專(zhuān)利名稱(chēng)：高賴(lài)氨酸蛋白基因sb401表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米是我國(guó)的重要糧食作物。隨著玉米在產(chǎn)量、抗性等方面研究的深入，人們?cè)絹?lái) 越關(guān)玉米米品質(zhì)的提高。蛋白質(zhì)、氨基酸的含量是品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。增加玉米中蛋 白質(zhì)和賴(lài)氨酸的含量將提高玉米的生物價(jià)值，促進(jìn)人和動(dòng)物對(duì)其蛋白質(zhì)的消化吸收和利 用。玉米是我國(guó)的重要糧食作物。隨著玉米在產(chǎn)量、抗性等方面研究的深入，人們?cè)絹?lái)越關(guān) 玉米米品質(zhì)的提高。蛋白質(zhì)、氨基酸的含量是品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。增加玉米中蛋白質(zhì)和賴(lài) 氨酸的含量將提高玉米的生物價(jià)值，促進(jìn)人和動(dòng)物對(duì)其蛋白質(zhì)的消化吸收和利用。應(yīng)用傳 統(tǒng)育種手段改良玉米蛋白質(zhì)品質(zhì)雖然取得了可喜的成績(jī)，但傳統(tǒng)育種方法周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢、 受種質(zhì)資源的限制，且難以解決諸如玉米中蛋白質(zhì)的氨基酸營(yíng)養(yǎng)組分不平衡和不含維生素 A等問(wèn)題。由于玉米蛋白質(zhì)含量主要受遺傳基因控制，利用基因工程將自然界植物體內(nèi)分子 量較小、且富含賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩?，是一個(gè)改良玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的可行途徑。向植物中導(dǎo)入富含賴(lài)氨酸的外源蛋白基因是提高植物賴(lài)氨酸含量的一個(gè)有效途 徑。此類(lèi)方法國(guó)內(nèi)也有一定的研究，孫學(xué)輝等(2001)將外源蛋白基因?qū)胗衩鬃越幌挡牧?P12和綜3獲得了賴(lài)氨酸含量提高16%的轉(zhuǎn)基因玉米材料，后通過(guò)常規(guī)育種方法獲得了穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)基因玉米自交系該自交系的蛋白質(zhì)和賴(lài)氨酸含量均提高50%以上；王為民等(2004)用 基因槍法將該基因?qū)攵i稻中優(yōu)早5號(hào)，獲得了蛋白質(zhì)和賴(lài)氨酸的含量分別提高35. 18% 和45. 09%的Tl代轉(zhuǎn)基因植株。這些研究結(jié)果顯示了 M^V基因在提高作物賴(lài)氨酸含量、 改良作物蛋白質(zhì)品質(zhì)方面的良好應(yīng)用前景。但是由于植物表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子不同，或 者遺傳轉(zhuǎn)化的方法不同，導(dǎo)致基因表達(dá)水平低，外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì) 不同，宿主細(xì)胞也不同，將重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的具體方法有許多優(yōu)越性，但同時(shí)也存在著 一些不足之處。例如，基因槍轟擊的隨機(jī)性導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率不高；基因槍插入往往是多拷貝成 簇整合到受體基因組中，而且可能發(fā)生多種方式重排；同源序列能以DNA-DNA、DNA-RNA、 RNA-RNA的方式相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默；轟擊過(guò)程中還可能造成外 源基因的斷裂，并且使插入的基因成為無(wú)活性的片段；出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體或嵌合體的可能性較 高以及基因槍轉(zhuǎn)化所用的成本較高等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高賴(lài)氨酸蛋白基因SB401表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用， 該方法費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時(shí)具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大 片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
提取馬鈴薯花粉提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用特異引物從馬鈴薯花粉里面克隆了高賴(lài)氨酸基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據(jù)克隆需要在序列兩端加上限制性?xún)?nèi)切酶 識(shí)別位點(diǎn)序列并構(gòu)建到相應(yīng)的表達(dá)載體上。主要包括以下步驟，
(1)提取馬鈴薯花粉高賴(lài)氨酸基因sb401總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(2)以上述cDNA為模板，以特異引物克隆馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401；
(3)將馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401與亞克隆載體pGSI連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401亞克隆載體質(zhì)粒；
