專利名稱：一種植物中總核酸的同步提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物中總核酸的同步提取方法，具體涉及一 種從煙草葉片中同步提取基因組DNA和總RNA的方法。
背景技術(shù)：
基因組DNA以及總RNA提取的質(zhì)量，在植物分子生物學(xué)研究中具有重要的作用， 關(guān)系到后續(xù)分子生物學(xué)研究的成功與否，如基因的克隆、基因上游啟動(dòng)子序列的分離、 southern印跡分析、表達(dá)特性的研究等。煙草葉片中的蛋白質(zhì)、糖類、色素、煙堿、酚類等 物質(zhì)含量較高，在基因組DNA和總RNA的提取過程中，這類物質(zhì)常與核酸形成復(fù)合物，使核 酸在這種粘稠的膠狀物中難以溶解且產(chǎn)生程度不同的褐變，并且這些物質(zhì)容易與核酸共沉 淀，使提取的核酸中含有蛋白和多糖類物質(zhì)，對(duì)后續(xù)研究造成干擾。目前，關(guān)于植物基因組 DNA的提取方法主要有試劑盒法和CTAB法，總RNA提取的方法有商業(yè)試劑盒、Trizol法、 CTAB法、SDS法和熱硼酸鹽法等。雖然植物基因組DNA和總RNA提取的技術(shù)已經(jīng)非常的成 熟，但是大多都只是在植物中分別進(jìn)行提取這兩種核酸，對(duì)于從植物中同步提取DNA和RNA 較少，并且采用的都是兩步沉淀法，先沉淀RNA后，再沉淀DNA，耗時(shí)較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種植物中總核酸的同步提取方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種植物中基因組DNA的提取方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種植物中總RNA的提取方法。一種植物中總核酸的同步提取方法，將生物材料粉碎后與2% CTAB裂解液混合， 65°C水浴45-60min，加入與所述的2% CTAB裂解液等體積的由氯仿和異戊醇組成的混合試 劑，上下顛倒混勻；離心，取上清，加入與上清液等體積的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的 混合試劑，上下顛倒混勻；離心，取上清，加入1/30上清液體積的NaAc和1/10上清液體積 的無水乙醇，上下顛倒混勻，在冰上靜置5min后，再加入與上清液等體積的由氯仿和異戊 醇組成的混合試劑；離心，取上清，加入1/10上清液體積的NaAc和兩倍上清液體積的無水 乙醇，-20°C靜置Ih ；離心，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀1 5次，室溫干燥，得到包含基 因組DNA和總RNA的總核酸。其中，所述的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選 M 1。所述的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿及異戊醇的 體積比為20 沘20 沘1，優(yōu)選25 24 1。所述的生物材料粉碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末，所述的離心條件為 8000 12000rpm,8 15 分鐘。所述的植物優(yōu)選果樹或煙草，進(jìn)一步優(yōu)選煙草。
一種植物中基因組DNA的提取方法，包括如下步驟(1)按照上述植物中總核酸的同步提取方法提取植物中的總核酸；(2)取步驟(1)提取的總核酸，按照常規(guī)方法進(jìn)行RNA的消化，得到所述的基因組 DNA。其中，所述的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選M 1 ；所述的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿 及異戊醇的體積比為20 沘20 沘1，優(yōu)選25 24 1。所述的生物材料粉碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末，所述的離心條件為 8000 12000rpm，8 15 分鐘。所述的常規(guī)消化RNA的方法優(yōu)選佟兆國(guó)，王富榮，章鎮(zhèn)，等.一種從果樹成熟葉片 提取DNA的方法[J],果樹學(xué)報(bào)，2008，25(1) :122 125。一種植物中總RNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)按照上述植物中總核酸的同步提取方法提取植物中的總核酸；(2)取步驟(1)提取的總核酸，按照常規(guī)方法進(jìn)行DNA的消化，得到所述的總RNA。其中，所述的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選M 1 ；所述的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿 及異戊醇的體積比為20 沘20 沘1，優(yōu)選25 24 1。所述的生物材料粉碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末，所述的離心條件為 8000 12000rpm，8 15 分鐘。本發(fā)明核酸同步提取方法的原理如下在提取植物DNA時(shí)，用的較多的是Tris平衡酚(pH > 7. 8)，提取RNA時(shí)，用的較多 的是水飽和酚(pH = 4. 5)，水飽和酚可以溶解DNA，可以使提取的RNA中沒有DNA的污染， 但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，水飽和酚只能去除少量或者很少量的DNA。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)水飽和酚去 除多糖、蛋白、酚類物質(zhì)的效果較好于Tris平衡酚?，F(xiàn)有技術(shù)中常使用LiCl選擇性的沉淀 核酸中的RNA，本發(fā)明選用1/3體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇既可以沉淀DNA，又可以 沉淀RNA。煙草葉片中的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)含量較高，加入1/30體積的NaAc和1/10體積 的無水乙醇可以有效地去除煙草中含有較多的多糖、蛋白類物質(zhì)。另外，在DNA的提取過程 中，不能劇烈震蕩，防止DNA的斷裂，本研究沒有進(jìn)行劇烈的渦旋混勻，而是采取上下顛倒 混勻的方法。有益效果本發(fā)明利用改進(jìn)的CTAB法同步提取煙草葉片總核酸(即基因組DNA和總RNA)，與 傳統(tǒng)的分別提取基因組DNA或總RNA法相比，該方法可以同時(shí)提取基因組DNA和總RNA，不 僅節(jié)約了時(shí)間，而且節(jié)約了成本。該發(fā)明同步提取煙草總核酸(即基因組DNA和總RNA)，對(duì)于今后開展基因克隆、表 達(dá)分析等一系列分子生物學(xué)研究具有非常重要的意義。本發(fā)明首次利用CTAB法同步提取了煙草總核酸(即基因組DNA和總RNA)，提取的 DNA 濃度在 109. 20-245. 46 μ g/ml 之間，0擬60/280 的比值在 1. 83-1. 94 之間。RNA 具有 28S rRNA、18SrRNA 和 5. 8S rRNA 3 條清晰的條帶，且無降解。RNA 濃度在；355. 57-570. 13μ g/ml 之間，0D260/280 在 1. 84-2. 04 之間，0D260/230 在 2. 06-2. 33 之間?；蚪M DNA 和 RNA 的
