專利名稱：一種石油烴類污染物降解菌劑的生產方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術領域，涉及一種適用于石油污染土壤修復的微生物菌劑 的制備方法。
背景技術：
在石油開采和油井施工作業(yè)過程中，易造成石油烴泄漏，污染土壤。鹽堿土壤本身 土壤理化性質差，石油污染進一步惡化了土壤的理化性質，干擾土壤物質循環(huán)。此外，石油 中含有的多環(huán)芳烴等污染物具有“三致”效應，具有較高的生態(tài)風險，對人類健康具有潛在 威脅。因此，石油污染土壤的修復是一項緊迫任務。目前，石油污染土壤的修復方法主要有萃取法、淋洗法、堆肥法、植物修復法、微 生物修復法等。微生物由于具有繁殖能力強、適應性強、降解譜廣等優(yōu)點，常用于清除有機 污染物；從土壤環(huán)境中篩選出來的土著石油降解菌也常用于石油污染土壤的修復。例如 中國專利O004100380539)公開了一株可以降解石油烴的短短芽孢桿菌Brevibacillus brevis HTCGMCC No. 1142;中國專利(200710059755. 9)公開了一株低溫解烴的極小單 胞菌PUSillim0nassp.T7-7。除此以外，目前報道的可以降解石油烴、修復石油污染土壤 的微生物還有假單胞菌(Pseudomonas sp.)、棒桿菌(Corynebacterium sp·)、微球菌 (Micrococcus sp.)、產堿桿菌(Alcaligenes sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp·)、無色桿菌 (Achromobacter sp.)、諾卡氏菌(Nocardiasp.)，等等。從土壤中分離篩選高效石油烴降解 菌，特別是適應特定土壤環(huán)境的降解菌，仍是石油污染土壤修復的研究熱點之一。甘薯易腐爛，不宜長期存放。甘薯的深加工，可以解決因貯存鮮薯不當而導致大 量爛薯的現象，甘薯精制淀粉經過不同深度的加工，可生產出數百種有價值的產品，增值 10-30倍左右。但是，目前的加工工藝，每生產1噸甘薯淀粉大約產出6-10噸高濃度有機 廢水，這些廢水的COD值高達10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白質、果膠、有機酸 及少量的油脂，易腐敗發(fā)酵，使水質發(fā)黑發(fā)臭，排入河流會消耗水中的溶解氧，促進藻類及 水生植物繁殖，量大時河流嚴重缺氧，發(fā)生厭氧腐敗，散發(fā)惡臭，魚、蝦、貝類等水生動物可 能會因此而窒息死亡。而采用一般污水處理工藝將如此高濃度的廢水處理達標，消耗驚人。 從另一個角度考慮，甘薯淀粉廢水中的有機質(包括蛋白質、果膠、糖類等)是微生物生長 的良好營養(yǎng)底物，可以做成微生物培養(yǎng)基，發(fā)酵生產微生物產品。本專利發(fā)明了一種用甘薯淀粉廢水為主要原料，生產石油烴類污染物降解菌劑的 方法，采用的菌株是從石油污染土壤中分離出的一株高效降解石油烴類污染物的巨大芽孢 桿菌。目前尚未發(fā)現文獻報道用甘薯淀粉廢水生產石油烴類污染物降解菌劑的生產方法。

發(fā)明內容
針對目前石油污染土壤修復中的問題，本發(fā)明提供一種適用于強化修復石油污染 土壤的微生物菌劑的低成本生產方法。本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人從石油污染的土壤中分離篩選出來的1株高效降解石油烴的細菌，于2010年10月25日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101。該菌株的分類命名巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，菌株編號P9菌株，保 藏編號CGMCCNo. . 4270。本發(fā)明所述的菌劑的生產方法如下1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘 薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水 至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體，10L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2%以上)lkg， 加甘薯淀粉廢水至10L, pH 7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2%以 上)10kg，加甘薯淀粉廢水至200L, pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在115°C _121°C滅菌15_30min。2、菌種活化挑取石油烴降解菌接種至菌種保藏培養(yǎng)基平板，劃線分離純化， 于30°C培養(yǎng)至有明顯的單菌落生長，挑取單菌落接種于菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C， 150-200r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 12-3^1 ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接 種量接種石油烴降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)12-36h，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接種量 接種石油烴降解菌液體種子，于30°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數后，按照重量比為1 1與粉碎的玉米秸 稈混合均勻，靜態(tài)通風至含水量30%，包裝，保存于干燥陰涼處。
