專利名稱：植物耐低溫蛋白tcf1及編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及1種植物耐低溫蛋白TCFl及編碼基因和相關轉基因應用。
背景技術：
溫度是植物生長發(fā)育所必需的環(huán)境因子，影響植物生長發(fā)育的所有過程，也是限制作物產(chǎn)量和分布的一個主要因素。冷害引起糧食作物大幅度減產(chǎn)是世界范圍內(nèi)普遍存在的問題。據(jù)估計，每年全世界僅用于減輕霜凍的危害就需要花費數(shù)億美元(Pearce 1999)。 因此，闡明植物抗寒的機理，不僅有著重要的科學理論意義，而且具有重要的應用價值。在過去的20年中，由于模式植物的利用和相關功能基因的發(fā)現(xiàn)，使得我們在對植物抗逆如抗旱、鹽堿分子機制的研究方面取得了很多突破性的進展。但是與植物抗旱和抗鹽堿的分子機制的研究相比，對植物抗冷機理的研究相對滯后，用生物技術培育抗冷作物新品種的工作也比較落后。長期以來，人們主要用傳統(tǒng)遺傳育種的方法對農(nóng)作物的抗逆性進行改良，然而這種方法具有效率低、周期性長的缺點，并且隨著長期的使用其效果越來越不明顯。利用轉基因技術將抗逆相關基因轉化到農(nóng)作物中是提高其抗逆性的一個更直接有效的途徑和必然趨勢。因此，采用正反向遺傳學和綜合現(xiàn)代生物技術的研究方法，加快克隆植物感受冷信號及信號轉導途徑的重要基因，理解這些基因的功能和調控的網(wǎng)絡的工作就變得非常緊迫。在植物受到冷脅迫后，染色質發(fā)生多種變化(Cheung P et al 2000 ；Rea S et al 2000 ；Stefanowska M et al2002 ；He Y et al 2003 ；Bastow R et al 2004 ；Kumar and Wigge 2009)，如組蛋白的修飾，組蛋白與DNA的結合情況，從而調控相關基因表達，影響蛋白質與代謝物質的合成與降解，使植物體內(nèi)重新恢復物質和能量代謝平衡，幫助植物應對冷脅迫，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受低溫脅迫誘導表達， 這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節(jié)其它相關基因的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對低溫脅迫的抗性(Xin and Browse 2000)。與低溫脅迫相關的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物低溫等脅迫應答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與低溫脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉錄因子等(Liu et al 2000)。目前，在冷馴化中起重要作用的基因已經(jīng)在模式植物擬南芥中被克隆，并且轉化到植物中提高了轉化植株的冷耐受能力(Jaglo-Ottosen et al 1998 ；Gilmour et al 2000)，其中研究的最為清楚的是以擬南芥的CBFS(CRT-binding factorl)轉錄因子為代表，包括CBFs的上下游發(fā)揮功能的各個基因所介導的冷信號通路；但是除了 CBFs轉錄因子介導的冷信號通路外，其他獨立于CBFs轉錄因子之外的冷信號通路的研究也取了一些進展(Zhu et al 2004 ；Xin et al 2007 ；Zhu et al 2008)；另外利用擬南芥同源克隆在農(nóng)作物中克隆出大量基因，以及在作物中克隆的一些冷相關基因(Worrall D et all998 ；Fan Y et al 2002 ；Guo et al 2007)轉化農(nóng)作物均提高其冷耐受能力，這些進展不僅豐富了植物冷信號通路，而且為農(nóng)作物育種提供思路，使得植物抗冷機制方面的研究深入到分子水平， 并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，達到用生物技術來探索和改進植物生長特性，提高植物對低溫適應能力的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐低溫蛋白TCFl及編碼基因和相關轉基因應用。本發(fā)明提供的蛋白質，來源于模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)，命名為 TCFl，為一種人類 RCCl (Regulator of chromosome condensation 1)蛋白的同源蛋白。 TCFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。序列1中TCFl蛋白質由488個氨基酸殘基組成，含有6個RCCl重復結構域，人類的RCC1(NP_00U60)蛋白含有7個RCCl重復結構域，TCFl蛋白與RCCl蛋白具有類似的功能結構域分布(圖1)。將TCFl蛋白質序列在Genabnk上進行比對，發(fā)現(xiàn)TCFl蛋白與植物物種同源蛋白序列具有較高一致性，如與葡萄有67%的一致性，與蓖麻有68%的一致性， 與水稻有61%的一致性，與高粱有63%的一致性，與楊樹有57%的一致性，與小立碗蘚有 52 %的一致性，而與人類RCCl蛋自僅有37 %的一致性。為了使TCFl蛋白便于純化與檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