(4)將上述克隆質(zhì)粒構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300，獲得含高賴(lài)氨酸基因sb401片 段重組表達(dá)載體CUB-sb401。在植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300中插入SB401基因，啟動(dòng)子來(lái)自玉米基因組 Ubiquitin基因，是一個(gè)在單子葉植物中有較強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)啟動(dòng)SB401基因基因表 達(dá)，Ubi啟動(dòng)子它來(lái)自于玉米多聚泛素蛋白基因(maiz印loyubigene)，它實(shí)際上包含Ubi 基因的啟動(dòng)子區(qū)，5’非翻譯區(qū)和第一內(nèi)含子；在脅迫條件下(如熱休克)Ubiqutin啟動(dòng)子的 表達(dá)活性顯著增強(qiáng)。所述馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因SB401具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。所述特異引物序列如下(如SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4所示) 上游弓I物 Fl: 5' -ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；
下游弓I物 Rl: 5' -gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'。將上述表達(dá)載體導(dǎo)入相應(yīng)的農(nóng)桿菌中，進(jìn)而將含高賴(lài)氨酸基因sb401片段重組表 達(dá)載體CUB-sb401導(dǎo)入玉米愈傷組織，經(jīng)過(guò)侵染、恢復(fù)、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基 因苗，培育高賴(lài)氨酸玉米；也可以對(duì)其它農(nóng)作物(農(nóng)作物、果樹(shù)或蔬菜，如水稻、小麥等)進(jìn)行 遺傳轉(zhuǎn)化，提其賴(lài)氨酸的含量，進(jìn)而提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。上述高賴(lài)氨酸基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明具有積極有益的效果
在載體構(gòu)建中使用自玉米基因組高效表達(dá)啟動(dòng)子Ubiquitin基因，負(fù)責(zé)啟動(dòng)SB401基 因基因表達(dá)，所用的篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因，bar基因在生物安全性上比其它標(biāo)記基因要 好，它的編碼蛋白在人體內(nèi)不存在，并且和已知的毒蛋白無(wú)同源序列，也不具過(guò)敏原，相對(duì) 較為安全。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行高賴(lài)氨酸基因的遺傳轉(zhuǎn)化，不但費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重 復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時(shí)具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)；通過(guò)本發(fā)明 方法使sb401基因成功轉(zhuǎn)化到玉米中，并獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化苗。編碼馬鈴薯花粉特異水溶性蛋白的SB401基因編碼的蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸含量高達(dá) 16. 7%，是目前報(bào)道的賴(lài)氨酸含量較高的蛋白質(zhì)編碼基因，該基因高效表達(dá)后可以提高玉米 賴(lài)氨酸的含量，進(jìn)而提高玉米的品質(zhì)。


圖1 pGSI-SB401用BamHI和SacI酶切鑒定圖，證明SB401基因連入pGSI載體 中，所的到的片段為SB401基因片段；Marker分子量大小分別為2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp ；pGSI是上海生工提供的的亞克隆，是經(jīng)過(guò)改造的pBSK ；
圖2為CUBSB401用BamHI和SacI酶切鑒定圖，證明SB401基因連入植物表達(dá)載體
4CUB中，所的到的酶切片段為SB401基因片段；Marker分子量大小為2900bp，IlOObp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, IOObp ；
圖 3 為 CUB (pCAMBIA1300-Ubi-MCS-Bar)質(zhì)粒圖譜；
圖4為采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)SB401基因玉米照片；其中，愈傷組織的篩選(左)、 再生(中)以及轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田(右)；
圖5為T(mén)O代轉(zhuǎn)化體目的基因SB401的PCR檢測(cè)結(jié)果圖譜，其中，M為M:DL2000 plus ； CKl為陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；CK2為未轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照；空白為雙蒸水對(duì)照；1-8是SB401-1到 SB401-8。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō) 明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化 試齊Ll商店。實(shí)施例一高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401表達(dá)載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下