具體實施例方式由本發(fā)明技術方案生產的石油烴降解菌劑能夠有效降解土壤中的石油烴類污染 物。以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的 精神實質，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例1 石油烴降解菌劑生產1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘 薯淀粉廢水至1L，pH 7. 2 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水 至 1L，pH 7. 2 ；3)種子培養(yǎng)基(液體，10L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2%以上)lkg， 加甘薯淀粉廢水至10L, pH 7. 2 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2 %以 上)10kg，加甘薯淀粉廢水至200L, PH 7. 2 ；
以上培養(yǎng)基均在115°C滅菌20min。2、菌種活化挑取石油烴降解菌接種至菌種保藏培養(yǎng)基平板，劃線分離純化， 于30°C培養(yǎng)至有明顯的單菌落生長，挑取單菌落接種于菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C， 150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)Mh ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照10%的接種量 接種石油烴降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)Mh，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照10%的接種量接種 石油烴降解菌液體種子，于30°C，通空氣培養(yǎng)24h，得到活菌體培養(yǎng)物。5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數后，按照重量比為1 1與粉碎的玉米秸 稈混合均勻，靜態(tài)通風至含水量30%，包裝，保存于干燥陰涼處。實施例2 石油烴降解菌劑對石油污染土壤的修復效果按重量比為3%的施加量將制備得到的石油烴降解菌劑加入石油污染土壤中，混 合均勻。每隔7天，翻1次，1個月后，測定土壤中污染物的含量。烷烴含量由3950mg/kg降 至1270mg/kg，下降了 68% ；芳香烴含量由786mg/g降至391mg/kg，下降了 50%。
權利要求
1. 一種利用甘薯淀粉廢水生產巨大芽孢桿菌石油烴降解菌劑的方法，其特征在于發(fā) 酵培養(yǎng)基以甘薯淀粉廢水為主要原料，生產步驟包括(1)培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L)蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘薯淀 粉廢水至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L)蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水至 1L, pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體，10L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2%以上)lkg，加 甘薯淀粉廢水至10L，pH 7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L)石油污染的土壤(即油泥，石油烴含量2%以上)10kg， 加甘薯淀粉廢水至200L，pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在115°C _121°C滅菌15-30min。(2)菌種活化挑取石油烴降解菌接種至菌種保藏培養(yǎng)基平板，劃線分離純化，于30°C 培養(yǎng)至有明顯的單菌落生長，挑取單菌落接種于菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C，150-200r/min 搖床振蕩培養(yǎng)12-3 ；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種 量接種石油烴降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)12-3 !，得到液體種子。(4)液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種量接 種石油烴降解菌液體種子，于30°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。(5)菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數后，按照重量比為1 1與粉碎的玉米秸稈 混合均勻，靜態(tài)通風至含水量30%，包裝，保存于干燥陰涼處。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用甘薯淀粉廢水生產巨大芽孢桿菌石油烴高效降解菌劑的方法，屬于環(huán)境生物技術領域。石油烴降解株菌采用的是一株分離石油污染土壤的芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，其菌劑的生產方法包括5個步驟培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備，以甘薯淀粉廢水提供發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源和水，以玉米秸稈為微生物的載體，制備固體菌劑。本發(fā)明技術方案不僅為高濃度甘薯淀粉廢水的資源化利用提供了一條新途徑，而且生產的石油烴降解菌劑能高效原位修復石油污染的土壤，保護生態(tài)環(huán)境。
文檔編號C12R1/11GK102102088SQ20101058178
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者宿燕明, 彭霞薇, 王新新, 白志輝, 盛萱宜, 趙志瑞 申請人:北京林業(yè)大學