專利名稱：螺旋粉虱特異性scar引物、檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及螺旋粉虱特異性SCAR引物、檢 測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell屬同翅目，粉虱科，粉虱亞科，復(fù)孔粉 虱屬，是一種嚴(yán)重危害農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的入侵性害蟲，加勒比區(qū)域植物保護(hù)組織將其列為A2檢 疫性有害生物。螺旋粉虱危害包括蔬菜、果樹、觀賞植物、行道樹及森林等在內(nèi)的90科295 屬481種植物，其中以番石榴、桑、欖仁、木瓜、番荔枝、櫻桃、辣椒、茄子、枸杞、洋紫荊、朱 槿、楓樹、大理花、杜鵑花、茉莉花、圣誕紅、美人蕉、猩猩草、鐵莧等受害較嚴(yán)重。其為害方式 主要有三種，包括直接吸食植物汁液致使寄主葉片提前脫落，若蟲分泌大量白色蠟粉影響 寄主植物外觀、成蟲及分泌物隨風(fēng)飄散引起人們厭惡及恐慌，分泌蜜露誘發(fā)霉污病、影響植 物光合作用及園林植物的觀賞價值并招引螞蟻、蠅類昆蟲頻繁出沒，不僅影響糧食作物、經(jīng) 濟(jì)果樹等的產(chǎn)量，而且對我國觀賞植物的出口貿(mào)易構(gòu)成嚴(yán)重威脅。 螺旋粉虱起源于中美洲和加勒比地區(qū)，1905年在馬提尼克島(屬西印度群島)的 番石榴上首次記錄，之后分別向東、西蔓延，陸續(xù)在古巴、巴西、厄瓜多爾、秘魯，非洲西北角 的加納利群島等地發(fā)現(xiàn)，并分別逐漸蔓延至太平洋地區(qū)及非洲西岸地區(qū)。1978年9月在夏 威夷瓦胡島的欖仁樹Terminalia cat即pa上首次發(fā)現(xiàn)，并在低海拔地區(qū)大量發(fā)生。目前， 螺旋粉虱已在40多個國家/地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并在美國、菲律賓、馬來西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞、印度 尼西亞、尼日利亞、多哥、貝寧、加納、剛果、西班牙、印度等國發(fā)生危害。我國于1988年在臺 灣省高雄市大寮鄉(xiāng)的番石榴植株上發(fā)現(xiàn)螺旋粉虱，次年蔓延至鳳臺市番石榴園，并快速傳 播擴(kuò)散。當(dāng)1 2年生或4 5年生的番石榴受到螺旋粉虱為害時，僅4個月，其產(chǎn)量損失 即高達(dá)80%;當(dāng)持續(xù)為害圣誕紅35天時，為害率達(dá)98% ，持續(xù)為害48天時全株葉片枯萎而 喪失觀賞價值。2006年4月螺旋粉虱在海南陵水首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已分布至除昌江縣和東方市 以外的全島其他15個市縣；而且，在吊羅山和尖峰嶺保護(hù)區(qū)的林業(yè)局生活區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了螺 旋粉虱的發(fā)生，其分布常呈線狀或點(diǎn)狀。調(diào)查顯示，螺旋粉虱在海南省的寄主植物種類有47 科120種，包括熱帶果樹、蔬菜、熱帶作物、糧食作物、觀賞與園藝作物等，其中印度紫檀、番 石榴、木薯、龍眼、木瓜、欖仁、美人蕉、飛揚(yáng)草、野甘草等受害最為嚴(yán)重。螺旋粉虱是傳入我 國的另一種外來入侵生物，鑒于其目前僅在我國臺灣和海南發(fā)現(xiàn)，而且一旦發(fā)生即可造成 嚴(yán)重危害，并在我國具有進(jìn)一步擴(kuò)散和蔓延的趨勢。而人為傳播是螺旋粉虱擴(kuò)散蔓延的主 要方式，因此加強(qiáng)對螺旋粉虱的檢疫和監(jiān)測是杜絕其進(jìn)一步傳播擴(kuò)散的根本途徑。
螺旋粉虱體型微小，成蟲體長2mm左右，初孵若蟲不足0. 3mm，因此加強(qiáng)檢疫和監(jiān) 測必需建立一套快速而準(zhǔn)確的分子檢測方法。目前國際上用于螺旋粉虱鑒定的方法主要 是l)形態(tài)特征鑒定；2)PCR技術(shù)等。但目前國內(nèi)針對螺旋粉虱尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。
RAPD技術(shù)曾用于鑒別螺旋粉虱及其近緣種。RAPD技術(shù)檢測是以基因組DNA為模 板，以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，在DNA聚合酶的催化下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上根據(jù)多態(tài)性來判斷檢測結(jié)果。SCAR-PCR技術(shù)檢測是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供螺旋粉虱特異性SCAR引物。
本發(fā)明的再一 目的是提供螺旋粉虱特異性基因片段。
本發(fā)明的再一 目的是提供螺旋粉虱特異性檢測方法。
本發(fā)明的再一 目的是提供螺旋粉虱特異性檢測試劑盒。 本發(fā)明根據(jù)螺旋粉虱特有的基因組DNA序列，設(shè)計一對特異性引物，該引物只對螺旋粉虱具有擴(kuò)增能力。是對螺旋粉虱RAPD技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明的螺旋粉虱特異性SCAR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示