4質(zhì)量符合后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。


圖1.煙草葉片總核酸提取電泳圖，WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。圖2.煙草葉片消化RAN后的DNA電泳圖，WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。圖3.煙草葉片消化DNA后的總RNA電泳圖，WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。圖4.轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測(cè)，M =DNA Marker ；P 陽性質(zhì)粒；WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。圖 5. Actin 基因的 RT-PCR 擴(kuò)增，M =DNA Marker ；WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。圖6.幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增，M =DNA Marker ；P 陽性質(zhì)粒；WT 非轉(zhuǎn)基因株系；T1-T7 轉(zhuǎn)基因株系。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1)基因組DNA和總RNA的提取本實(shí)施例以轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草為材料，同步、快速、高效的提 取基因組DNA和總RNA。具體方法如下稱取煙草組培苗葉片約0. 3g，于液氮中迅速研 磨成粉末，加入含有ΙΟΟΟμ 1 2% CTAB裂解液的2ml離心管中，65°C水浴45_60min，加入 與2% CTAB裂解液等體積的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑，其中氯仿異戊醇的體積 比為M 1，輕輕上下顛倒混勻；12000r/min離心lOmin，取上清，加入與上清液等體積 的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑，其中水飽和酚氯仿異戊醇的體積比為 25 24 1，輕輕上下顛倒混勻；12000r/min離心lOmin，取上清，加入1/30上清液體積 的NaAc和1/10上清液體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，在冰上靜置5min后，再加入與上 清液等體積的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑，其中氯仿異戊醇的體積比為M 1 ； 12000r/min離心lOmin，取上清，加入1/10上清液體積的NaAc和兩倍上清液體積的無水 乙醇，_20°C靜置Ih ； 12000r/min離心lOmin，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀2次，室溫干 燥，溶于50 μ IDEPC處理的ddH20中。取2 μ 1的總核酸，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢 測(cè)，電壓為150V左右，當(dāng)溴酚蘭到達(dá)膠面1/3時(shí)取出，于紫外成像系統(tǒng)上拍照分析，見圖1。 取上述提取的總核酸20 μ 1進(jìn)行基因組中RNA的消化，具體方法參考佟兆國(guó)等的方法(佟 兆國(guó)，王富榮，章鎮(zhèn)，等.一種從果樹成熟葉片提取DNA的方法[J].果樹學(xué)報(bào)，2008，25(1) 122 125)，將消化后的基因組DNA溶解于20 μ 1的ddH20中。取上述剩余的核酸進(jìn)行總 RNA中DNA的消化，具體方法參考說明書(TaKaRa D2215)進(jìn)行。將消化DNA后的總RNA溶 解于20 μ 1的DEPC處理后ddH20中。2)總核酸的質(zhì)量分析利用本發(fā)明改進(jìn)的CTAB法，從煙草非轉(zhuǎn)基因株系和轉(zhuǎn)基因株系中，同時(shí)分離了基因組DNA和總RNA，結(jié)果如圖1。從電泳結(jié)果可以看出，本發(fā)明改良后的CTAB法提取的總核 酸中，沒有蛋白、多糖等物質(zhì)的污染，并且DNA和RNA條帶清晰、整齊無污染現(xiàn)象。3)基因組DNA的質(zhì)量分析取2μ 1的消化后的基因組DNA，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖2， 消化后的DNA條帶整齊、無降解現(xiàn)象。DNA在Bio-photometer上檢測(cè)濃度，體系為1 μ 1 DNA 樣加入49 μ 1 ddH20，DNA濃度、0擬80/0D260直接從儀器上讀取，通過SPSS軟件進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn) 誤分析(表1)，結(jié)果表明所提取的DNA濃度在109. 20-245. 46 μ g/ml之間，0DA26(V280的 比值在1. 83-1. 94之間，說明提取的DNA質(zhì)量較高。將消化RNA的DNA稀釋10倍后，取1 μ 1 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為:chitFl :GCGGACTAGTAGAAATGAAGTTGC(SEQ ID NO. 1) ；chitRl GGTACCTTAGGCAAAAGGCCTTTGATT (SEQ ID NO. 2)。PCR 反應(yīng)體系為模板 1 μ L, 10 X PCR 緩沖 溶液2. 5 μ L ；MgCl2L 5 μ L ；上下游引物各1 μ L，rTaq酶0. 2 μ L，最后用滅菌的ddH20補(bǔ)足至 25 μ L0 反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，;35 個(gè)循環(huán)；72°C延 伸lOmin。在1. 2% (W/V)的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(圖4)。結(jié)果表明在7株 抗性株系和陽性對(duì)照質(zhì)粒中，成功的檢測(cè)到了約IOOObp的目的條帶，而非轉(zhuǎn)基因株系未能 檢測(cè)出目的條帶。轉(zhuǎn)基因株系的成功檢測(cè)，表明該實(shí)驗(yàn)方法提取的DNA質(zhì)量很好，符合PCR 等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。表1.改良的CTAB法同時(shí)提取的煙草DNA和總RNA的質(zhì)量分析
