專利名稱：一株釀酒酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株釀酒酵母菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母菌是一類單細(xì)胞真菌的總稱，并非系統(tǒng)演化分類的單元。酵母菌是人類文明 史中被應(yīng)用得最早的微生物。目前已知有1000多種酵母菌，根據(jù)酵母菌產(chǎn)生孢子(子囊孢 子和擔(dān)孢子)的能力，可將酵母分成三類形成孢子的株系屬于子囊菌或擔(dān)子菌，不形成孢 子但主要通過(guò)芽殖來(lái)繁殖的稱為不完全真菌，或者叫“假酵母”(Kreger-van R，Groningen N Y. The yeasts -.a taxonomic study. Third revisedand enlarged edition[M]. The Netherlands =Elsevier science publishers B. V，1984.)。目前已知大部分酵母被分類到 子囊菌門。酵母菌在自然界分布廣泛，主要生長(zhǎng)在偏酸性的潮濕的含糖環(huán)境中，例如，在水 果、蔬菜、蜜餞的內(nèi)部和表面以及在果園土壤中最為常見(jiàn)(于景芝.酵母生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè) [M],中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005)。酵母營(yíng)專性或兼性好氧生活，目前未知專性厭氧的酵母。 在缺乏氧氣時(shí)酵母進(jìn)行無(wú)氧呼吸，其中發(fā)酵型的酵母可以通過(guò)糖酵解途徑(EMP途徑)將糖 類轉(zhuǎn)化成為丙酮酸，丙酮酸再被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為二氧化碳和乙醇來(lái)獲取能量(王鏡巖，朱 勝庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)(第三版，下冊(cè)).北京高等教育出版社.2002:82)。在酒精工業(yè) 上，利用發(fā)酵型的酵母無(wú)氧呼吸可產(chǎn)乙醇的特點(diǎn)，將酵母可以利用的發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精。乙醇作為可再生能源，可直接作為液體燃料或者同汽油混合使用，燃料乙醇作為 新的燃料替代品，可減少對(duì)不可再生能源-石油的依賴，保障國(guó)家能源的安全。現(xiàn)行酒精工 業(yè)生產(chǎn)采用較多的是發(fā)酵法采用各種含糖(雙糖)、淀粉(多糖)的農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)林業(yè)副產(chǎn) 物為原料，經(jīng)過(guò)水解(即糖化)多糖轉(zhuǎn)化為單糖后發(fā)酵、或直接發(fā)酵雙糖轉(zhuǎn)化為乙醇。淀粉 質(zhì)在淀粉酶類的作用下，水解為葡萄糖，再進(jìn)一步發(fā)酵生成乙醇(馬贊華.酒精高效清潔生 產(chǎn)新工藝[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2003)。廣西地處亞熱帶地區(qū)，非糧經(jīng)濟(jì)作物甘蔗和木薯的種植面積和產(chǎn)量皆為全國(guó)第 一。甘蔗主要用于制糖，糖蜜是甘蔗制糖的副產(chǎn)物，含有大量酵母可發(fā)酵性糖。鮮木薯塊 根的淀粉含量達(dá)30%，木薯淀粉經(jīng)過(guò)α -淀粉酶液化和糖化酶糖化后轉(zhuǎn)化為酵母可發(fā)酵性 糖-葡萄糖。糖蜜和木薯淀粉是酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精的優(yōu)良生產(chǎn)原料。2008年，廣西中糧生物 質(zhì)能源有限公司已在廣西北海建成并投產(chǎn)以糖蜜和木薯為原料年產(chǎn)20萬(wàn)噸燃料乙醇的生 產(chǎn)設(shè)備。另外，廣西還有2家公司較大規(guī)模地以糖蜜和木薯為原料生產(chǎn)乙醇，分別為位于欽 州市的新天德股份有限公司和位于平果縣的平果凱特生物化工股份有限公司。釀酒酵母是酒精工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上常用的微生物菌種。酒精工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)菌株的要 求越來(lái)越高，首先要求酵母菌具有極高的產(chǎn)酒效率，對(duì)發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率高，不造成糖質(zhì)原 料的浪費(fèi)；其次是發(fā)酵液成熟之后酒精含量高，降低蒸餾能耗；再次是發(fā)酵速度快，提高設(shè) 備的利用率，降低生產(chǎn)成本(江寧.