專利名稱：一種誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于心肌組織再生工程領(lǐng)域。具體涉及一種誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化 的誘導(dǎo)因子和含有該誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以及利用該誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS細(xì) 胞向心肌分化的方法。
背景技術(shù)：
多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)，具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，對于 再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、疾病模型及其發(fā)育生物學(xué)的研究都有重要意義。2006年，日本學(xué)者 (Kazutoshi Takahashi 等· Cell 2006，126 :1-14)通過導(dǎo)入 KLF4、0CT4、S0X2 和 C-MYC 四 種基因的細(xì)胞重編程技術(shù)，將正常體細(xì)胞動(dòng)物成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成與胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀 高度相似的多能干細(xì)胞，被稱為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞anduced poluroipotent stem cells, iPS)。iPS細(xì)胞除具有胚胎干細(xì)胞較高的多能性外，還避開了胚胎干細(xì)胞所存在的倫理爭端 以及免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，因此成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。iPS細(xì)胞也已成為心肌組織工程 研究中新的、具有巨大應(yīng)用前景的種子細(xì)胞來源。已報(bào)道的有關(guān)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化方法，一種是將小鼠iPS細(xì)胞分化 Flk+細(xì)胞，經(jīng)流式分選Flk+細(xì)胞，并將其與0P9細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的方法 (Genta Narazaki 等.Circulation 2008 ； 11 8 ;498_506)，此方法操作過程繁瑣且效果不 佳。另一種是利用“懸滴法”將小鼠iPS細(xì)胞形成EBs，隨后利用基于IMDM的分化培養(yǎng)基 誘導(dǎo) iPS-EBs 向心肌細(xì)胞分化(Christina Mauritz 等.Circulation 2008 ；11 8 ；507-5 1 7)，此種方法效果較好(分化率50%左右)，但是“懸滴”的制作過程復(fù)雜，不適用于大 量的心肌細(xì)胞的制備。還有一種是利用低貼壁的細(xì)菌培養(yǎng)皿將人iPS細(xì)胞形成擬胚體 (Embryoid bodies, EBs)，再利用基于DMEM/F12的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS_EBs向心肌細(xì)胞分 化(JianhuaZhang 等.Circ. Res. 2009 ；1 04 ;e30_e41)，此種方法適用于形成大量 EBs，但 是EBs向心肌分化的效率低(1-10%)。由以上可以看出，目前，還沒有一種簡單、高效的誘 導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供抗壞血酸作為誘導(dǎo)因子在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的 用途。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。本發(fā)明第三目的在于提供利用上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分 化的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下抗壞血酸(ascorbic acid)作為誘導(dǎo)因子在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面的應(yīng)用。所述的iPS細(xì)胞來源于小鼠、大鼠、兔、豬、牛、羊、猴或人等。
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所述的抗壞血酸亦稱維生素C、丙素、丙種維生素、維生素丙或維他命C。一種誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，是含有抗壞血酸的擬胚體生長培養(yǎng)基(Embryoidgrowth medium)；所述擬胚體生長培養(yǎng)基是含有體積百分比濃度20%的血清、0. 055mM β -巰基乙 醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的KnockoutDMEM培養(yǎng)基。上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中所述的抗壞血酸的濃度為1 X 10_4 1 X 101。所述的Knockout DMEM培養(yǎng)基可自Gibao公司購買。上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的制備方法，包括將抗壞血酸粉末溶解于KnockoutDMEM培 養(yǎng)基中配制成0. IM的儲備母液，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝后于_20°C凍存，使用 時(shí)用所述的擬胚體生長培養(yǎng)基將抗壞血酸稀釋成濃度為1 X 10_4 1 X IO-3M,所得培養(yǎng)基簡 稱為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面的用途。