1.選取新鮮馬鈴薯花粉材料0.lg，以Plant RNA Midi Kit試劑盒(購(gòu)自上海生物工程 有限公司)提取馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401總RNA
2.逆轉(zhuǎn)錄
第一鏈cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶在0. 5mL離心管內(nèi)混合下列試
劑
5μ gRNA樣品
2mL01igo(dT) 15 (250ng/mL)
H2O
28mLTotal
樣品混勻后，短暫離心，65°C變性5min，迅速置于冰上冷卻lOmin，短暫離心后，再向管 內(nèi)加入下列試劑
8mL5X First-strand Buffer
2mLdNTP (IOmM)
ImLRNA酶抑制劑
ImL逆轉(zhuǎn)錄酶(200units/mL)
12mLTotal
用移液槍輕輕混勻樣品，置于42°C空氣浴中反應(yīng)1小時(shí)，然后將樣品置于70°C處理15 分鐘終止反應(yīng)，冰上冷卻后，_20°C保存。3.馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401的克隆
根據(jù)克隆高賴(lài)氨酸基因SB401的需要，我們?cè)O(shè)計(jì)了克隆引物，并在上游引物序列的 5’端添加BamHI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列CATATG，3’端添加HindIII內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列 AAGCTT0設(shè)計(jì)引物序列如下
上游弓丨物 Fl: 5，-GGATCCttttctttttgcaagttcctcc-3，； 下游引物 Rl: 5' -GAGCTCaaagaaatccccaaaagaaag-3'。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA(全株總RNA逆轉(zhuǎn)錄)為模板，以F1、R1為引物，擴(kuò)增SB401基因，PCR條件為 95 0C, 5 分鐘； 95 0C變性30秒； 58 0C退火30秒； 72 0C延伸60秒； 72 0C延伸10分鐘； 反應(yīng)體系為20μ
目的片段大小901bp，退火溫度60°C，33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳確認(rèn)后，回收。4.構(gòu)建高賴(lài)氨酸基因sb401基因克隆載體
(1)將上述擴(kuò)增的SB401基因片段凝膠回收純化，步驟如下
①在UV燈下切膠，放入滅菌的1.5mL離心管中；
②加入等體積的NJ緩沖液；
③55 65°C溫浴7分鐘，至膠融解，每2分鐘搖一下；
④將上述溶膠700μ 轉(zhuǎn)移至Mu-PuDNA回收純化柱中；
⑤室溫下IOOOOrpm離心1分鐘，棄流出液；
⑥加入50(^LSPW(乙醇稀釋)洗滌2次(IOOOOrpm離心洗)，倒掉流出液；
⑦IOOOOrpm離心2分鐘；
將柱子放入1. 5mL離心管中，加入30 50μ 無(wú)菌水洗脫DNA。(2)SB401基因片段和亞克隆載體pGSI連接，連接體系如下
克隆載體PGSI μ
T4DNA連接緩沖液WL
T4DNA連接酶IPL
PCR產(chǎn)物7μ Total ΙΟμ
以上混合物在16 0C連接反應(yīng)16小時(shí)
(3)構(gòu)建所得亞克隆載體命名pGSISB401，用BamHI和SacI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒 定，表明載體構(gòu)建正確(參見(jiàn)圖1)。用PGSISB401質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自 于上海生物工程有限公司)。
5.植物表達(dá)載體構(gòu)建
(1)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和SacI雙酶切上述pGSISB401質(zhì)粒，用凝膠回收純化試劑 盒回收SB401片段；同時(shí)用BamHI和SacI雙酶切植物表達(dá)載體CUB(由山東大學(xué)提供，也可 以從市場(chǎng)中購(gòu)買(mǎi))，用凝膠回收純化試劑盒回收酶切后的CUB片段；將兩個(gè)片段進(jìn)行連接反 應(yīng)，連接反應(yīng)體系如下
CUB植物表達(dá)載體(BamHI、Sac I酶切后)1 μ
T4DNA連接緩沖液 μ
T4DNA連接酶 μ
sb401基因片段7μ
TotalΙΟμ 以上混合物在16 0C連接反應(yīng)16小時(shí)。(2)構(gòu)建好的植物表達(dá)載體為pCAMBIA1300-SB401_Bar(啟動(dòng)子為Ubiquitin，標(biāo)記 基因?yàn)槲溍咕目钩輨┗駼ar)，將質(zhì)粒pCAMBIA1300-SB401-Bar用BamHI和SacI 進(jìn)行酶切鑒定，鑒定出重組質(zhì)粒CUB-sb401含有高賴(lài)氨酸基因sb401片段，表明載體構(gòu)建正 確(圖2)。然后轉(zhuǎn)化E. Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自于上海生物工程有限公司)。其中，CUB(pCAMBIA1300-Ubiquitin-MCS_Bar (參見(jiàn)圖 3)，質(zhì)粒是在 pCAMBIA1300 質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的質(zhì)粒，含有一個(gè)目的基因插入盒(35S—多克隆酶切位點(diǎn)一 Tnos)和一 個(gè)來(lái)自吸水鏈霉菌的抗除草劑基因Bar質(zhì)粒pCAMBIA1300為澳大利亞CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)公司產(chǎn)品，參 考網(wǎng)址 http://www. cambia. org/daisy/cambia/585. html。實(shí)施例二玉米農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