生物液體燃料——燃料酒精[J]. Chinese Journal of Nature, 2007, 29(1) 30-33)。限制這三大要求的主要因素是酵母對(duì)高濃度發(fā)酵性糖和酒精的耐受力、對(duì)原料的轉(zhuǎn)化率和對(duì)各種不利發(fā)酵條件(如高溫、低PH和有毒物質(zhì)等)的耐受 力。國(guó)內(nèi)酒精工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的釀酒酵母為湖北安琪酵母股份公司生產(chǎn)的耐高溫活性 干酵母(安琪酵母，簡(jiǎn)稱為AQ)，雖然發(fā)酵特性較好，但也難以滿足工業(yè)上的更高要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株釀酒酵母菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名為ZM1-5，簡(jiǎn)稱釀酒酵 母ZM1-5或ZM1-5，分離自廣西壯族自治區(qū)欽州市果園土壤，已于2010年4月23日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 3761。釀酒酵母ZM1-5可用于生產(chǎn)酒精。用于生產(chǎn)酒精時(shí)，釀酒酵母ZM1-5可以單獨(dú)使用，也可與其它釀酒酵母混合使用。應(yīng)用所述釀酒酵母ZM1-5生產(chǎn)酒精時(shí)，pH值為3-9，溫度為28-42°C。應(yīng)用所述釀 酒酵母ZM1-5生產(chǎn)酒精時(shí)，pH值優(yōu)選為4-5。應(yīng)用所述釀酒酵母ZM1-5生產(chǎn)酒精時(shí)，溫度優(yōu) 選為28-40°C，溫度最優(yōu)選為32°C。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)酒精的方法，是通過(guò)發(fā)酵釀酒酵母ZM1-5，得到酒精。所述方法中，用于發(fā)酵的底物具體可為葡萄糖和/或蔗糖。所述方法中，用于發(fā)酵的底物可為木薯產(chǎn)品(如木薯粉液化醪)、糖蜜和甘蔗汁中 的至少一種。所述發(fā)酵的溫度可為32°C至42°C中的任一溫度，如32°C、37°C、40°C或42°C。所述發(fā)酵起始時(shí)，所述釀酒酵母ZM1-5在發(fā)酵體系中的濃度可為1. 5X IO7至 2. 5 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL，優(yōu)選為 1. 5 X 107-2. 0 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL 或 2. 0 X 107-2. 5 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL,如 1. 5 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL、2. 0 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL 或 2. 5 X IO7 個(gè)細(xì)胞 /mL。釀酒酵母ZM1-5具有以下生理特征(1)在酵母粉蛋白胨瓊脂平板上32°C培養(yǎng) 2-3天，菌落為乳白色、隆起、表面光滑、邊緣整齊；細(xì)胞圓形或橢圓形，無(wú)性繁殖方式為芽 殖；(2)菌株最適生長(zhǎng)和發(fā)酵溫度32°C;pH范圍3-9 ；最適生長(zhǎng)pH4_5 ； (3)該菌株在32°C、 37°C和42°C的生長(zhǎng)速率快于安琪酵母；(4)該菌株能在50%的葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；該菌 株能在含有抑制物1.6mol/L妝(1、16%乙醇、48/1乙酸、20(^8/1^418的￥ 0培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)；(5)應(yīng)用于以木薯粉液化醪、糖蜜和甘蔗汁為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精時(shí)，酒精產(chǎn)量和發(fā)酵效 率比目前工業(yè)生產(chǎn)用安琪耐高溫活性干酵母高。