)構(gòu)如圖5a和5b所示。它們的蛋白都 包含2個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域NBS和LRR區(qū)域，其中Pikp3 NBS結(jié)構(gòu)域含有保守的kinase la: GLPGGGKTTVAR, kinase 2 =KKYLIVIDDIff, kinase3a =DLGGRI IMTTRLNSI ；Pikp4 NBS 結(jié)構(gòu)域含 有保守的 kinase la :VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase 2 :LEQLLAEKSYILLIDDIW 和 kinase 3a: EQVPEEIWKICGGLPLAIVT。而Pikp3蛋白的C-末端為16個(gè)不完整的LRR重復(fù)，其亮氨酸含 量為14.0%;Pikp4蛋白的C-末端為13個(gè)不完整的LRR重復(fù)，其亮氨酸含量為17.0% (圖 5a, 5b)。Pik-p基因中編碼NBS或LRR的核苷酸片段可能具有獨(dú)立的功能。將Pik-p基因 中編碼不同結(jié)構(gòu)域的片段與其他核酸片段重組，可構(gòu)成嵌合基因或蛋白質(zhì)，使之具有新的 功能。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可對(duì)SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編 碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對(duì)編碼 上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替 換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。 本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的 克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的 植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明同樣包括將Pik-p抗性基因的主要結(jié)構(gòu)部分有效地連接上合適的調(diào)節(jié)序 列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。這種基因 可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子連接，該 啟動(dòng)子可以在任何條件下和細(xì)胞發(fā)育的任何時(shí)期表達(dá)。這種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括花椰 菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子等。另一方面，也可以將該基因和一個(gè)組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子 或發(fā)育時(shí)期特異性表達(dá)的啟動(dòng)子或精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接，這些啟動(dòng)子稱之為誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時(shí)期的不同都可以改變?cè)摶虻谋磉_(dá)。同樣地，也可以將 該基因的表達(dá)限定在某一個(gè)組織內(nèi)，使由該基因誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)得到人為的控制。其中環(huán)境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發(fā)育時(shí)期包括葉、果實(shí)、種子和花等。本發(fā)明還進(jìn)一步克隆得到所述基因的啟動(dòng)子，包含調(diào)控該基因的啟動(dòng)子的DNA片段分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。根據(jù)本發(fā)明提供的Pik-p基因序列信息(SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以通過以下方法容易地獲得與Pikp等同的基因(1)通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2) 以Pik-p基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)獲得；(3)根據(jù) Pik-p基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從水稻或其它植物的基因組、 mRNA和cDNA中獲?。?4)在Pik-p基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化 學(xué)合成的方法獲得該基因。本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因Pik-p具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其賦予植物對(duì)稻瘟病 菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。其適用于對(duì)所有對(duì)該病原 菌敏感的植物，這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。應(yīng)用之一是將所述的Pik-p基因 序列連接到任何一種植物轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將Pik-p抗病基因?qū)胨净蚱?他植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因 構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對(duì)所述基因或其調(diào)控序列適當(dāng)修飾，也可以在其轉(zhuǎn)錄起始密 碼子前用其它啟動(dòng)子取代所述基因原有的啟動(dòng)子，從而拓寬和增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性。