本實(shí)驗(yàn)采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含高賴(lài)氨酸基因sb401片段重組表達(dá)載體CUB-sb401 含導(dǎo)入玉米愈傷組織，經(jīng)過(guò)侵染、恢復(fù)、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基因苗(參見(jiàn)圖4)。 其具體步驟如下
1.農(nóng)桿菌侵染幼胚把剛剝離的幼胚放入含有D-inf (2ml)的離心管中，每管約 20 100個(gè)幼胚，用這樣的培養(yǎng)基浸泡Ih以上，然后濾出D-inf，加入1 1. 5ml特定濃度 (0D600=0. 3 0. 4)的農(nóng)桿菌菌液，輕輕顛倒離心管20次，然后直立放置在暗箱里5分鐘， 確保幼胚全部浸泡在農(nóng)桿菌液體里，整個(gè)過(guò)程避免旋渦振蕩，五分鐘后將幼胚及菌液倒于 滅菌的吸水紙上吸干(約2 5min)。2.共培養(yǎng)侵染后，把侵染過(guò)的幼胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)上，使幼胚的盾片朝上，同時(shí) 吸除培養(yǎng)基表面多余的農(nóng)桿菌，將晾干后的愈傷組織置于鋪有滅菌濾紙的共培養(yǎng)基上，用 封口膜封住培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱中20°C左右暗培養(yǎng)3天。3.恢復(fù)培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后，把幼胚(愈傷組織)轉(zhuǎn)移到resting medium上面，同 時(shí)用封口膜封住培養(yǎng)皿，放在28°C條件下暗培養(yǎng)7 10天。4.選擇7 10天后，把所有的幼胚(愈傷組織)轉(zhuǎn)移到選擇(依載體不同選擇合 適的選擇標(biāo)記)
培養(yǎng)基上面，可以經(jīng)過(guò)多輪篩選，每次選擇培養(yǎng)兩周，選擇標(biāo)記濃度適當(dāng)?shù)卦龃蟆１热纾?選擇培養(yǎng)基I含有Bar 1. 5mg/L，兩周后再進(jìn)行第二輪篩選時(shí)Bar的濃度可以增加到3mg/ L，第三輪篩選時(shí)可以增Bar的濃度可以增加到4. 5mg/L。5.轉(zhuǎn)基因植株的再生經(jīng)過(guò)多輪篩選后，將長(zhǎng)出的顏色較鮮艷的抗性愈傷放在再 生培養(yǎng)基I上面，暗培養(yǎng)2 3周，當(dāng)出現(xiàn)胚狀體后將胚狀體轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基II上光照培 養(yǎng)，誘導(dǎo)分化，約三天后胚狀體將出現(xiàn)綠點(diǎn)；約2周后，會(huì)有幼苗分化出來(lái)，取處于再生培養(yǎng) 基II中長(zhǎng)至2cm以上高的苗將其轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，繼續(xù)在光照培養(yǎng)室培養(yǎng)；在經(jīng)2 周后當(dāng)幼苗長(zhǎng)出3條根以上、高度約8cm以上時(shí)，打開(kāi)瓶蓋，在培養(yǎng)基上加少許滅菌水進(jìn)行 煉苗處理，并繼續(xù)在光照培養(yǎng)室中生長(zhǎng)。6.三天后將幼苗從培養(yǎng)瓶中取出，將苗移栽含有泥炭土和蛭石(3:1)的營(yíng)養(yǎng)缽 中，最后把苗移入人工氣候室中。實(shí)施例三轉(zhuǎn)基因玉米植株P(guān)CR檢測(cè)
實(shí)施例二中移栽成活的轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)出7 8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測(cè)是否帶有外源基因；植物DNA提取以Saghai-Maroof等提出的CTAB的方法進(jìn)行；采用 PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因；圖5中顯示了 TO代轉(zhuǎn)化體目的基因sb401的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中 M :M:DL2000 plus ；CKl 陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；CK2 未轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照；空白雙蒸水對(duì)照；1_8 sb401-l 到 sb401-8。所用的 PCR 檢測(cè)引物為(如 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 所示) Y2-SB401 5' -cacgcagttgcaacggagaacg-3' R2SB401 5' _ataaacactcttccttccatat_3' 目的片段大小560 bp，退火溫度58°C，35個(gè)循環(huán)。玉米植株DNA的提取步驟如下
1.取約Icm2左右新鮮幼嫩葉片放在1. 5ml的Eppendorf管中，然后將放有葉子的管 插在冰盒中，以保持新鮮度；
3.取液氮，將材料速凍，用鉆頭將材料研磨成粉，向管中迅速加入600ul提取緩沖液 (65°C預(yù)熱的CTAB，2%β -巰基乙醇)，振蕩混勻，在65°C水浴鍋中溫育30min，其間顛倒3_4 次，混勻；
4.將離心機(jī)降溫，在4°C條件下，12500rpm離心IOmin；
5.取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，混勻，抽提lOmin，至溶液呈乳濁狀。在 室溫下離心，12500rpm, IOmin ；
6.取上清液(約400ul)移至一個(gè)新的1.5mL離心管中，并加入2倍體積的無(wú)水乙醇， 顛倒混勻，在_20°C放置30min ；
7.將離心機(jī)降溫，在4°C條件下12500rpm離心IOmin；
8.沉淀用70%乙醇洗二次，7500rpm離心2min，將70%乙醇倒，空甩，用移液槍吸棄殘 存的乙醇，然后在37°C烘箱中烘干20min左右；