與現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)常用的安琪耐高溫酵母菌比較，酵母菌株ZM1-5具有生長(zhǎng)快、酒 精產(chǎn)量高、耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇和耐酸等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。釀酒酵母ZM1-5可應(yīng)用于以 木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等為原料的濃醪發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝(同步糖化發(fā)酵)中，解決工業(yè)生產(chǎn) 中酵母菌不能耐受高滲透壓、高濃度乙醇和發(fā)酵后期效率低等問(wèn)題，降低酒精工業(yè)生產(chǎn)的 成本。與安琪耐高溫酵母菌相比，釀酒酵母ZM1-5在高溫條件下發(fā)酵具有更高的酒精產(chǎn)量。 酵母菌株ZM1-5用于同步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝中，有望解決濃醪發(fā)酵中底物濃度高(滲透 壓高)、發(fā)酵罐內(nèi)溫度高、發(fā)酵后期酵母菌受高濃度酒精抑制等問(wèn)題。


圖1為ZM1-5和AQ在各種高溫條件下在YPD平板上的照片。圖2為30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度NaCl的YPD平板上的照片。圖3為30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度乙醇的YPD平板上的照片。圖4為30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度乙酸的YPD平板上的照片。圖5為30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度G418的YPD平板上的照片。圖6為30°C時(shí)ZM1-5和AQ在50%葡萄糖的YPD平板上的照片。圖7為ZM1-5和AQ在不同培養(yǎng)溫度下在YPD平板上的形態(tài)；A =AQ在32°C的菌落 形態(tài)；B :ΖΜ1-5在32°C的菌落形態(tài)；C :AQ在37°C的菌落形態(tài)；D :ZM1_5在37°C的菌落形態(tài)； E =AQ在42°C的菌落形態(tài)；F :ΖΜ1-5在42°C的菌落形態(tài)。圖8為ZM1-5和AQ在電子掃描顯微鏡下的形態(tài)；A =AQ在32 °C培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的顯 微形態(tài)；B :ΖΜ1-5在32°C培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的顯微形態(tài)；C =AQ在42°C培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的顯微形態(tài)；D ZM1-5在42°C培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的顯微形態(tài)。圖9為ZM1-5與AQ在不同pH條件下生長(zhǎng)24h的菌體量比較。圖10為ZM1-5與AQ在不同溫度條件下生長(zhǎng)20h的菌體量比較。圖11為ZM1-5與AQ在不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線比較；A =AQ ；B :ZM1_5。圖12為ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵葡萄糖72h后的酒份比較。圖13為ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵蔗糖72h后的酒份比較。圖14為ZM1-5與AQ發(fā)酵木薯粉液化醪結(jié)果分析；A 酒份；B 活菌濃度；C 殘總 糖；D 殘還原糖。圖15為ZM1-5與AQ發(fā)酵甘蔗汁產(chǎn)物結(jié)果分析；A 酒份(滅菌甘蔗汁為底物)；B 酒份(新鮮甘蔗汁為底物)；C 殘?zhí)呛?滅菌甘蔗汁為底物)；D 殘?zhí)呛?新鮮甘蔗汁 為底物)；E =CO2失重(滅菌甘蔗汁為底物)；F =CO2失重(新鮮甘蔗汁為底物)。圖16為ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵甘蔗糖蜜結(jié)果分析；A 酒份；B =CO2失重。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。安琪酵母(AQ，耐高溫活性干酵母)購(gòu)自湖北安琪酵母股 份公司。