引物ADZE : 5' -AAAAACAGTTATCAAAATCG-3'。 根據(jù)本發(fā)明的另一螺旋粉虱特異性SCAR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示 引物ADZF : 5' -CGACCCTAAACTATTAACAA-3'。 使用本發(fā)明的螺旋粉虱特異性SCAR引物，可以特異性擴(kuò)增得到307bp的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No :3所示 a肌肌c3gtt atc肌肌tcg ggc肌肌肌t atctattgcg gt肌gagctt tatggtgcctatetgaccgt 70 aatctcgtcc aatagcatgt caaatttttc tcaaaaaact actaactatc atttaagtccatttttgcat 140 cctattgaag acatcaattt ttcgtctttt gtcctcctga atcggtcgtt tttcactctgtgcgacagcg 210 acacttccta gaagcgtcgc gtcagtgtgt gaacggtgtt aaaaattgtc cctaatacagggtgtccaga 280 acttatttgt taatagttta gggtcgt 307。
根據(jù)本發(fā)明的螺旋粉虱特異性檢測方法，包括使用上述螺旋粉虱特異性SCAR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。 根據(jù)本發(fā)明的螺旋粉虱特異性檢測試劑盒，包括上述螺旋粉虱特異性SCAR引物。
本發(fā)明根據(jù)螺旋粉虱特有的基因組DNA序列，設(shè)計一對特異性引物，該引物只對螺旋粉虱具有擴(kuò)增能力，是對螺旋粉虱RAPD技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時，使用本發(fā)明的螺旋粉虱特異性SCAR引物、檢測方法、檢測試劑盒提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測時間，在螺旋粉虱檢測/監(jiān)測方面具有很高的應(yīng)用價值，可以試劑盒的形式在我國口岸、花博會園區(qū)、國際鮮花港以及蔬菜和觀賞植物種苗/植株調(diào)運(yùn)中推廣。
本發(fā)明的螺旋粉虱特異性SCAR引物及快速PCR檢測方法，用于快速檢測螺旋粉虱。與國際現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢 1)檢測準(zhǔn)確性高。本方法根據(jù)螺旋粉虱特異性SCAR標(biāo)記設(shè)計的引物ADZE和ADZF，在PCR快速檢測螺旋粉虱時，可擴(kuò)增出307bp的片段，不僅對螺旋粉虱的單頭成蟲、擬
蛹、2齡和3齡若蟲可以進(jìn)行檢測，對于單粒卵和單頭初孵若蟲也能檢測。 2)操作簡便快捷。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，操作過程簡單、快速、高效。 一般整個過
程可在5個小時內(nèi)完成。 3)特異性強(qiáng)。本發(fā)明設(shè)計的引物可特異性檢測螺旋粉虱，在其近緣種、屬粉虱中無擴(kuò)增產(chǎn)物。 因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及害蟲監(jiān)測/檢測的需要。


圖1為引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱及其近緣種、屬粉虱的SCAR-PCR擴(kuò)增結(jié)果，
M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000 ;1 :B型煙粉虱Bemisia tabaci biotype B，2:Q型煙粉虱Bemisia tabaci biotype Q， 3 :黑剌粉虱Aleurocanthus spiniferus，4 :桔綠粉虱Dialeurodes citri， 5 :螺旋粉虱，6 :ZHJ_1型煙粉虱Bemisia tabaci biotypeZHJ_1，7 :ZHJ-2型煙粉虱Bemisia tabaci biotype ZHJ-2，8 :溫室粉虱Trialeurodesv即orariorum，9 :陰性對照(模板為水)。 圖2為引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱不同蟲態(tài)和性別的SCAR-PCR擴(kuò)增結(jié)果， M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000 ;1 :卵，2 :—齡若蟲，3 : 二齡若蟲，4 :三齡若蟲，5 :擬蛹(四齡若蟲)，6 :雌性成蟲，7 :雄性成蟲。 圖3為引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱最低檢出量的測定， M :分子量標(biāo)準(zhǔn)DGL2000 ;1 :1/100 ;2 :1/200 ;3 :1/400 ;4 :1/800 ;5 :1/1600 ;6 :
1/3200 ;7 :1/6400 ;8 :1/12800 ;9 :1/25600頭雌性成蟲。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱的擴(kuò)增效果