標簽’殘基序列GST231MSP1LGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDE GDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYI ADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYS KDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHV THPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIE AIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDL EVLFQGPLGSC-myc10EQKLISEEDL編碼所述蛋白的基因TCFl也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述TCFl基因可為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5，端第67至1527位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子。序列2中的cDNA序列由1723個核苷酸組成，開放閱讀框架為自5'端第67-1527
位核苷酸。含有所述基因的重組表達載體、重組菌和轉基因植株均屬于本發(fā)明的保護范圍， 序列表中序列3為所述基因的啟動子序列，亦為本發(fā)明的保護范圍。
可用現(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述基因及含啟動子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物基因槍轉化法所用的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端， 如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時， 在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如煙草花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻澤。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因 (⑶S基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等) 或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選桿性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體具體可為 pCAMBIA 1300-35S-TCF1，pEZR (K) LC-35S-GFP-TCFl， pEZR (K) LC-Ptcfi-GFP-TCFI 和 pCAMBIA1391_PTCF1-⑶S，所用載體為 pCAMBIA1300 和 pEZR(K) LC (Brown et al2005)。所述 pCAMBIA1300_35S_TCFl 為將所述基因插入 pCAMBIA1300 的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表中序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1300的限制性內(nèi)切酶KpnI和Mil酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述pES (K)LC-35S-GFP-TCFl為將所述基因插入pES (K)LC的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pES (K)LC的限制性內(nèi)切酶EcoRI和MlI酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述 pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI 是以 pEZR(K)LC-35S-GFP-TCFl 載體為基礎，將 TCFl 基因自身啟動子片段(序列3)取代35S啟動子獲得的重組質粒，優(yōu)選為將序列表中序列3所示的DNA 片段插入到pES (K)LC-35S-GFP-TCFl載體的限制性內(nèi)切酶HindIII和McI切識別位點之間得到的重組質粒；pCAMBIA1391-PTeF1-GUS是將TCFl基因自身啟動子片段(序列3)克隆到雙元載體PCAMBIA1391上而獲得的重組載體。本發(fā)明還保護一種培育耐寒性轉基因植物的方法，是將所述TCFl基因導入目的植物中，得到耐寒性高于野生型的轉基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達載體 PCAMBIA1300-35S-TCF1導入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti 質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物，如水稻等；也可以是雙子葉植物，如擬南芥 (如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)等。