專利名稱：一種抗cd25人源化單克隆抗體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種抗CD25人源化單克隆抗體的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
器官移植是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)的重大成就之一，是目前多種臟器終末性疾病唯一的治療手段，但供體短缺已嚴(yán)重影響了器官移植手術(shù)的進(jìn)行，而免疫排斥又進(jìn)一步加重了本已短缺的器官來源。由于⑶25主要表達(dá)于激活的T淋巴細(xì)胞，因此，針對⑶25分子，研究人員設(shè)計(jì)了特異性的藥物人源化單抗Daclizumab和人-鼠嵌合型抗⑶25單抗Basiliximab，以在同種異體器官移植時(shí)，特異性地抑制針對移植物的免疫反應(yīng)。其中，Daclizumab由美國Protein Design Labs公司開發(fā)，已于1997年獲得FDA 的批準(zhǔn)，用于預(yù)防腎移植的急性排斥反應(yīng)。在開發(fā)之初，Protein DesignLabs選擇了 NSO 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，采用了無血清懸浮批次培養(yǎng)的方式，但NSO作為宿主細(xì)胞，具有以下先天性的缺陷NS0宿主細(xì)胞的α-1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶會產(chǎn)生具有高免疫原性的Gala 1， 3-Gal β 1,4-GlcNac，這種在人體內(nèi)不存在的糖基化修飾應(yīng)用于人體時(shí)，具有刺激機(jī)體產(chǎn)生診斷這類異種抗原的免疫反應(yīng)，從而降低藥物的療效，甚至發(fā)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)；NSO細(xì)胞中，糖基化末端的唾液酸形式主要為N-glyculyl-neuraminic acid (NGNA) (N-乙酰神經(jīng)氨酸),與人體的N-acetyl-neuraminic acid (NANA) (N-乙酰神經(jīng)氨酸)不同，因此利用NSO 細(xì)胞作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)得到的抗CD25單抗用于人體后也具有潛在的免疫原性，可能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而影響療效甚至發(fā)生過敏反應(yīng)；NSO細(xì)胞內(nèi)具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒，在以該細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的抗CD25單抗工業(yè)化制備的過程中，大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒分泌到培養(yǎng)上清中，如果終產(chǎn)品中殘留有未清除獲滅活的病毒，會導(dǎo)致臨床治療中不確定的風(fēng)險(xiǎn)。因此下游的純化過程需要通過非常復(fù)雜的步驟去除或滅活上清中的病毒，而且這些步驟必須通過有效的驗(yàn)證。為克服利用NSO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞培養(yǎng)抗CD25單抗的缺點(diǎn)，減少細(xì)胞表達(dá)的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高其對人體的安全性，上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司公開了利用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞、三步流加法培養(yǎng)的方案(申請?zhí)枮?200910057759. 2的中國專利申請)。但在該方案中，糖基化形式最完整的G2型糖基化產(chǎn)物的百分比不足85%，因此，有必要對該方案做進(jìn)一步的完善，以提高G2型糖基化產(chǎn)物的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人在對申請?zhí)枮?00910057759.2的中國專利申請中公開的技術(shù)方案做進(jìn)一步研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新的培養(yǎng)方法，利用該培養(yǎng)方法，可以將G2型糖基化產(chǎn)物的百分比提高到90%以上，在最優(yōu)的方案中，G2型糖基化產(chǎn)物的百分比可達(dá)到約95%，從而進(jìn)一步降低了導(dǎo)致免疫原性的可能，而且半乳糖不完全修飾的比例也顯著降低。經(jīng)檢測證實(shí)，構(gòu)建的工程細(xì)胞中無內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，利用該工程細(xì)胞培養(yǎng)獲得的抗體沒有病毒的污染。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種利用CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)方式高效表達(dá)抗⑶25 人源化單克隆抗體的方法。本發(fā)明公開的利用CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)方式高效表達(dá)抗CD25人源化單克隆抗體的方法，為三步流加培養(yǎng)法，即a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5°C 38°C，pH值6. 5 6. 9，培養(yǎng)M 48小時(shí)，當(dāng)動物細(xì)胞生長至2. 5 3. OX 106cellS/ml時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加流加培養(yǎng)基， 進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 3/天，流加培養(yǎng)時(shí)間72 96小時(shí)；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32. 5°C ；34. 5°C，pH值7. 2 7. 3，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 2/天，流加培養(yǎng)時(shí)間120 144小時(shí)；c)停止流加，細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36°C 38°C，pH值7. 0 7. 3， 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 48小時(shí)；其中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50 75mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖6. 5 8. Ommol/L和谷氨酰胺5. 0 7. 8mmol/L, HEPES 15 ^mmol/ 1，NaHC0s30 50ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 5-1. 8g/L。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖60mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖 7. 5mmol/L 和谷氨酰胺 6. Ommol/L, HEPES 20mmol/l, NaHC0345ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 6 1. 7g/L。通過對培養(yǎng)過程中培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化的比例進(jìn)行檢測，結(jié)果表明無血清培養(yǎng)基中添加半乳糖可以顯著增加G2型糖基化的比例，從而降低由糖基化差異帶來的免疫原性及抗體的功能差異問題。培養(yǎng)過程及產(chǎn)品的病毒檢測通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，包括細(xì)胞形態(tài)觀察、 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、傳代細(xì)胞培養(yǎng)、透射電鏡檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒、動物和雞胚試驗(yàn)、動物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CHO細(xì)胞均為陰性。更重要的是，相比于申請?zhí)枮?00910057759.2的中國專利申請的方法，本發(fā)明提供的方法，獲得的G2型糖基化產(chǎn)物的百分比含量得到進(jìn)一步提高，達(dá)到90-95%，進(jìn)一步減少了細(xì)胞表達(dá)的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高了培養(yǎng)產(chǎn)物對人體的安全性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例、 實(shí)驗(yàn)例只是為了說明本發(fā)明，而并不是用來限制本發(fā)明。本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法參見專利號 02112493. 0，發(fā)明名稱為《重組的抗⑶25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》的中國發(fā)明專利中公開的方法，使用的抗體序列參見專利號89109618. 3，發(fā)明名稱為《新的白細(xì)胞介素-2 受體特異性免疫球蛋白》中國發(fā)明專利中公開的序列。人源化抗體的穩(wěn)定表達(dá)與純化方法參見專利號02112493. 0，發(fā)明名稱為《重組的抗⑶25單克隆抗體、其編碼序列及應(yīng)用》的中國發(fā)明專利中公開的方法。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，在Excell325-PF培養(yǎng)基(美國JRH公司生產(chǎn))中加入半乳糖(50 75mg/L)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在Excel 1325-PF培養(yǎng)基中加入葡萄糖(6. 5 8. Ommo 1/L)、谷氨酰胺(濃度為 5. 0-7. 8mmol/L)、HEPES (15 ^mmol/l)和 NaHCO3 (30 50ug/l)作為流加培養(yǎng)基。