本發(fā)明提供的抗性基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分 子標(biāo)記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP(限制性內(nèi)切 酶長(zhǎng)度多態(tài))、CAP (切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用此標(biāo)記可鑒定水稻或其它植物的抗性基因型， 用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果。將克隆的抗病基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生 新的抗病植物。特別是可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種 技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時(shí)間?？共』虻目?隆是克服傳統(tǒng)育種中不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病基因的問題的前提。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相 應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種 子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他的植株。


圖1.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的圖位克隆技術(shù)路線圖。圖2a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp3之正向遺傳互補(bǔ)Ttl植株的 抗性鑒定實(shí)物圖。圖中所有轉(zhuǎn)化植株都表現(xiàn)感病，說明單一的Pikp3不具備抗性功能。圖2b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一組成基因Pikp4之正向遺傳互補(bǔ)Ttl植株 的抗性鑒定實(shí)物圖。圖中所有轉(zhuǎn)化植株都表現(xiàn)感病，說明單一的Pikp4也不具備抗性功能。圖2c.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p (由Pikp3和Pikp4組成)之正向遺傳互補(bǔ)T。 植株的抗性鑒定實(shí)物圖。圖中箭頭1所指的是抗病植株，箭頭2所指的是感病植株，說明抗 性基因Pik-p由Pikp3和Pikp4組成才能表現(xiàn)功能。圖2d.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的正向遺傳互補(bǔ)的部分Ttl轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記 GUS和HPT基因的PCR檢測(cè)圖。
圖中泳道1 分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 =H2O,陰性對(duì)照；泳道3 空載體，陽(yáng)性對(duì) 照；泳道4-12 =Ttl轉(zhuǎn)化體。結(jié)果表明，所有轉(zhuǎn)化體都檢測(cè)到了 2個(gè)選擇性標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，說明正義轉(zhuǎn)化構(gòu)建體已經(jīng)整合到了高感受體品種Q1063中。R 高抗；MR 中抗；S 感病。 其中的感病個(gè)體(S)可能是由于外源基因的整合等問題，在受體品種中并沒有得到充分的 表達(dá)。圖3a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p反向遺傳互補(bǔ)(RNAi)植株的抗性鑒定圖。圖 中箭頭1所指的是抗病植株，箭頭2所指的是感病植株。
圖3b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp3之RNAi T0轉(zhuǎn)化體基于載體 特異性標(biāo)記的PCR檢測(cè)圖。圖中泳道1 分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 =H2O,陰性對(duì)照；泳道3 空載體，陽(yáng)性對(duì) 照；泳道4-15:RNAi Ttl轉(zhuǎn)化體。其中，所有的感病個(gè)體(S)都檢測(cè)到了載體特異性標(biāo)記 (pMCG)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明RNAi構(gòu)建體已經(jīng)整合到受體品種K60(含有Pik-p)中，由此干 涉(抑制)了該基因的表達(dá)而表現(xiàn)感??；抗病個(gè)體(R)沒有檢測(cè)到載體特異性標(biāo)記(PMCG) 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明RNAi構(gòu)建體沒有整合到受體品種K60 (含有Pik-p)中，由此該基因 的表達(dá)沒有受到干涉(抑制)而表現(xiàn)抗病。圖3c.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一個(gè)組成基因Pikp4之RNAi T0轉(zhuǎn)化體基 于載體特異性標(biāo)記的PCR檢測(cè)圖。圖中泳道1 分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 =H2O,陰性對(duì)照；泳道3 空載體，陽(yáng)性對(duì) 照；泳道4-18:RNAi Ttl轉(zhuǎn)化體。