所述耐逆性具體為耐寒(抗寒)。擴增所述基因或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的TCFl基因受低溫脅迫特異誘導表達；TCFl蛋白定位到細胞核上，是人類 RCCl蛋白的同源蛋白，但TCFl與人類RCCl作用機制不同。TCFl能夠與組蛋白結合且與組蛋白H4結合緊密。本發(fā)明的TCFl基因缺失和過表達TCFl基因可以提高植物的耐寒性，將在培育抗寒性的植物育種中發(fā)揮重要的作用。


圖1為擬南芥TCFl蛋白與人類RCCl蛋白功能結構域分析結果。圖中綠色圓球所示為RCCl repeats結構域。圖2為Col-O中TCFl基因在受低溫，ABA，NaCl,Mannital脅迫下的半定量PCR圖譜。A 圖為 Col-O 在 4°C 處理 0h，3h，6h，12h, 24h, 48h, Oday, lday, 3day, 5day, 7day 結果。 B圖為7天后取整株苗放在含有以下物質的培養(yǎng)基上進行脅迫處理ABA 100 μ M 5h，NaCl 300mM 3h，Mannital 400mM3h，整個處理過程在培養(yǎng)室(22°C )內(nèi)進行。圖3為tcf 1-1突變體在受低溫，ABA, NaCl，Mannital脅迫下，TCFl基因的表達情況。生長7天的tcf 1-1突變體分別受到以下非生物脅迫處理4°C處理0h，6h，12h和Mh ； 100 μ M ABA 5h ；400mMMannital 3h ；300mMNaCl 3h。圖4為TCFl基因在tcf 1+TCF1轉基因植株中的表達情況。tcf 1-1+TCF1代表在 tcfl-Ι內(nèi)過表達TCFl基因，Vector+tcfl-Ι代表在tcfl_l內(nèi)轉入空載體pEZR(K)-LC。圖5為tcfl-Ι突變體受低溫脅迫處理后表現(xiàn)出冷耐受能力。移土 3周的幼苗直接放在冷凍箱進行冷處理，左邊為表型處理結果，右邊為1周后的存活率統(tǒng)計數(shù)據(jù)。圖6為tcfl-Ι突變體受低溫脅迫處理后表現(xiàn)出冷耐受能力。移土 3周的幼苗首先放在4°C冰箱進行冷馴化7天，然后進行冷凍處理。左邊為表型處理結果，右邊為1周后的存活率統(tǒng)計數(shù)據(jù)。圖7為TCFl基因過表達轉基因植株TCFlOX受低溫脅迫處理后表現(xiàn)出冷耐受能力。A為移土 3周的苗在-10°c處理濁表型結果。NA(-10°C，2h)表示未冷馴化，CA(_10°C， 2h)表示4°C冷馴化7day ；B為RT-PCR鑒定TCFl基因在各個轉基因植株中的表達情況，C 為處理后一周統(tǒng)計的存活率情況。圖8為GFP-TCFl融合蛋白在擬南芥葉子表皮細胞中的核定位。A和C顯示GFP空載體對照，B和D為TCFl定位于細胞核中，其中A，B為暗視野，C，D為明視野。圖9為TCFl蛋白GEF活性檢測。RCCl有20% GEF活性，TCFl有5% GEF活性。圖10為TCFl蛋白能與組蛋白相互結合。泳道1是蛋白質未加入組蛋白磁珠的量， 來表明上樣量一致性，泳道2是經(jīng)過組蛋白磁珠結合后剩下的上清液，泳道3是結合到組蛋白磁珠上的蛋白質。圖11為TCFl蛋白與組蛋白H3，H4結合緊密。None表示PCR管中沒加4種組蛋白的樣品，All表示PCR管中加入4種組蛋白的樣品，其余表示PCR管中加入各種單一組蛋白。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、TCFl基因的表達特性及TCFl基因的克隆一、TCFl基因在逆境下的表達特性分析取室溫生長12d左右的擬南芥Col-O幼苗進行以下脅迫處理(1)低溫處理將擬南芥Col-O幼苗置于4°C培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)O小時、1小時、3小時、6小時、12小時、24小時后取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?2)脫落酸處理將擬南芥Col-O幼苗置于100 μ M的脫落酸(ABA)溶液中，光照培養(yǎng)3小時后取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?3)鹽漬處理將擬南芥Col-O幼苗置于150mM的NaCl溶液中，光照培養(yǎng)5小時后取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?4) Manital處理將擬南芥Col-O幼苗置于300mM的Mannitol溶液中，光照培養(yǎng) 5小時后取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆?。二、組織表達特異性(I)RT-PCR方法取常溫和4°C處理12h的Col-O組織R，根；Sh，莖；L,葉；F，花；