12.將DNA溶于50-100ul無(wú)菌水中，4°C保存。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR操作步驟如下
1.先在PCR板每個(gè)孔中，加入DNA模板；
2.配制混合物取一新的Eppendorf管，將除DNA模板以外的其它試劑按照所需要的 總量混合在一起形成混合物，其試劑加入順序?yàn)闊o(wú)菌水、PCR反應(yīng)緩沖液、引物、dNTP，最 后加Taq DNA聚合酶。；
3.分裝混合物將配制的混合物混勻后分裝到PCR板每個(gè)孔中；
4.混勻，在離心機(jī)上甩一下，加入一滴石蠟油；
5.將PCR板放入PCR儀中，按所需程序操作，PCR反應(yīng)體系
DNA模板2PL
IOXPCR反應(yīng)緩沖液2PL
上游引物(IOmM)0. 2μ
下游引物(IOmM)0. 2μ
dNTP (IOmM each)0. 4μ
Taq DNA 聚合酶(5υ/μ1)0. 2μ
無(wú)菌水15μ
6.植物DNA的酶切、電泳均按常規(guī)方法進(jìn)行。
實(shí)施例四轉(zhuǎn)基因玉米種子中賴(lài)氨酸含量檢測(cè)選取3個(gè)株系TO代轉(zhuǎn)基因玉米株系，測(cè)定其賴(lài)氨酸和蛋白質(zhì)在種子干重中的百分含 量。測(cè)定結(jié)果表明與非轉(zhuǎn)基因苗相比，轉(zhuǎn)高賴(lài)氨酸基因的轉(zhuǎn)基因株系其賴(lài)氨酸和蛋白質(zhì)的 含量都有較大幅度的提高，提高幅度分別為32. 26% 48. 39%和37. 94% 49. 93%。測(cè)定結(jié) 果如表1所示
表1 TO代部分轉(zhuǎn)基因玉米株系賴(lài)氨酸和蛋白質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā) 明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在 不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)提取馬鈴薯花粉高賴(lài)氨酸基因Sb401總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成CDNA；(2)以上述cDNA為模板，以特異引物克隆馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401；(3)將馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401與亞克隆載體pGSI連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因sb401亞克隆載體質(zhì)粒；(4)將上述克隆質(zhì)粒構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300，獲得含高賴(lài)氨酸基因sb401片 段重組表達(dá)載體CUB-sb401。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述馬鈴薯高賴(lài)氨酸基因SB401具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述特異引物序列如下上游弓I物 Fl: 5' -ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；下游弓I物 Rl: 5' -gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'。
4.權(quán)利要求1所述高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401植物表達(dá)載體在玉米育種上的應(yīng)用，其特 征在于，采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含高賴(lài)氨酸基因sb401片段重組表達(dá)載體CUB-sb401導(dǎo) 入玉米愈傷組織，經(jīng)過(guò)侵染、恢復(fù)、選擇、再生、煉苗等階段，獲得轉(zhuǎn)基因苗。
5.權(quán)利要求1所述高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401植物表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因植物高賴(lài)氨酸 中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明涉及高賴(lài)氨酸蛋白基因Sb401表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用。旨在解決將外源高賴(lài)氨酸蛋白基因?qū)胫仓曛胁⒏咝Р⒏咝П磉_(dá)的技術(shù)難題。該方法將采用提取馬鈴薯的RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得馬鈴薯全長(zhǎng)CDNA，用PCR方法獲得sb401基因，并將該基因重組后克隆到植物雙元表達(dá)載體中；通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將該基因?qū)胗衩谆蚪M，并獲得表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，并高效表達(dá)，可以提高玉米賴(lài)氨酸的含量，進(jìn)而提高玉米的品質(zhì)；本發(fā)明方法費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、同時(shí)具有轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102071216SQ20101057255
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者盧彩霞, 孫靜, 岳潤(rùn)清, 朱衛(wèi)紅, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 齊建雙 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院