一種誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法，是利用上述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將 IPS細(xì)胞懸浮生長5-7天形成的擬胚體誘導(dǎo)分化，從而得到心肌細(xì)胞；具體方法如下(l)iPS細(xì)胞的培養(yǎng)利用iPS生長培養(yǎng)基將未分化的小鼠iPS細(xì)胞系在飼養(yǎng)層體系下進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增， 然后將生長至對數(shù)生長期的iPS細(xì)胞以1 6 9的比例進(jìn)行傳代；所述iPS生長培養(yǎng)基 為含有體積百分比為20%的血清、1000U/mL的白血病抑制因子(leukemia inhibitory, LIF)、0. 055mM β -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培
養(yǎng)基；(2)擬胚體(EBs)的形成用質(zhì)量百分比為0. 25%的胰酶消化處理步驟(1)中處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好 的小鼠iPS細(xì)胞，消化時(shí)間為30秒 60秒，然后將其吹散成單細(xì)胞；再用IOml擬胚體生 長培養(yǎng)基重懸，并接種于貼壁性的組織培養(yǎng)皿，然后將其置于37°C、5% CO2孵箱孵育1小 時(shí)，收集未貼壁的細(xì)胞；將所收集的細(xì)胞重懸于擬胚體生長培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，制備成IO5 個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)菌培養(yǎng)皿中，每皿IOmL細(xì)胞懸液，再置于 37°C,5% CO2孵箱培養(yǎng)5 7天，隔天更換新鮮擬胚體生長培養(yǎng)基一次，獲得狀態(tài)最佳的 擬胚體(iPS-EBs)；所述的擬胚體生長培養(yǎng)基為含有體積百分比為20%的血清、0.055mM β -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培養(yǎng)基；(3) iPS-EBs向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化將步驟O)中懸浮生長5 7天的EBs于離心管中，靜置沉淀，去除擬胚體生長培 養(yǎng)基，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸EBs，并將其接種于0. 1 %明膠包被的組織培養(yǎng)皿中，然后置 于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，第三天更換新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，此后隔天更換，誘導(dǎo)分化培 養(yǎng)12 16天，得心肌細(xì)胞；所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有1 X 10_4 1 X IO-3M抗壞血酸的 擬胚體生長培養(yǎng)基。上述方法步驟(1)中所述的飼養(yǎng)層體系中飼養(yǎng)層細(xì)胞的制作參照《細(xì)胞培養(yǎng)》(司 徒鎮(zhèn)強(qiáng)等.細(xì)胞培養(yǎng).世界圖書出版公司，1996年，第114頁)所述的方法進(jìn)行制備。上述方法中所述的細(xì)菌培養(yǎng)皿的直徑為100mm。上述方法中所述的iPS細(xì)胞為小鼠來源的iPS細(xì)胞系，按照常規(guī)方法制備即可。上述方法步驟(3)中誘導(dǎo)分化時(shí)iPS-EBs的接種密度為2-4EBs/cm2。
iPS-EBs向心肌細(xì)胞分化的比率計(jì)算公式為搏動(dòng)的EBs數(shù)量/觀察的EBs總 數(shù) X100%o與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明用抗壞血酸作為iPS細(xì)胞向 心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子，有效促進(jìn)iPS-EBs分化為自發(fā)搏動(dòng)的功能性心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)分 化效率高，分化比率可達(dá)50-60%。；( 本發(fā)明方法簡單、成本低，在普通實(shí)驗(yàn)室均可操作；
(3)本發(fā)明誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基無毒副作用，重復(fù)性與可實(shí)施性強(qiáng)，并且適合于規(guī)模化進(jìn)行；
(4)本發(fā)明可為再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、疾病模型及其發(fā)育生物學(xué)的研究提供大量的iPS來源 心肌細(xì)胞。


圖1.為生長于飼養(yǎng)層細(xì)胞上的未分化的小鼠iPS細(xì)胞顯微照片(100X)。圖2.為iPS細(xì)胞懸浮于細(xì)菌培養(yǎng)皿生長的不同時(shí)間形成的擬胚體顯微照片 (100X)；其中A為2天；B為4天；C為6天；D為8天。圖3.為生長5天的iPS-EBs貼附于明膠包被的組織培養(yǎng)皿分化出的心肌細(xì)胞數(shù)