Si，果莢，用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?2)⑶S染色方法將TCFl基因啟動子(序列3)克隆到雙元載體pCAMBIA1391， 獲得重組載體pCAMBIA1391-PTCF1-GUS。將重組載體采用蘸花法轉化到野生型Col-O中。后代分離出的純和轉基因植株在4°C冷處理1 和未經(jīng)冷處理情況下進行GUS染色，觀察其 TCFl基因組織表達特異性。 三、mRNA的提取及RNA反轉錄采用Trizol法(TianGen)提取擬南芥總RNA ；將提取的mRNA用ftx)mege公司反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。四、RT-PCR結果分析將Col-O的cDNA用作半定量RT-PCR的模板。用TCFl基因全長引物對對樣品進行擴增，分析基因對各種脅迫處理的應答情況及各組織中表達情況，以UBQ5做內(nèi)參。PCR產(chǎn)物進行1. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。五、TCFl基因全長序列的獲得通過RT-PCR方法，用高保真酶擴增獲得TCFl基因全長序列，獲得的PCR產(chǎn)物連接到T載體上測序。實施例2、TCF1基因缺失突變體tcf 1-1和過表達TCFl轉基因植株TCFlOX均提高耐寒性一、tcf 1-1和TCFlOX轉基因植株獲得ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) ^ SAIL Linesft^ii 行純雜合鑒定，獲得TCFl基因插入的純合突變體tcfl-Ι。半定量RT-PCR結果顯示tcf 1_1 是TCFl基因的無義突變體(圖幻；將pCAMBIA1300-35S-TCFl載體采用擬南芥蘸花轉化法到Col-O中分離得到純和的轉基因植株，RT-PCR結果顯示TCFl基因在TCFlOX中過量表達 (圖 4)。
二、tcfl-Ι和TCFlOX轉基因植株均表現(xiàn)出抗寒能力在未冷馴化的情況下的進行冷處理，tcfl-Ι在_6°C，_8°C和-10°C冰凍處理2h后的存活率分別是91.3%，52. 2%和17.4%，而Col-O (WT)在相應處理溫度下的存活率則分別是78. 3%，34. 8%和O (圖5)，說明在沒有經(jīng)過冷馴化處理的情況下，tcfl-Ι比WT對冷表現(xiàn)出更高的耐受性；當突變體和野生型都同時放到4°C處理7天后，在進行相同冰凍處理， tcfl-Ι在-6°C，_8°C和_10°C的存活率分別是100%，82. 6%和65. 2%，而WT在相應處理溫度的的存活率則分別是82. 6%，47. 8%和17. 4% (圖6)；結果說明不論在冷馴化或未冷馴化情況下都表現(xiàn)出比野生型更強的冷耐受能力。將TCFlOX轉基因植株進行-10°C，2h的冰凍處理，結果發(fā)現(xiàn)，不論是否經(jīng)過冷馴化或未經(jīng)冷馴化處理，其過表達植株的耐冷性都要比野生型Col-O強，在未冷馴化情況下， TCFl-OX轉基因植株顯示42. 2%的存活率，切打-1只有18.4%存活率，Col-O全部死亡， 經(jīng)過冷馴化后，TCFl-OX顯示82. 2%的存活率，tcfl-Ι顯示61. 6%的存活率，Col-O只有 17. 9%的存活率(圖7)，這些結果說明不論是否經(jīng)過冷馴化，過表達TCFl基因能夠提高轉基因植株對冷的耐受能力。實施例3、TCFl蛋白生化特性分析一、TCFl蛋白亞細胞定位分析將培養(yǎng)皿里生長12天的苗(冷馴化或未冷馴化的轉基因純合植株)葉片剪下，放到一次性針筒里(不帶針頭)，將葉片與水混合，然后用手堵住針頭，抽拉幾次，使葉片變得半透明，將帶有氣孔的一面朝上放在載玻片上，加上一滴水，蓋上蓋玻片，倒放到Confocal 顯微鏡載物臺上，調動明視野，然后激光掃描，激發(fā)光為488nm ；鏡檢同上。結果顯示TCFl蛋白是核定位(圖8)。二、鳥苷酸交換因子活性(GEF Activities)分析檢測TCFl蛋白是否具有人類RCCl蛋白所具有的GEF活性。( 一)GST-TCFl 蛋白質獲得(1)質粒構建與轉化將TCFl基因構建到pGEX-4T-l載體上，獲得重組質粒GST-TCFl，將重組質粒轉化到表達菌BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞中(Novagen公司，CAS :69451-4)。(2) GST融合蛋白表達純化方法如下①接單克隆菌落于5ml LB液體中，37°C培養(yǎng)過夜。②第二天，以1 100的接菌量將過夜菌轉接到新鮮LB培養(yǎng)基上(Amp+終濃度為 60 μ g/L)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)2 3h，待OD = 0. 6時，加入終濃度為ImM的IPTG，25°C，200r/ min,培養(yǎng)1 (TCF1為毒性蛋白，低溫長時間誘導以獲得最大的表達量)。③5，000r/min，4°C離心收集菌體。④用IXPBS重懸(每IOOml原始菌液用IOml PBS重懸)，然后在液壓機上高壓 3-5次以破碎細胞，將細胞壓碎成混泥漿水樣，無粘稠感，冰上放置準備蛋白純化填料。⑤親和層析柱的制備取存放谷胱甘肽瓊脂糖的瓶子顛倒數(shù)次，使其混勻，取 600 μ 1混合液加入一個層析柱中(BiO-Rad公司)，使瓊脂糖在柱中自然沉降，加Iml PBS 清洗柱子，重復3次，最后一次時，待管中PBS液面剛好沒過凝膠時，套上滴口的套子，待用。⑥將4步驟中的菌體裂解液IOml輕輕加到層析柱上方，室溫下使菌液自然流過層析柱。⑦保留0. 5ml過濾液做PAGE電泳檢測用。⑧配制IOX還原型谷胱甘肽洗脫液(lg glutathione溶于 32. 