權(quán)利要求
1.一種植物中總核酸的同步提取方法，其特征在于將生物材料粉碎后與2% CTAB裂解 液混合，65°C水浴45-60min，加入與所述的2% CTAB裂解液等體積的由氯仿和異戊醇組成 的混合試劑，上下顛倒混勻；離心，取上清，加入與上清液等體積的由水飽和酚、氯仿及異戊 醇組成的混合試劑，上下顛倒混勻；離心，取上清，加入1/30上清液體積的NaAc和1/10上 清液體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，在冰上靜置5min后，再加入與上清液等體積的由氯 仿和異戊醇組成的混合試劑；離心，取上清，加入1/10上清液體積的NaAc和兩倍上清液體 積的無水乙醇，_20°C靜置Ih ；離心，棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀1 5次，室溫干燥，得 到包含基因組DNA和總RNA的總核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中總核酸的同步提取方法，其特征在于所述的由氯仿和 異戊醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選M 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中總核酸的同步提取方法，其特征在于所述的由水飽和 酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿及異戊醇的體積比為20 觀20 28 1，優(yōu)選 25 24 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中總核酸的同步提取方法，其特征在于所述的生物材料 粉碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末，所述的離心條件為8000 12000rpm，8 15 分鐘。
5.一種植物中基因組DNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟1)按照權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的方法提取植物中的總核酸；2)取步驟⑴提取的總核酸，按照常規(guī)方法進(jìn)行RNA的消化，得到所述的基因組DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物中基因組DNA的提取方法，其特征在于所述的由氯仿 和異戊醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選M 1;所述的 由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿及異戊醇的體積比為20 28 20 28 1，優(yōu)選 25 24 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物中基因組DNA的提取方法，其特征在于所述的生物材料 粉碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末；所述的離心條件為8000 12000rpm，8 15 分鐘。
8.一種植物中總RNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟1)按照權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的方法提取植物中的總核酸；2)取步驟(1)提取的總核酸，按照常規(guī)方法進(jìn)行DNA的消化，得到所述的總RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物中總RNA的提取方法，其特征在于所述的由氯仿和異戊 醇組成的混合試劑中氯仿和異戊醇的體積比為20 30 1，優(yōu)選M 1;所述的由水飽和 酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑中水飽和酚、氯仿及異戊醇的體積比為20 觀20 28 1，優(yōu)選 25 24 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物中總RNA的提取方法，其特征在于所述的生物材料粉 碎是通過在液氮中將生物材料研磨成粉末，所述的離心條件為8000 12000rpm，8 15分 鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種植物中總核酸的同步提取方法。將生物材料粉碎后與CTAB裂解液混合，水浴45-60min，加入與CTAB裂解液等體積的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑，混勻；離心，取上清，加入等體積的由水飽和酚、氯仿及異戊醇組成的混合試劑，混勻；離心，取上清，加入1/30體積的NaAc和1/10體積的無水乙醇，混勻，在冰上靜置5min后，再加入等體積的由氯仿和異戊醇組成的混合試劑；離心，取上清，加入1/10體積的NaAc和兩倍體積的無水乙醇，-20℃靜置1h；離心，棄上清，用70％的乙醇洗滌沉淀1～5次，干燥得到包含基因組DNA和總RNA的總核酸。該發(fā)明同步提取煙草總核酸，對(duì)于今后開展基因克隆、表達(dá)分析等一系列分子生物學(xué)研究具有非常重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102115742SQ201010585828
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者喬玉山, 張計(jì)育, 徐長(zhǎng)寶, 渠慎春, 王三紅, 章鎮(zhèn), 蔡斌華, 陶建敏, 高志紅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)