甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，它涉及微量免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，它采用鼠源單克隆抗體技術(shù)，主要步驟包括：免疫原與包被原的合成與鑒定；進行動物免疫；制備雜交瘤細胞：取準(zhǔn)備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應(yīng)用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定；抗甘草酸單克隆抗體制備；甘草酸單克隆抗體的初步鑒定；它可對來源復(fù)雜的甘草及其相關(guān)產(chǎn)品進行快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。
【專利說明】甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微量免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]甘草酸的檢測方法主要有比色法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TCL)、毛細管電泳法(EC)等，但比色檢測法易受糖類等物質(zhì)的干擾，誤差較大，只能測定可被顯色劑顯色的總皂苷類成分，色譜法固然靈敏度較高，樣品的預(yù)處理程序復(fù)雜，如氣相色譜需要將甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸，再進行酯化，檢測時間長、時效性差。此外要求操作人員技術(shù)性要求高，且需要昂貴的儀器設(shè)備，步驟繁瑣，難以實時監(jiān)控，在甘草及其各類制品的快速鑒定方面存在諸多不足，不能滿足藥用甘草真?zhèn)慰焖勹b定及復(fù)方藥品或食品中快速大量的測定分析的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，它可對來源復(fù)雜的甘草及其相關(guān)產(chǎn)品進行快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。
[0004]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案:它采用鼠源單克隆抗體技術(shù)，主要步驟包括:1、免疫原與包被原的合成與鑒定:采用活性酯發(fā)分別了免疫抗原和包被抗原，采用紫外掃描法檢測合成抗原的性質(zhì)。
[0005]2、進行動物免疫:用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通過3次加強免疫后斷尾取血，血清效價均大于1: 16000，經(jīng)過融合，篩選出陽性細胞株，經(jīng)過三次亞克隆化后陽性率達100%，獲得能穩(wěn)定分泌甘草酸單克隆抗體的雜交細胞株，將其命名為3D6，經(jīng)過7代培養(yǎng)，細胞的生長狀態(tài)良好。表明該細胞穩(wěn)定性良好，可以用來穩(wěn)定生產(chǎn)甘草酸單克隆抗體。
[0006]3、制備雜交瘤細胞:取準(zhǔn)備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應(yīng)用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定。陽性抑制滿足要求的細胞株，進行亞克隆，獲得大量雜交瘤細胞。
[0007]4、抗甘草酸單克隆抗體制備:取雌性小鼠5只，腹腔注射無菌液體石蠟0.5~lmL，7~IOd后腹腔注射雜交瘤細胞I~5X106pfu/只。8~13d后待小鼠腹部明顯膨大后采集腹水。待3~4d腹水再次積聚后，同法收集腹水。
[0008]5、甘草酸單克隆抗體的初步鑒定:通過間接競爭ELISA測定抗體的抑制效果，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品用PBS按0、1、3、9、27、81 μ g/L稀釋成5個濃度梯度，用已建立的間接競爭ELISA所測A值計算各濃度的抑制率。
[0009]所述的動物免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。
[0010]所述的動物免疫采用體內(nèi)免疫法來進行免疫，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。該方法適用于免疫原性強、來源充分的抗原，體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射。
[0011]本發(fā)明的有益效果:可對來源復(fù)雜的甘草及其相關(guān)產(chǎn)品進行快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。
【具體實施方式】
[0012]本【具體實施方式】采用以下技術(shù)方案:它采用鼠源單克隆抗體技術(shù)，主要步驟包括:
1、免疫原與包被原的合成與鑒定:采用活性酯發(fā)分別了免疫抗原和包被抗原，采用紫外掃描法檢測合成抗原的性質(zhì)。
[0013]2、進行動物免疫:用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通過3次加強免疫后斷尾取血，血清效價均大于1: 16000，經(jīng)過融合，篩選出陽性細胞株，經(jīng)過三次亞克隆化后陽性率達100%，獲得能穩(wěn)定分泌甘草酸單克隆抗體的雜交細胞株，將其命名為3D6，經(jīng)過7代培養(yǎng)，細胞的生長狀態(tài)良好。表明該細胞穩(wěn)定性良好，可以用來穩(wěn)定生產(chǎn)甘草酸單克隆抗體。
[0014]3、制備雜交瘤細胞:取準(zhǔn)備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應(yīng)用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定。陽性抑制滿足要求的細胞株，進行亞克隆，獲得大量雜交瘤細胞。
[0015]4、抗甘草酸單克隆抗體制備:取雌性小鼠5只，腹腔注射無菌液體石蠟0.5~lmL，7~IOd后腹腔注射雜交瘤細胞I~5X106pfu/只。8~13d后待小鼠腹部明顯膨大后采集腹水。待3~4d腹水再次積聚后，同法收集腹水。
[0016]5、甘草酸單克隆抗體的初步鑒定:通過間接競爭ELISA測定抗體的抑制效果，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品用PBS按0、1、3、9、27、81 μ g/L稀釋成5個濃度梯度，用已建立的間接競爭ELISA所測A值計算各濃度的抑制率。
[0017]所述的動物免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。
[0018]所述的動物免疫采用體內(nèi)免疫法來進行免疫，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。該方法適用于免疫原性強、來源充分的抗原，體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射。
[0019]本【具體實施方式】可對 來源復(fù)雜的甘草及其相關(guān)產(chǎn)品進行快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。
[0020]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.甘草酸酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，其特征在于它采用鼠源單克隆抗體技術(shù)，主要步驟包括:(I)、免疫原與包被原的合成與鑒定:采用活性酯發(fā)分別了免疫抗原和包被抗原，采用紫外掃描法檢測合成抗原的性質(zhì)；(2)、進行動物免疫:用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通過3次加強免疫后斷尾取血，血清效價均大于1: 16000，經(jīng)過融合，篩選出陽性細胞株，經(jīng)過三次亞克隆化后陽性率達100%，獲得能穩(wěn)定分泌甘草酸單克隆抗體的雜交細胞株，將其命名為3D6，經(jīng)過7代培養(yǎng)，細胞的生長狀態(tài)良好，表明該細胞穩(wěn)定性良好，可以用來穩(wěn)定生產(chǎn)甘草酸單克隆抗體；(3)、制備雜交瘤細胞:取準(zhǔn)備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應(yīng)用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定，陽性抑制滿足要求的細胞株，進行亞克隆，獲得大量雜交瘤細胞；(4)、抗甘草酸單克隆抗體制備:取雌性小鼠5只，腹腔注射無菌液體石蠟0.5~lmL，7~IOd后腹腔注射雜交瘤細胞I~5X 106pfu/只，8~13d后待小鼠腹部明顯膨大后采集腹水，待3~4d腹水再次積聚后，同法收集腹水；(5)、甘草酸單克隆抗體的初步鑒定:通過間接競爭ELISA測定抗體的抑制效果，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品用PBS按0、1、3、9、27、81 μ g/L稀釋成5個濃度梯度，用已建立的間接競爭ELISA所測A值計算各濃度的抑制率。
【文檔編號】G01N33/577GK103613667SQ201310545051
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月2日
【發(fā)明者】彭勵, 宋孚洋, 張東濤, 李宏福, 任樹勇, 鄭麗萍 申請人:寧夏大學(xué)