5ml 10 X Glutathione Reconstitution Buffer 中)。用 IX 洗脫液洗脫 GST 融合蛋白， 每管0. 5ml接收洗脫液。⑨用Bio-Rad蛋白定量試劑盒測各管洗脫液蛋白濃度。首先做標準曲線:4ml Bradland和16ml H2O混勻，分裝6個1. 5ml試管，每管Iml, 取 BSA(lmg/ml)，每管分別加入 BSA O μ 1，2 μ 1，4 μ 1，6 μ 1，8 μ 1 和 10μ 1，測 OD = 280 的吸光值，根據(jù)方程1 = kx求得k值，即試驗中標準曲線斜率。其中y ( μ g/ μ 1)表示BSA的濃度，χ表示測得OD數(shù)值。然后將GST和GST-TCFl各稀釋50倍，取Ιμ 加入到Iml Bradland測定液中， 測的0擬80的吸光值，代入方程求得濃度y，從而計算得到純化的蛋白濃度y(需在擴大50倍)。⑩SDS-PAGE電泳檢測純度。(二)鳥苷酸交換因子活性(GEF)分析(Nemergut et at2002)①將表達純化的重組蛋白GST-Ran與氚標記的[3H]⑶P和[3H] GTP混合，冰上孵育在MOPS緩沖液(25mM MOPS (pH 7. 1)和ImM EDTA)中20min。體系如下1 μ 1 GST-Ran (0. 7 μ g/μ L)，7 μ 1 4XM0PS-EDTA(100mM M0PS+4mM EDTA)，2 μ 1 [3H]GDP ;②加入IOmM MgCl2 (1. 3 μ 1)來終止反應；③30°C，加入 GST-RCCl，在 Exchange Buffer 里孵育 3min ；體系如下:10μ 1 [3Η] 標記好的 GST-RAN (步驟 1)，10 X ExchangeBuffer 3 μ 1，GST-RCC15 μ g, lmMGTP4 μ 1，力口 H2O 至 30 μ 1 ；④反應液里放入nitrocellulose filters，抽真空以停止交換反應；⑤用冰預冷的Wash Buffer洗3遍， )|f nitrocellulose filters ^( scintillation counter方j(身寸個生，$ 換率k。ff (即放射量的衰減)可以用如下公式算出ln(Ct/C0) =_1^#，其中{為反應時間 3min ；Exange Buffer :25mM MOPS (pH 7. 1)，7· 5mM MgCl2,0. 6mM NaH2PO4,0. 5mg/ml BSA, ImM GTP or GDP ;Wash Buffer :7. 5mM NaH2PO4 (pH 6. 8), 7. 5mM Na2HPO4 (pH 6. 8), IOmM MgCl2, ImM ATP。結果顯示TCFl蛋白與RCCl蛋白相比有微弱GEF活性(圖9)，說明TCFl蛋白與 RCCl蛋白作用機制不同。(三)組蛋白結合實驗檢測TCFl蛋白是否具有人類RCCl蛋白所具有的與組蛋白結合的能力。①誘導表達純化GST-TCFl蛋白質。②利用Bradland(Bi0-Rad)試劑盒測定純化得到的GST-TCF1和GST蛋白質濃度。③0. 2ml小牛胸腺組蛋白珠子(Sigma)用平衡緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5 ； 2mM EDTA ；0. 1% NonidetP-40 ；10% glycerol ；0. 05M NaCl)平衡 3 次。④將相同量的純化蛋白2 μ g(用200 μ 1平衡緩沖液稀釋)分別加入到0. 2ml小牛胸腺組蛋白珠子(histone-agarose columns)中，室溫孵育5min，自然流過柱床，收集流過的液體作為未結合的上清液，再加入5倍柱床體積平衡緩沖液洗3遍。⑤加入終濃度為0. 3M NaCl (用平衡緩沖液配制)0. 2ml洗脫。⑥取等量將未結合上清和⑤中洗脫的蛋白跑SDS-PAGE和Wfestern blot檢測，抗體 anti-GST antibody (GEHealthcare，27-4577-01)。BCIP/NBT Kit Qnvitrogen)作為檢測試劑盒。結果顯示GST-TCFl蛋白與組蛋白相互結合，而GST單獨不與組蛋白結合(圖10)。(四)組蛋白競爭試驗檢測TCFl蛋白是否具有人類RCCl蛋白所具有的與某種特異組蛋白結合的偏好性。①將TCFl基因克隆到PGBK-T7的EcoRI/&ilI位點上。②用 TnT —coupled wheat-germ extract system(L4330, Promega)體夕卜表達 Cmyc-TCFl蛋白，體系如下TNT wheat Germ Extract25 μ 1
TNT Reaction Buffer2μ 1
T7RNA Polymerase(T7)1 μ 1
Amino Acid Mixture (ImM)2μ 1
Rnasin Ribonuclease Inibitor (40U/μ 1)1 μ 1
DNA template(0. 5 μ g/μ 1)10 μ 1
Nuclease-Free Water 補至50 μ 1
37°C孵育1. 5h，可得Myc-TCFl蛋白。
③取6個PCR小管，每管加入3 μ 1②中的反應液，做上如下標記None，H2A H2B，