量柱形圖。圖4.為抗壞血酸的iPS-EBs分化心肌細(xì)胞的免疫組化鑒定顯微照片；其中A圖為 肌節(jié)輔肌動(dòng)蛋白α (α-actinin) (Bar = 50um)，Hechestc33258為細(xì)胞核染料；B圖為心肌 肌鈣蛋白T(cTnT)。圖5.含有不同濃度抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS-EBs向心肌細(xì)胞分化 的最大分化率曲線圖；其中1，2，3，4，5，6分別代表抗壞血酸濃度為0，ΙΟ"7,10_6，10_4，10_4， 101。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但是以下實(shí)施例僅僅是作為例證，并不 對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。以下實(shí)施例中使用的細(xì)胞培養(yǎng)、分化與鑒定所需培養(yǎng)基和試劑的配制1) iPS細(xì)胞生長培養(yǎng)基向Knockout DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司)中添加體 積百分比為 20% 的血清(Gibco)，1000U/mL 的 LIF(chemicon)，0. 055mM β -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸(Gibco)。2)H-DMEM 培養(yǎng)基配制H-DMEM 培養(yǎng)基干粉一袋(Gibco)，2. 4g NaHCO3, 2. 383g HEPES, 10萬單位青霉素，10萬單位鏈霉素，溶解于1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4， 經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C保存。3)擬胚體(EBs)生長培養(yǎng)基添加體積百分比為20 %的血清(Gibco)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培養(yǎng)基 (Gibco) ο4)101^/1^絲裂霉素溶液的配制211^包裝的絲裂霉素1支(Sigma)，溶解于 200ml含體積百分比為10%的血清的H-DMEM培養(yǎng)基中，0. 22 μ m濾膜過濾除菌后，4°C避光
保存?zhèn)溆谩?)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配制稱取抗壞血酸粉末，溶解于Knockout DMEM培養(yǎng)基配制成0. IM的儲備母液，0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝后于_20°C避光凍存，使用時(shí)再用擬胚 體生長培養(yǎng)基稀釋成工作濃度即可。6)PBS 緩沖液稱取 8g NaCl,0. 2g KCl，3· 491g Na2HPO4 · 12Η20，0· 2gKH2P04，溶解 于1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，4°C保存。7)0. 25%胰酶配制稱取0. 25克胰酶粉末(Gibco)，溶解于100ml PBS溶液中，并 添加0. 04克EDTA，充分溶解后，0. 25 μ m濾膜過濾。8)0. 明膠溶液稱取明膠粉末(Sigma)O. 1克，加入到100ml PBS溶液中，121°C 高壓蒸汽滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?) 4%多聚甲醛固定液加熱0. IM的PB溶液500mL至沸騰，加入20g多聚甲醛，攪 拌溶解，調(diào)節(jié)PH值為7. 2-7. 4，過濾除雜質(zhì)，4°C保存。10)心肌細(xì)胞鑒定所需抗體肌節(jié)輔肌動(dòng)蛋白α，心肌肌鈣蛋白Τ，以及相應(yīng)的熒 光標(biāo)記的二抗購自Sigma公司，按照廠家說明書進(jìn)行使用，用于心肌細(xì)胞的鑒定。實(shí)施例1誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的制備(1)擬胚體(EBs)生長培養(yǎng)基的配制向400ml Knockout DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中 添加IOOml血清(Gibco)，0. 055mM β -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸 (Gibco)獲得500ml擬胚體生長培養(yǎng)基；(2)取步驟(1)中的DMEM培養(yǎng)基10ml，將0. 01摩爾量的抗壞血酸粉末溶解于其 中，獲得IM的抗壞血酸儲備母液；(3)將步驟⑵中的IM抗壞血酸儲備母液分別用步驟⑴的培養(yǎng)基稀釋107，IO6, IO5, IO4, IO3倍，分別獲得含10_7，IO-6, IO-5, IO-4, IO-3M抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。實(shí)施例2利用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS-tet_B3細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化試驗(yàn)按照下 述方法進(jìn)行(1)飼養(yǎng)層細(xì)胞(Feeder layer cell)的制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離自孕期14天的昆明白小鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心)的胎兒，以含10%血清(體積百分?jǐn)?shù))的H-DMEM培養(yǎng)擴(kuò)增；用10 μ g/ml絲裂 霉素溶液處理生長狀態(tài)良好的第2 4代成纖維細(xì)胞3. 5小時(shí)，以4-5 X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2接 種于組織培養(yǎng)皿中，即做成飼養(yǎng)層細(xì)胞，次日可用于iPS細(xì)胞的接種；(2)未分化小鼠iPS細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增在步驟(1)的飼養(yǎng)層體系下培養(yǎng)iPS-tet_B3細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海生命研究 院贈(zèng)送。iPS-tet-B3細(xì)胞系的制備方法可參見Jinyan Huang等.CellResearch 2009 ； 19 1127-1138)，待長至對數(shù)生長期，以1 6 9進(jìn)行傳代，選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行下面擬 胚體形成與誘導(dǎo)分化，生長于飼養(yǎng)層上的未分化小鼠iPS細(xì)胞如圖1所示，狀態(tài)良好的iPS 細(xì)胞集落呈圓形或卵圓形，立體感較強(qiáng)；(3)擬胚體(EBs)的形成用0. 25%胰酶消化生長至對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的小鼠iPS細(xì)胞30秒 60秒， 然后用1000 μ L移液槍將其吹散成單細(xì)胞，再用擬胚體生長培養(yǎng)基重懸后接種于組織培養(yǎng) 皿(IX IO7個(gè)細(xì)胞/皿，直徑=100mm)，37°C、5% CO2孵箱孵育1小時(shí)，收集未貼壁的細(xì)胞， 制備成IO5個(gè)細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)移到低貼壁的細(xì)菌培養(yǎng)皿中(直徑=100mm)，每皿 IOml細(xì)胞懸液，置于37°C、5% CO2孵箱，懸浮生長的iPS細(xì)胞經(jīng)聚集、分裂即形成EBs，5_7
