專(zhuān)利名稱(chēng)：與植物株型相關(guān)蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物株型相關(guān)蛋白及其編碼基因。
背景技術(shù)：
株型(plant type)，是指與作物品種產(chǎn)量能力有關(guān)的一組特征或植物體在空間的排列方式，即長(zhǎng)勢(shì)長(zhǎng)相。理想株型(Ideal plant type)亦稱(chēng)為理想型(Ideotype)，指由有利植株光合作用、生長(zhǎng)發(fā)育和籽粒產(chǎn)量的性狀所組成的理想化株型，它能最大限度地提高群體光能利用率，增加生物學(xué)產(chǎn)量和提高經(jīng)濟(jì)系數(shù)等。有關(guān)水稻株型的研究，20世紀(jì)50年代末期，日本科學(xué)家角田重三郎從他對(duì)水稻、大豆、甘蔗等的研究實(shí)踐中總結(jié)出適于多肥集約栽培的品種應(yīng)具有厚、小、直立且深綠色的葉片，短而堅(jiān)韌的莖稈以及中等分蘗力的理想株型理論(角田重三郎.農(nóng)業(yè)及園藝.1987，62(1) :25 四.)。不斷改良株型也是我國(guó)水稻超高產(chǎn)育種的基本經(jīng)驗(yàn)。從農(nóng)家品種的高稈披葉型逐步改良為矮稈直葉型，從注重形態(tài)改良逐漸發(fā)展到形態(tài)和機(jī)能改良并重，不但改善了光能利用效率，增加了抗倒伏能力，還增強(qiáng)了水稻的生理功能。水稻葉片性狀是株型構(gòu)成的重要因素，直接關(guān)系到葉片的光合面積和光能利用率，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生重要影響，因此對(duì)葉型的研究是育種家、遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家共同關(guān)注的焦點(diǎn)之一，而葉片的寬度和卷曲情況是其中的重要組成部分。研究表明，水稻窄葉和卷葉性狀主要受質(zhì)量性狀基因控制。目前報(bào)道的窄葉及卷葉突變體多作為經(jīng)典的形態(tài)標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物株型相關(guān)和/或與產(chǎn)量相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是SEQ ID NO :1中自5'末端第140-1066位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQ ID NO 1所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLI SEEDL上述(a)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(a)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將SEQ ID NO :1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3' 端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)中的一條引物序列如SEQ ID NO 3所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將所述編碼基因插入載體pCAMBIA2300-Actin的多克隆位點(diǎn)得到的。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等均具有類(lèi)似功能。攜帶有本發(fā)明基因的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。上述任一所述編碼基因在改變植物株型和/或改變產(chǎn)量表型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白在改變植物株型和/或改變產(chǎn)量表型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種改變植物株型和/或產(chǎn)量表型的方法。本發(fā)明所提供的改變植物株型和/或產(chǎn)量表型的方法，為如下1)或2)
1)是向出發(fā)植物中導(dǎo)入上述任一所述編碼基因，得到與出發(fā)植物相比株型改變的目的植物；2)是向出發(fā)植物中導(dǎo)入上述任一所述編碼基因，得到與出發(fā)植物相比產(chǎn)量表型改變的目的植物。上述方法中，所述編碼基因是通過(guò)上述任一所述重組載體導(dǎo)入的。上述任一所述應(yīng)用和任一所述改變植物株型的方法中，所述株型為植株主莖高、 植株葉片寬或植株葉片長(zhǎng)；所述產(chǎn)量表型為植株主穗長(zhǎng)或植株主穗粒數(shù)；所述株型改變?yōu)槟康闹参锏闹仓曛髑o高小于所述出發(fā)植物、目的植物的植株葉片寬小于所述出發(fā)植物、和/或目的植物的植株葉片長(zhǎng)小于所述出發(fā)植物；所述產(chǎn)量表型改變?yōu)槟康闹参锏闹仓曛魉腴L(zhǎng)小于所述出發(fā)植物和/或目的植物的植株主穗粒數(shù)少于所述出發(fā)植物。上述任一所述應(yīng)用和任一所述改變植物株型的方法中，所述出發(fā)植物為單子葉植物；所述單子葉植物為水稻；所述水稻為水稻突變體nail。實(shí)驗(yàn)證明，向水稻突變體nail中導(dǎo)入本發(fā)明基因后，得到的轉(zhuǎn)基因植株的株型明顯改變，具體表現(xiàn)在植株葉片寬小于突變體nail、植株葉片長(zhǎng)小于突變體nail、植株主莖高小于突變體nail、植株主穗長(zhǎng)小于突變體nail、植株主穗粒數(shù)少于突變體nail。如果將該基因敲除則導(dǎo)致產(chǎn)量的增加。