H3，H4，All。6個PCR小管依次加入下列組蛋白0yg(20y 1 PBS作為負對照)，200 μ g histone H2A (1073826, Roche), H2B (1073818, Roche), H3 (11036289, Roche), H4 (516767, Roche)，50 μ g4種組蛋白混合物，這些組蛋白都溶解在20 μ 1的PBS中(含0. 1 % (ν/ν) Nonidet-P40)，然后再加入 50 μ 1 的 PBS (含 0. 1 % (v/v) Nonidet_P40)，室溫 Ih 混勻。④取50 μ 1(10 μ g)的 histone-agarose (18008540530,MPBI0)，與③相同的編號， 用3倍體積柱床平衡3次。⑤將③中的PCR小管對應加到④中的PCR管中，4°C過夜孵育。⑥用3倍柱床體積PBS (含0. 1 % (v/v) Nonidet-P40)，室溫洗3次，每次5min。⑦ 在每管 histone-agarose 中加入 Loading Buffer，跑 10% SDS-PAGE 膠，然后 1Western blot 檢測，抗體用 anti-c-myc antibody (11667149001, Roche，1/1，000)。結果顯示 TCFl 與組蛋白H3和H4結合緊密(圖11)。
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因，優(yōu)選為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第67至1527位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。
3.含有權利要求2所述基因的重組表達載體、表達盒、重組菌和轉基因植株。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體具體可為 pCAMBIA1300-35S-TCFl, pEZR (K) LC-35S-GFP-TCF1，pEZR(K) LC-Ptcfi-GFP-TCFI 禾口 pCAMBIA1391-PTeF「⑶S ；所用載體為PCAMBIA1300和pEZR(K)LC，所述pCAMBIA1300_35S_TCFl為將所述基因插入PCAMBIA1300的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表中序列2自5'端第 67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1300的限制性內(nèi)切酶KpnI和Mil酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述pES (K)LC-35S-GFP-TCFl為將所述基因插入pES (K)LC 的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DNA片段插入pES (K)LC的限制性內(nèi)切酶EcoRI和Mil酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述 pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI 是以 pEZR(K)LC-35S-GFP-TCF1 載體為基礎，將 TCFl 基因自身啟動子片段(序列幻取代35S啟動子獲得的重組質粒，優(yōu)選為將序列表中序列3 所示的DNA片段插入到pES (K) LC-35S-GFP-TCF1載體的限制性內(nèi)切酶HindIII和^icI切識別位點之間得到的重組質粒；pCAMBIA1391-PTm-GUS是將TCFl基因自身啟動子片段(序列3)克隆到雙元載體pCAMBIA1391上而獲得的重組載體。
5.一種培育耐寒性轉基因植物的方法，是將權利要求2所述基因通過權利要求3或4 所述重組表達載體導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的材料的轉基因植株。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于權利要求2所述基因通過權利要求3或4所述重組表達載體導入所述目的植物。
7.如權利要求5和6所述，其特征在于所述耐逆性為耐寒。
8.如權利要求5和6所述的材料，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；所述方法為將權利要求2所述基因通過所述35S-TCF1導入所述目的植物中。
9.擴增權利要求2所述基因或其任意片段的引物對。
10.擴增權利要求2所述基因的啟動子序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐低溫相關蛋白TCF1及其編碼基因和應用。本發(fā)明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發(fā)明的TCF1基因特異受冷誘導表達，編碼的蛋白定位到細胞核上，并且可以的與組蛋白特異結合，從而調控其下游基因的轉錄表達。本發(fā)明的TCF1基因缺失和過表達TCF1基因均可以提高植物的耐低溫性，為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號C12N15/82GK102153636SQ201010585989
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權日2010年12月14日
發(fā)明者李霞, 王幼寧, 紀洪濤 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所