6天的EBs形態(tài)學(xué)觀察狀態(tài)最好，生長不同天數(shù)形成的EBs如圖2所示；(4)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS-EBs向心肌細(xì)胞分化以0. 明膠包被組織培養(yǎng)皿；收集(3)中懸浮生長5天的EBs，于離心管中靜置 沉淀，去除擬胚體生長培養(yǎng)基，以含濃度為IO3M抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸EBs，以 2-4EBs/cm2的密度接種于明膠包被的組織培養(yǎng)皿中，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，第三天更 換新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以后隔天更換一次；隨著分化時(shí)間的進(jìn)行，EBs分化出自發(fā)搏動(dòng) 的區(qū)域，并逐漸增多，如圖3所示EBs在抗壞血酸誘導(dǎo)作用下隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)行，分化出 搏動(dòng)區(qū)域的EBs增多，在誘導(dǎo)分化12 16天時(shí)分化率達(dá)到最大；EBs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化 的比率計(jì)算為自發(fā)搏動(dòng)的EBs數(shù)/EBs總數(shù)X 100%。分化比率達(dá)50-60%。(5) iPS細(xì)胞分化心肌細(xì)胞的鑒定用4%多聚甲醛固定的分化14天的ras，經(jīng)0. Triton X-100透化處理30 分鐘，然后分別使用cTnT抗體(使用時(shí)稀釋比例為1 200，Sigma)和α-sarcomeric actinin (使用時(shí)稀釋比例為1 200 ；Sigma)作為一抗，陰性對照組使用PBS代替一抗，置 于4°C，過夜孵育。PBS漂洗:3minX3次，加入二抗，即FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37°C孵 育20min，PBS漂洗;3minX3次；Hoechst33258染核后中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察 (見圖4A、圖4B所示，)分化的細(xì)胞表達(dá)心肌標(biāo)志心肌肌鈣蛋白T，肌節(jié)輔肌動(dòng)蛋白α，并 在高倍鏡下清晰可見肌節(jié)纖維。實(shí)施例3不同生長天數(shù)的EBs向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化比較試驗(yàn)以0. 明膠包被96培養(yǎng)皿，包被方法為將明膠溶液加入培養(yǎng)皿中，覆蓋皿底，靜 置15分鐘后，吸取多余的明膠液體，晾干后置于37°C、5% CO2孵箱備用；收集實(shí)施例2步 驟(3)中懸浮生長3 8天的EBs，于離心管中靜置沉淀，去除擬胚體生長培養(yǎng)基，以含抗 壞血酸濃度10_4M的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸EBs，以1個(gè)EB/孔的密度接種于明膠包被的96孔培 養(yǎng)皿中，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，第三天更換新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以后隔天更換一 次；EBs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比率計(jì)算為自發(fā)搏動(dòng)的EBs數(shù)目/EBs總數(shù)X 100%，隨著 分化時(shí)間的進(jìn)行，EBs分化出自發(fā)搏動(dòng)的區(qū)域，并在大約2周的時(shí)間，自發(fā)搏動(dòng)的EBs數(shù)目 達(dá)到最大值，結(jié)果表明以懸浮生長5-7天的EBs最有利于向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化。實(shí)施例4不同濃度抗壞血酸誘導(dǎo)EBs向心肌細(xì)胞分化的比較試驗(yàn)以0. 1 %明膠包被96孔培養(yǎng)板。收集實(shí)施例2中懸浮生長5天的EBs，于離心管 中靜置沉淀，去除擬胚體生長培養(yǎng)基，分別以含抗壞血酸濃度為0，IO-7, IO-6, IO-5, IO-4, IO-3M 的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(組成成分見實(shí)施例1)重懸EBS，以IEB/孔的密度接種于明膠包被的 96孔培養(yǎng)皿中，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，第三天更換新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以后隔天 更換一次；EBs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比率計(jì)算為自發(fā)搏動(dòng)的EBs/EBs總數(shù)X 100%。隨 著分化時(shí)間的進(jìn)行，EBs分化出自發(fā)搏動(dòng)的區(qū)域，并在大約2周的時(shí)間，自發(fā)搏動(dòng)的EBs數(shù) 目達(dá)到最大值。結(jié)果(見圖5)表明含濃度為10_4-101的抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的誘 導(dǎo)效果最好。
權(quán)利要求
1.抗壞血酸作為誘導(dǎo)因子在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的iPS細(xì)胞來源于小鼠、大鼠、兔、豬、 牛、羊、猴或人。