本發(fā)明基因在植物的遺傳育種領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1為轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照植株的表型。圖2為轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照植株的主穗表型。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、基因的制備與功能驗(yàn)證野生型水稻浙輻802(zf8(^)在文獻(xiàn)(鄭雷英，朱旭東，錢(qián)前，趙忠，張建軍，胡筱荷，林鴻宣，羅達(dá).2003.水稻穗部突變體Cl的形態(tài)和定位分析.科學(xué)通報(bào)第48卷第3期) 中公開(kāi)過(guò)(由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供)。pMD19-T載體購(gòu)自takara，產(chǎn)品目錄號(hào)為D102A。載體 pCAMBIA2300-Actin 在文獻(xiàn)(Kejian Wang, Ding Tang, Lilan Hong, WenyingXu, Jian Huang, Ming Li, Minghong Gu, Yongbiao Xue, Zhukuan Cheng. 2010. DEPandAFORegu 1 ate Reproductive Habit in Rice. January 2010. Volume 6.)中公開(kāi)過(guò)。 (由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供)。根癌農(nóng)桿菌EH105在文獻(xiàn)(趙志強(qiáng)，傅亞萍，楊鵑，張玉滿，顏永勝，方榮祥，孫宗修，陳曉英.2008.水稻小G蛋白Osl^ra〗基因的克隆及功能分析.Chin J Biotech2008, December 25 ；24(12) :2027-2033中公開(kāi)過(guò)(由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供)。水禾§突變體 nail (Dong Fenggao, Xiong Zhenmin，Qian Qian，Zu Xudong，Chen
5Shihua(1994). Breeding Near-isogenic lines ofmorphological markers in indica rice. Chinese J. Rice Sci. 8，135-139。(由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供)。一、基因制備人工合成SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位堿基所示的DNA，也可按照如下方法制備SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位堿基所示的DNA。SEQ ID NO :1中自 5，端起第140-1066位堿基所示的DNA編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。提取野生型水稻浙輻802 (zf802)的總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用如下引物 P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Pl :5，-ATGGACTCCCCGTCGCCTAT(正向引物)(SEQ ID NO 3)；P2 :5，-CTAGAGGCTCAAGTTGAGGT(反向引物)(SEQ ID NO 4)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的DNA片段，與pMD_19T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，挑取單克??；將單克隆分別進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果，PMD-19T載體中插入的基因序列如SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位堿基所示，表明構(gòu)建的重組載體正確，將其命名為pMD-19T-SUNl。二、基因轉(zhuǎn)化突變體nail1、重組表達(dá)載體構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶)(ba I和Ml I酶切PMD-19T-SUN1，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶)(ba I和Ml I酶切載體pCAMBIA2300-Actin，回收載體大片段；目的基因片段與載體大片段連接，得到重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，挑取單克隆；將單克隆分別進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果，pCAMBIA2300-Actin載體的)(ba I和Ml I酶切位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO :1中自5，端起第140-1066位堿基所示，表明構(gòu)建的重組載體正確，將其命名為pActin: :SUN1。2、重組農(nóng)桿菌構(gòu)建用熱擊法將重組表達(dá)載體pActin: SUNl轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，篩選陽(yáng)性重組子，得到含有重組表達(dá)載體pActin: SUNl的根癌農(nóng)桿菌EH105，記作EH105_pActin: SUNl。