其中，所有的感病個(gè)體(S)都檢測(cè)到了載體特異性標(biāo)記 (pMCG)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明RNAi構(gòu)建體已經(jīng)整合到受體品種K60 (含有Pik-p)中，由此 干涉(抑制)了該基因的表達(dá)而表現(xiàn)感病；而抗病個(gè)體(R)都沒有檢測(cè)到載體特異性標(biāo)記 (pMCG)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明RNAi構(gòu)建體沒有整合進(jìn)受體品種K60 (含有Pik-p)中，由此 該基因的表達(dá)沒有受到干涉(抑制)而表現(xiàn)抗病。圖3d.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp4之RNAi 2個(gè)T1轉(zhuǎn)化系基于 載體特異性標(biāo)記的共分離鑒定圖。上圖和中圖為RNAi T1轉(zhuǎn)化系KP4RNAi-28 ；下圖為RNAi T1轉(zhuǎn)化系KP4RNAi_3。3 個(gè)圖中，泳道1 分子量標(biāo)記DL2000 ；泳道2 :H20，陰性對(duì)照；泳道3 空載體，陽(yáng)性對(duì)照；其余 泳道RNAi T1轉(zhuǎn)化個(gè)體。結(jié)果表明，所有的感病后代個(gè)體(S)都檢測(cè)到了載體特異性標(biāo)記 (GUS)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而抗病個(gè)體(R)都沒有檢測(cè)到載體特異性標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說 明2個(gè)RNAi T1轉(zhuǎn)化系后代個(gè)體的基因型與表型共分離。圖4a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp3的基因結(jié)構(gòu)圖。圖中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內(nèi)含子； KP3RNAil和KP3RNAi2表示RNAi干涉所用片段及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。圖4b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一組成基因Pikp4的基因結(jié)構(gòu)中淺色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外顯子；線條表示內(nèi)含子； KP4RNAi、KP4 RNAil和KP3RNAi2表示RNAi干涉所用片段及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。圖5a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp3編碼的氨基酸多肽序列結(jié)構(gòu) 圖。圖中CC結(jié)構(gòu)域中的黑體字表示形成CC motif的氨基酸，NBS區(qū)域的黑體字表示NBS中保守的氨基 酸序列。LRR區(qū)域后面還帶有一段CNL(C端非LRR區(qū)域)氨基酸序列。雙 下線標(biāo)示的4個(gè)氨基酸序列為等位基因特異的氨基酸替換(substitution，與已被克隆的 Pik-m基因相比)。圖5b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之組成基因Pikp4編碼的氨基酸多肽序列結(jié)構(gòu) 圖。圖中CC結(jié)構(gòu)域中的帶下劃線的黑體字表示形成CC結(jié)構(gòu)的氨基酸，NBS區(qū)域帶下 劃線的黑體字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分獨(dú)立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR 區(qū)域。雙下線標(biāo)示的3個(gè)氨基酸序列為等位基因特異的氨基酸替換(substitution，與已被 克隆的Pik-m基因相比)。圖6.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p表達(dá)特性的定量RT-PCR檢測(cè)圖。上圖為組成基因Pikp3在不同的接種時(shí)間點(diǎn)(0hr，12hr，24hr，72hr)的相對(duì)表 達(dá)水平，由此可以看出，該基因呈逐步上調(diào)后而下降的表達(dá)類型。上圖為另一個(gè)組成基因 Pikp4在不同的接種時(shí)間點(diǎn)(0hr，12hr，24hr，72hr)的相對(duì)表達(dá)水平，由此可以看出，該基 因呈下調(diào)后上調(diào)而又下調(diào)的表達(dá)類型。2個(gè)組成基因都表現(xiàn)為組成型表達(dá)，因?yàn)榻臃N之前和 之后都能檢測(cè)到2個(gè)基因的表達(dá)。圖7.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik-p特異性分子標(biāo)記的基因型鑒定圖。圖中，M 分子量標(biāo)記DL2000 ；Pl 抗性品種K60的基因型(Pikp/Pikp) ；P2 感病品種AS20-1的基因 型(pikp/pikp) ；Rl和R3 抗性個(gè)體的雜合基因型(Pikp/pikp) ；Si, S2，S3，S4 感病個(gè)體 的基因型(pikp/pikp) ；R2 抗性個(gè)體的純合基因型(Pikp/Pikp)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了 Pik-p基因的分離過程(圖1)和該基因的 特點(diǎn)，分離的Pik-p基因能夠與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入植物體中，使該植物體帶有一定的抗 性。實(shí)施例1 抗性基因Pik-p的抗性特征首先，為了比較和明確在Pik位點(diǎn)上4個(gè)等位基因(Pik，Pik-p, Pik-s, Pik-m)的 抗譜，利用從廣東(60個(gè)菌株)，福建(40個(gè))，湖南(40個(gè))，貴州(60個(gè))，云南(43個(gè))， 四川(66個(gè))，江蘇(72個(gè))，遼寧(108個(gè))，吉林(60個(gè))，黑龍江(63個(gè))，收集的總計(jì)612 個(gè)菌株對(duì)上述4個(gè)等位基因所持品種(分別是Kusabue，K60, Shin 2和Tsuyuake)進(jìn)行了 抗譜比較分析。