實(shí)施例1、優(yōu)化的大規(guī)樽無血清培養(yǎng)采用專利200610147535. 7 “一種高效表達(dá)重組蛋白的方法”中三段流加法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程和發(fā)酵參數(shù)如下a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5°C 38°C，pH值6. 5 6. 9，培養(yǎng)M 48小時(shí)，當(dāng)動物細(xì)胞生長至2. 5 3. OX 106cells/ml時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 3/天，流加培養(yǎng)時(shí)間72 96小時(shí)；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32. 5°C 34. 5°C, pH值7. 2 7. 3，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 2/天，流加培養(yǎng)時(shí)間120 144小時(shí)；c)停止流加，細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至361 381，？!1值7.0 7.3，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24 48小時(shí)。其中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖6. 5mmol/L 和谷氨酰胺5. Ommol/L, HEPES 15mmol/l, NaHC0330ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在 1. 5 1. 6g/L。實(shí)施例2、優(yōu)化的大規(guī)樽無血清培養(yǎng)采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)，其中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖60mg/L， 流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖7. 5mmol/L和谷氨酰胺6. Ommol/L, HEPES20mmol/l, NaHCO3 45ug/ 1，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 6 1. 7g/L。實(shí)施例3、優(yōu)化的大規(guī)樽無血清培養(yǎng)采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)，其中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖75mg/L， 流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖8. Ommol/L和谷氨酰胺7. 8mmol/L, HEPES26mmol/l, NaHCO3 50ug/ 1，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 7 1. 8g/L。實(shí)驗(yàn)例1、培養(yǎng)產(chǎn)物糖基化比較參考產(chǎn)品說明書中的方法，使用Beckman毛細(xì)管電泳結(jié)合Beckman糖基化檢測試劑盒(Beckman Coulter, 477600)檢測實(shí)施例1_3培養(yǎng)獲得的產(chǎn)物糖基化水平，結(jié)果如表2 所示。表2、糖基化檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗⑶25抗體的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a)細(xì)胞培養(yǎng)溫度36.5°C 38°C，pH值6. 5 6. 9，培養(yǎng)M 48小時(shí)，當(dāng)動物細(xì)胞生長至2. 5 3. OX 106cellS/ml時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加流加培養(yǎng)基，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 3/天，流加培養(yǎng)時(shí)間72 96小時(shí)；b)細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至32.5°C 34. 5°C，pH值7. 2 7. 3，進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加稀釋率為0. 1 0. 2/天，流加培養(yǎng)時(shí)間120 144小時(shí)；c)停止流加，細(xì)胞培養(yǎng)溫度升至36°C 38°C，pH值7.0 7. 3，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為 24 48小時(shí)；其特征在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50 75mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖 6. 5 8. Ommol/L 和谷氨酰胺 5. 0 7. 8mmol/L, HEPES 15 ^mmol/l，NaHC0330 50ug/ 1，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 5-1. 8g/L。
2.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖 6. 5mmol/L 和谷氨酰胺 5. Ommol/L, HEPES 15mmo 1/1, NaHC0330ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 5 1. 6g/L。
3.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖60mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖 7. 5mmol/L 和谷氨酰胺 6. Ommol/L, HEPES20mmol/l, NaHC0345ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 6 1. 7g/L。
4.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖75mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖 8. Ommol/L 和谷氨酰胺 7. 8mmol/L, HEPES26mmol/l, NaHC0350ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1. 7 1. 8g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗CD25人源化單克隆抗體的培養(yǎng)方法，在三段流加培養(yǎng)的基礎(chǔ)上在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加半乳糖50～75mg/L，流加培養(yǎng)基中添加葡萄糖6.5～8.0mmol/L和谷氨酰胺5.0～7.8mmol/L，HEPES 15～26mmol/l，NaHCO330～50ug/l，控制培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度維持在1.5-1.8g/L。利用本發(fā)明公開的培養(yǎng)方法可以進(jìn)一步減少細(xì)胞表達(dá)的蛋白與人體天然存在蛋白的差異，提高培養(yǎng)產(chǎn)物對人體的安全性。
文檔編號C12N5/07GK102559577SQ20101058152
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者侯盛, 唐堯坤, 王進(jìn)秋 申請人:上海中信國健藥業(yè)股份有限公司