3、轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化法將pActin: SUNl轉(zhuǎn)化水稻突變體nall，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定所用引物為上述P1/P2，結(jié)果得到10株陽(yáng)性植株，均為T(mén)O 代植株；將轉(zhuǎn)入基因SUNl的植株記作轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA2300_Actin的水稻突變體nall作為對(duì)照，以未進(jìn)行任何處理的野生型水稻突變體nall作對(duì)照。4、轉(zhuǎn)基因植株的表型分析觀察統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株、對(duì)照植株的表型。再對(duì)植株的主莖高度、主穗長(zhǎng)度、主穗粒數(shù)、葉片寬、葉片長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的表型如圖1和圖2所示。A為野生型水稻突變體nall， B為轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的株型改變，具體如下主莖高度變矮、葉片明顯變窄、葉片長(zhǎng)度明顯變?。晦D(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量表型改變，具體如下主穗長(zhǎng)度變小、主穗粒數(shù)變少。野生型水稻突變體nall與轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA2300-ACtin的水稻突變體nall的株型相同。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物株型相關(guān)和/或與產(chǎn)量相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)、 2),3)或4)的基因1)其核苷酸序列是SEQID NO :1中自5'末端第140-1066位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQID NO 1所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2、限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)；或，所述引物對(duì)中的一條引物序列如SEQ ID NO 3所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。
5.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒； 或，所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述編碼基因插入載體pCAMBIA2300-Actin的多克隆位點(diǎn)得到的。
6.權(quán)利要求2或3所述編碼基因在改變植物株型和/或改變產(chǎn)量表型中的應(yīng)用，或權(quán)利要求1所述蛋白在改變植物株型和/或改變產(chǎn)量表型中的應(yīng)用。
7.一種改變植物株型和/或產(chǎn)量表型的方法，為如下1)或2)1)是向出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述編碼基因，得到與出發(fā)植物相比株型改變的目的植物；2)是向出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述編碼基因，得到與出發(fā)植物相比產(chǎn)量表型改變的目的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求2或3所述編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求5中所述重組載體導(dǎo)入的。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述株型為植株主莖高、植株葉片寬或植株葉片長(zhǎng)；所述產(chǎn)量表型為植株主穗長(zhǎng)或植株主穗粒數(shù)；所述株型改變?yōu)槟康闹参锏闹仓曛髑o高小于所述出發(fā)植物、目的植物的植株葉片寬小于所述出發(fā)植物、和/或目的植物的植株葉片長(zhǎng)小于所述出發(fā)植物；所述產(chǎn)量表型改變?yōu)槟康闹参锏闹仓曛魉腴L(zhǎng)小于所述出發(fā)植物和/或目的植物的植株主穗粒數(shù)少于所述出發(fā)植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述出發(fā)植物為單子葉植物；所述單子葉植物為水稻；所述水稻為水稻突變體nail。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了與植物株型相關(guān)蛋白及其編碼基因。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物株型相關(guān)和/或與產(chǎn)量相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，向水稻突變體nall中導(dǎo)入本發(fā)明基因后，得到的轉(zhuǎn)基因植株的株型明顯改變，具體表現(xiàn)在植株主莖高小于突變體nall、植株主穗長(zhǎng)小于突變體nall、植株主穗粒數(shù)少于突變體nall、植株葉片寬小于突變體nall、植株葉片長(zhǎng)小于突變體nall。本發(fā)明基因在植物的遺傳育種領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102234330SQ201010168639
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者劉小強(qiáng), 孫加強(qiáng), 李傳友, 李淑鈺, 王保, 蔣紅玲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所