1)粉虱模板DNA的制備 將單頭粉虱置于滴有20 ii L提取緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、 lmmol/L EDTA、1%SDS、20mmol/LNaCl， pH 8. 0)的paraf ilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作為勻槳器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入1. 5mL離心管；然后以100 ii L緩沖液分4次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5 ii L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于6(TC水浴lh(中途混勻1次)；然后沸水浴5min，加入220iiL氯仿/異戊醇(V : V = 24 : l)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min ;4。C、10000r/min離心10min，取上清液，加入440 y L預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20°〇放置30min ;4。C、 12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入400ii L預(yù)冷的75X乙醇洗滌，4。C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管加入20 y L超純水，充分溶解后于-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2)檢驗(yàn)螺旋粉虱的特異性引物的合成
Primer ADZE :5' -AAAAACAGTTATCAAAATCG—3' Primer ADZF :5' -CGACCCTAAACTATTAACAA-3'由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系為20ii L，其中IOXPCR緩沖液2. 0 ii L、 dNTP (10mmol/L) 0. 4 ii L、 Taq聚 合酶(5U/ii L)O. 2ii L、上游引物和下游引物(20ng/ii L)各2. L、模板DNA 2. L、超純 水11. 4ii L。 4) PCR擴(kuò)增程序
95。C預(yù)變性3min ;35個循環(huán):94°C 30sec、51。C 30sec、72。C lmin ;最后72。C延伸 6min。

5)PCR產(chǎn)物的鑒定
取4 ii L PCR產(chǎn)物用1. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色
后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
結(jié)果 利用引物primer ADZE/ADZF以螺旋粉虱DNA為模板，以B型、Q型、ZHJ-1型、ZHJ-2 型煙粉虱以及黑剌粉虱、桔綠粉虱和溫室粉虱為對照進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增。在5泳道的螺旋 粉虱中擴(kuò)增出了 307bp的目的條帶(如圖1的5泳道)，在其他4種不同生物型煙粉虱及3 種近緣種、屬的粉虱中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明本發(fā)明所篩選的來自螺旋粉虱基因組DNA的特 異性PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。
307bp片段的序列 a肌肌C3gtt atc肌肌tcg ggc肌肌肌t atctattgcg gt肌gagctt tatggtgcct atatgaccgt 70 aatctcgtcc aatagcatgt caaatttttc tcaaaaaact actaactatc atttaagtcc atttttgcat 140 cctattgaag acatcaattt ttcgtctttt gtcctcctga atcggtcgtt tttcactctg tgcgacagcg 210 acacttccta gaagcgtcgc gtcagtgtgt gaacggtgtt aaaaattgtc cctaatacag ggtgtccaga 280 acttatttgt taatagttta gggtcgt 307
實(shí)施例2 :引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱不同蟲態(tài)和性別的擴(kuò)增效果
1)螺旋粉虱模板的制備 將不同蟲態(tài)和性別的單頭/單粒螺旋粉虱置于滴有20 ii L提取緩沖液(50mmo1/ LTris-HCl、l,l/L EDTA、1% SDS、20,l/LNaCl， pH 8. 0)的parafilm膜上，以0. 2mL的 PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入1. 5mL離心管；然后以100 ii L 緩沖液分4次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5ii L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻 后于6(TC水浴lh(中途混勻1次)；然后沸水浴5min，加入220iiL氯仿/異戊醇(V : V =24 : 1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min;4。C、10000r/min離心10min， 取上清液，加入440 ii L預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于_201:放置 30min ;4。C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入400 y L預(yù)冷的75%乙醇洗滌， 4t:、12000r/min離心15min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥 20min后每管加入20 ii L超純水，充分溶解后于-2(TC保存?zhèn)溆谩?