結(jié)果表明，Pik-p基因表達(dá)了與其他3個(gè)等位基因不同的抗性反應(yīng)；該基因 在廣東(96. 7% )、江蘇(90. 9% )和四川(90. 9% )表現(xiàn)高水平的抗性，由此說明該基因至 少可在上述地區(qū)使用(Wang et al. 2009，Phytopathology，99 :900_905)。其次，利用上述 612個(gè)菌株對(duì)Pik-p基因與目前中國(guó)水稻抗稻瘟病育種計(jì)劃中常用的抗源基因(Pil，Ρ 2, Pi3，Pi4等)進(jìn)行了抗譜比較分析。結(jié)果表明，Pik-p基因表達(dá)與這些抗源基因差異明顯的 抗性反應(yīng)，由此說明該基因可在上述育種計(jì)劃中與這些抗源基因聚合使用，以獲得更廣、更持久的抗性(Wang et al. 2009, Phytopathology, 99 :900_905)。實(shí)施例2 水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的遺傳分析及初步定位 本發(fā)明對(duì)由粳稻抗病品種K60與2個(gè)秈稻感病品種AS20-1及Kasalath的雜交組 合由來的F2群體(F2-I和F2-2)，接種對(duì)雙親品種表現(xiàn)分明的非親和性/親和性反應(yīng)的菌株 M028 (稻瘟病菌單一孢子分離的菌株)。結(jié)果表明，這2個(gè)F2群體中抗病植株與感病植株 的分離比都符合3 1。由此推斷，K60所表現(xiàn)的對(duì)接種菌株M028的抗性是由一對(duì)顯性基 因控制的。對(duì)這2個(gè)F2群體對(duì)應(yīng)的抗性基因進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果表明它們受同一顯性基因 控制，因此，構(gòu)建了由這2個(gè)F2群體由來的340個(gè)體和341個(gè)體組成的一個(gè)作圖群體(Wang et al. 2009，Phytopathology, 99 :900_905)。前期的遺傳分析表明Pik-p基因與Pik-m基因是等位的，而Li et al(2007, Molecular Breeding，20 :179_188)對(duì)Pik_m基因進(jìn)行了精細(xì)定位。因此，申請(qǐng)人首先利 用 Li et al (2007，Molecular Breeding，20 :179_188)開發(fā)的微衛(wèi)星(simplesequence repeat, SSR)標(biāo)記(RM254，RM456C, RM224, RM7443, RM5926),進(jìn)行分離群體分析 (bulked-sgregant analysis，BSA)。結(jié)果表明，只有最靠近端粒的RM5926在2個(gè) 群體中都表現(xiàn)連鎖性多態(tài)，并分別鑒定到了 28和14個(gè)重組體(Wang et al. 2009, Phytopathology，99 :900-905)。然后，選擇 Li et al (2007，Molecular Breeding, 20 179-188)開發(fā)的靠近著絲粒的分子標(biāo)記K37進(jìn)行連鎖分析，分別獲得了 3和2個(gè)重組體。 根據(jù)上述結(jié)果推斷，Pik-p基因位點(diǎn)被界定于RM5926——K37之間，其中鑒定到了總共47 個(gè)不同的重組體。實(shí)施例3 水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的精細(xì)定位及電子物理作圖為了縮小Pik-p位點(diǎn)的染色體區(qū)域，進(jìn)一步在RM5926——K37區(qū)域內(nèi)，從Li等 (2007)開發(fā)的9個(gè)標(biāo)記中獲得了 7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(RM144，K25，K15-2，K22，K28，K34，K39)。 這些多態(tài)性標(biāo)記對(duì)上述47個(gè)不同的重組體進(jìn)行連鎖分析的結(jié)果表明，Pik-p基因被界定于 K28——K39之間約0. 67cM的區(qū)域內(nèi)。為了進(jìn)一步縮小Pik-p位點(diǎn)的染色體區(qū)域，在K28—— K39區(qū)域內(nèi)開發(fā)了 4個(gè)多態(tài)性標(biāo)記(K33，K40，K41和Κ42)，結(jié)果表明，這4個(gè)標(biāo)記都與Pik-p 位點(diǎn)表現(xiàn)完全的共分離。因此，Pik-p位點(diǎn)最終被界定于K28——K39之間約0. 67cM的區(qū) 域內(nèi)，其中 4 個(gè)標(biāo)記與之完全共分離(Wang et al. 2009，Phytopathology，99 :900_905)。為了構(gòu)建Pik-p位點(diǎn)的電子物理圖，把與之連鎖的標(biāo)記通過生物信息學(xué)方法著陸 于水稻品種Nipponbare的參考序列上，并由此構(gòu)建了該基因位點(diǎn)的重疊群。由參考序列可 以推測(cè)Pik-p位點(diǎn)被界定于側(cè)翼標(biāo)記K28和K39之間約126kb的范圍內(nèi)(Wang et al. 2009, Phytopathology, 99 :900_905)。實(shí)施例4 水稻稻瘟病抗性基因Pik-p候選基因的注釋及序列分析為了確定Pik-p的候選基因，申請(qǐng)人利用日本晴的參考序列，通過3種基因預(yù)測(cè) 軟件 RiceGAAS (http://ricegaas. dna. affrc. go. jp)、Gramene (http //143. 48. 220. 116/ resources/)禾口 Softberry 的 FGENESH(http://www. softberry. com)對(duì)目的基因區(qū)域進(jìn)行 了基因預(yù)測(cè)及注釋分析，初步確定了 Pik-p的候選抗性基因?yàn)?個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮 氨酸重復(fù)(nucleotide binding site-leucine-rich repeat,NBS-LRR)的候選基因(KP1, KP2, KP3 禾口 KP4)。