3.一種誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是含有抗壞血酸的擬胚體 生長培養(yǎng)基；所述擬胚體生長培養(yǎng)基是含有體積百分比濃度20%的血清、0. 055mM β -巰 基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培養(yǎng)基。
4.按照權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸的濃度為 1 X 1(Γ4 1 X 1(Γ3Μ。
5.權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面的用途。
6.權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于將抗壞血酸粉末溶解 于Knockout DMEM培養(yǎng)基中配制成0. IM的儲備母液，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝 后于-20°C凍存，使用時(shí)用所述的擬胚體生長培養(yǎng)基將抗壞血酸稀釋成濃度為1X10—4 1 X 1(Γ3Μ。
7.一種誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法，其特征在于是利用權(quán)利要求3或4 所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將iPS細(xì)胞懸浮生長5-7天形成的擬胚體誘導(dǎo)分化，從而得到心肌 細(xì)胞；具體方法如下(1)利用iPS生長培養(yǎng)基將未分化的小鼠iPS細(xì)胞系在飼養(yǎng)層體系下進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增， 然后將生長至對數(shù)生長期的iPS細(xì)胞以1 6 9的比例進(jìn)行傳代；所述iPS生長培養(yǎng)基 為含有體積百分比為20%的血清、1000U/mL的白血病抑制因子、0. 055mM β -巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培養(yǎng)基；(2)用質(zhì)量百分比為0.25%的胰酶消化處理步驟(1)中處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的 小鼠iPS細(xì)胞，消化時(shí)間為30秒 60秒，然后將其吹散成單細(xì)胞；再用IOml擬胚體生長培 養(yǎng)基重懸，并接種于貼壁性的組織培養(yǎng)皿，然后將其置于37°C、5% 0)2孵箱孵育1小時(shí)，收 集未貼壁的細(xì)胞；將所收集的細(xì)胞重懸于擬胚體生長培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，制備成IO5個(gè)細(xì) 胞/ml的細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)菌培養(yǎng)皿中，每皿IOmL細(xì)胞懸液，再置于37°C、 5% CO2孵箱培養(yǎng)5 7天，隔天更換新鮮擬胚體生長培養(yǎng)基一次，獲得擬胚體；所述的擬胚 體生長培養(yǎng)基為含有體積百分比為20%的血清、0.055mM β-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和 0. ImM非必須氨基酸的Knockout DMEM培養(yǎng)基；(3)將步驟(2)中懸浮生長5 7天的擬胚體于離心管中，靜置沉淀，去除擬胚體生長 培養(yǎng)基，用權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基重懸擬胚體，并將其接種于0. 1 %明膠包被的 組織培養(yǎng)皿中，然后置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，第三天更換新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，此后 隔天更換，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)12 16天，得心肌細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的細(xì)菌培養(yǎng)皿的直徑為100mm。
9.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于其步驟(3)中誘導(dǎo)分化時(shí)擬胚體的接種密 度為2-4個(gè)擬胚體/cm2。
全文摘要
本發(fā)明屬于心肌組織再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了抗壞血酸作為誘導(dǎo)因子在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面的應(yīng)用，以及一種含有抗壞血酸的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。本發(fā)明還公開了利用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法，就是利用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將iPS細(xì)胞來源的、懸浮生長5～7天的擬胚體誘導(dǎo)分化得到心肌細(xì)胞。本發(fā)明利用抗壞血酸作為誘導(dǎo)因子顯著提高了iPS細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的效率，分化比率可達(dá)50-60％；其次，本發(fā)明誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對細(xì)胞沒有毒副作用；此外，本發(fā)明方法簡單、成本低，在普通實(shí)驗(yàn)室均可操作，適合于規(guī)?；M(jìn)行。
文檔編號C12N5/071GK102093977SQ201010572368
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 林秋霞, 段翠密, 王常勇, 王海濱 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所