2)檢驗(yàn)螺旋粉虱的特異性引物的合成
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Primer ADZE :5' -AAAAACAGTTATCAAAATCG—3'Primer ADZF :5' -CGACCCTAAACTATTAACAA-3'由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有
限公司合成。 3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系為20ii L，其中IOXPCR緩沖液2. 0 ii L、 dNTP (lOmmol/L) 0. 4 ii L、 Taq聚 合酶(5U/ii L)O. 2ii L、上游引物和下游引物(20ng/ii L)各2. L、模板DNA 2. L、超純 水11. 4ii L。 4) PCR擴(kuò)增程序 95。C預(yù)變性3min ;35個循環(huán):94°C 30sec、51。C 30sec、72。C lmin ;最后72。C延伸 6min。 5)PCR產(chǎn)物的鑒定 取4 ii L PCR產(chǎn)物用1. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色
后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
結(jié)果 利用引物ADZE/ADZF以不同蟲態(tài)和性別的螺旋粉虱DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。螺 旋粉虱的雄性成蟲和雌性成蟲均擴(kuò)增出了 307bp的目的條帶(如圖2的6、7泳道)；同時 螺旋粉虱的單粒卵、單頭初孵若蟲、二齡若蟲、三齡若蟲和擬蛹也擴(kuò)增出了 307bp的目的條 帶(如圖2的1、2、3、4、5泳道)，說明我們所篩選的螺旋粉虱的特異性PCR擴(kuò)增引物的準(zhǔn)確性高。 實(shí)施例3 :引物ADZE/ADZF對螺旋粉虱最低檢出量的測定
1)螺旋粉虱模板的制備 將單頭螺旋粉虱雌性成蟲置于滴有20iiL提取緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、 lmmol/L EDTA、1% SDS、20,1/L NaCl， pH 8.0)的paraf ilm膜上，以0. 2mL的PCR管底 部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微量移液器移入1. 5mL離心管；然后以100 ii L緩沖液分 4次清洗勻漿器，移入同一離心管，混勻，加入5ii L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60°C 水浴lh (中途混勻1次)；然后沸水浴5min，加入220 y L氯仿/異戊醇(V : V = 24 : 1) 抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min ;4°C、10000r/min離心10min，取上清液，加 入440 ii L預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-2(TC放置30min ;4°C、 12000r/min離心15min，小心棄去上清液。加入400 y L預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4°C 、 12000r/ min離心15min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管 加入20 ii L超純水。然后原模板溶液稀釋10倍后以2倍進(jìn)行遞減梯度稀釋至1/25600頭， 取2 ii L最為PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。
2)檢驗(yàn)螺旋粉虱的特異性引物的合成
Primer ADZE :5' -AAAAACAGTTATCAAAATCG—3'Primer ADZF :5' -CGACCCTAAACTATTAACAA-3'由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有
限公司合成。 3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系為20ii L，其中IOXPCR緩沖液2. 0 ii L、 dNTP (1Ommol/L) 0. 4 ii L、 Taq聚 合酶(5U/ii L)O. 2ii L、上游引物和下游引物(20ng/ii L)各2. L、模板DNA 2. L、超純水11. 4ii L。 4) PCR擴(kuò)增程序 95。C預(yù)變性3min ;35個循環(huán):94°C 30sec、51。C 30sec、72。C lmin ;最后72。C延伸 6min。 5)PCR產(chǎn)物的鑒定 取4 ii L PCR產(chǎn)物用1. 5% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色
后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。 結(jié)果 利用引物primer ADZE/ADZF做最低檢出量的測定，以不同稀釋倍數(shù)的螺旋粉虱 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能檢測到的最低模板DNA濃度為1/6400頭成蟲(見圖3)。 序列表 〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 〈120〉螺旋粉虱特異性SCAR引物、檢測方法及試劑盒 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA 〈213>螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus Russell) 〈400〉 1 aaaaacagtt atcaaaatcg 20 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213>螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus Russell) 〈400>2 cgaccctaaa ctattaacaa 20 〈210>3 〈211>307 〈212>DNA 〈213>螺旋粉虱(Aleurodicus dispersus Russell) 〈400>PreSequenceString :
.0102] aaaaacagtt atcaaaatcg ggcaaaaaat atctattgcg gtaagagctt tatggtgcct 60
.0103] atatgaccgt aatctcgtcc aatagcatgt caaatttttc tcaaaaaact actaactatc 120
.0104] atttaagtcc atttttgcat cctattgaag acatcaattt ttcgtctttt gtcctcctga 180
.0105] atcggtcgtt tttcactctg tgcgacagcg acacttccta gaagcgtcgc gtcagtgtgt 240
.0106] gaacggtgtt aaaaattgtc cctaatacag ggtgtccaga acttatttgt taatagttta 300
:0107] gggtcgt 30權(quán)利要求
一種螺旋粉虱特異性SCAR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No1所示。
2. —種螺旋粉虱特異性SCAR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No: 2所示。
3. —種螺旋粉虱特異性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
4. 一種螺旋粉虱特異性檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1和2所述 的SCAR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
5. —種螺旋粉虱特異性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1和2所述 的SCAR引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及螺旋粉虱特異性SCAR引物、檢測方法及試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的螺旋粉虱特異性SCAR引物的核苷酸序列如SEQ ID No1和2所示。本發(fā)明根據(jù)螺旋粉虱特有的基因組DNA序列，設(shè)計一對特異性引物，該引物只對螺旋粉虱具有擴(kuò)增能力。是對螺旋粉虱RAPD技術(shù)檢測方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。
文檔編號C12Q1/68GK101693924SQ200910236219
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者萬方浩, 劉萬學(xué), 劉循, 吳霞, 張桂芬, 郭建英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所;