對(duì)4個(gè)候選基因進(jìn)行基于基因特異性標(biāo)記的存在/缺失(presence/absence，P/Α)分析，結(jié)果表明，在日本晴參考序列存在的2個(gè)候選基因(KPl和KP2)在K60中是不存在 的。因此，將KP3和KP4通過以下的基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其功能。實(shí)施例5 水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的正向遺傳學(xué)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)化體的抗性鑒 定首先，利用高保真酶phusion結(jié)合長(zhǎng)片段PCR(long_range PCR, LR-PCR)技術(shù)，以 K60 (Wang et al. 2009，Phytopathology, 99 900-905)的總 DNA 為模板，根據(jù)或參考 Liu et al. (2007,Genetics, 176 2541-2549)和 Lin et al. (2007，Genetics，177 1871-1880) 描述的實(shí)驗(yàn)方法和程序，分別擴(kuò)增、克隆了 KP3(正向引物術(shù)，以K60(Wang et al. 2009, Phytopathology, 99 :900_905)的總 DNA 為模板，根據(jù)或參考 Liu et al. (2007, Genetics, 176 2541-2549)和 Lin et al. (2007，Genetics, 177 1871-1880)描述的實(shí)驗(yàn)方法和程 序，分別擴(kuò)增、克隆了 KP3 (正向引物TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA ；反 向引物:TTTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)和 KP4(正向引物:TTTTGGCGCGC CGCAAGATCAGTACCATCACGAGTAATAGCA ；反向引物:TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAG TGAGTTTG)，并進(jìn)行了遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，這個(gè)2個(gè)候選基因都沒有在感病受體品種 Q1063(Lin et al.，2007，Genetics，177 1871-1880)中實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)(表 1 ；圖 2a，2b)。此 夕卜，對(duì)KP4進(jìn)行超表達(dá)(overexpressiomOX)分析，也沒有獲得功能互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化體(表1)。
表1. Pik-p 2個(gè)組成基因的正、反向遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析
權(quán)利要求
1.稻瘟病抗性基因Pik-p，其至少編碼a)和b)所述氨基酸序列中的一種，其中a)SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列替換、缺失或添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列；b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列替換、缺失或添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示，或SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的串聯(lián)序列。
3.權(quán)利要求1或2所述基因的cDNA序列。
4.權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白。
5.由權(quán)利要求1或2所述基因或權(quán)利要求3所述cDNA與啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)盒。
6.含有權(quán)利要求1或2所述基因或權(quán)利要求3所述cDNA的表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求1或2所述基因、權(quán)利要求3所述cDNA、權(quán)利要求4所述蛋白、權(quán)利要求5 所述表達(dá)盒或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述基因、權(quán)利要求3所述cDNA、權(quán)利要求4所述蛋白、權(quán)利要求5 所述表達(dá)盒或權(quán)利要求6所述表達(dá)載體在提高水稻抗稻瘟病中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的所述基因產(chǎn)生的分子標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9所述的分子標(biāo)記在水稻抗稻瘟病的輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該序列包含有2個(gè)基因，都屬于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成員，且皆為組成型表達(dá)的基因。本發(fā)明還涉及用該基因轉(zhuǎn)化水稻或其它植物培育抗病品種以及根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102041262SQ20091023646
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者徐曉可, 林菲, 潘慶華, 王玲, 袁斌 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)