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。YPD培養(yǎng)基(pH4. 5)酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，固體培養(yǎng)基 含瓊脂15g/L。YPD+50% Glu 培養(yǎng)基(ρΗ4· 5) 固體培養(yǎng)基含瓊脂15g/L。YPD+20% Glu 培養(yǎng)基(ρΗ4· 5) 固體培養(yǎng)基含瓊脂15g/L。YPD+20% Sue 培養(yǎng)基(ρΗ4· 5) 體培養(yǎng)基含瓊脂15g/L。實(shí)施例1、酵母菌株ZM1-5的獲得酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖500g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖200g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、蔗糖200g/L，固
一、酵母菌株ZM1-5的獲得1、樣本采集樣品果園土壤。采集地點(diǎn)廣西壯族自治區(qū)欽州市農(nóng)村。2、酵母菌株的分離采用稀釋涂平板法進(jìn)行分離稱取Ig 土壤于IOOmL三角瓶中，加入IOmL滅菌蒸餾 水，置于28°C、轉(zhuǎn)速為ISOrpm的恒溫?fù)u床震蕩2小時(shí)，取ImL懸濁液稀釋至10入10_2、10_3、 10_4、10_5稀釋度，各稀釋梯度分別取100 μ L涂布YPD平板，置于32°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天 后挑出單菌落。3、酵母菌株的篩選酵母菌的具體篩選步驟如下①觀察平板上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)，并鏡檢其細(xì)胞形態(tài)，對(duì)其中確定為酵母菌的菌落 進(jìn)行純化，純化后作為備選菌株進(jìn)行菌株耐高溫生長(zhǎng)試驗(yàn)；②純化后的菌株分別置于32°C、37°C、42°C培養(yǎng)3_5天，觀察菌體生長(zhǎng)情況，選出 耐高溫酵母菌株。③各耐高溫酵母菌株分別點(diǎn)接于YPD培養(yǎng)基上，32°C培養(yǎng)48小時(shí)，長(zhǎng)出菌落后倒 入TTC上層培養(yǎng)基(紅四氮唑TTC 0.058，葡萄糖0.58，瓊脂1.5g，水IOOmL)，避光保溫 2-3h，選出顯色較深的酵母菌株。 ④TTC篩選得到的酵母菌株分別接入YPD液體培養(yǎng)基中，28。C、ISOrpm搖床過(guò)夜培 養(yǎng)，菌液按OD6tltl = 0. 01的終濃度接入帶有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，分別置于32°C、 37°C、40°C、42°C下培養(yǎng)，分別在12h、24h和48h觀察和記錄杜氏小管中產(chǎn)氣情況，選出產(chǎn)氣 較多的酵母菌株。⑤杜氏發(fā)酵檢測(cè)產(chǎn)氣快且多的菌株接入50mLYPD液體培養(yǎng)基，28°C、ISOrpm搖床 培養(yǎng)24h，按10%的接種量(體積百分含量)接入裝有IOOmL含YPD+20%Glu液體培養(yǎng)基 的250mL三角瓶，發(fā)酵72h后蒸餾檢測(cè)其酒精產(chǎn)量。⑥酵母菌在各種培養(yǎng)基上的抗逆性生長(zhǎng)檢測(cè)采用休止細(xì)胞梯度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，將酵母菌接種于20mL的YPD液體培養(yǎng)基中， 32 0C培養(yǎng)12h (OD600 = 0 . 7)，離心收集菌體，制備休止細(xì)胞。調(diào)節(jié)菌液濃度為0D_ = 1.0，并稀釋至IOciUO-1UO-2UO-3UO-4的濃度，分別取4μ1點(diǎn)接于各種高滲透壓培養(yǎng)基 [YPD+NaCl (1. 2mol/L, 1. 4mol/L, 1. 6mol/L)，YPD+50 % Glu]平板，以及 YPD+ 乙醇(12%, 14%,16% ), YPD+ 乙酸(3g/L, 4g/L), YPD+G418 (100 μ g/L, 200 μ g/L)平板，經(jīng) 32°C 培養(yǎng) 2-3天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。本段中的％均為體積百分含量。通過(guò)以上分離和篩選，得到33株酵母菌，其中一株各方面性狀良好，將其命名為 菌株ZM1-5。ZM1-5和AQ在各種高溫條件下在YPD平板上的照片見(jiàn)圖1。30°C時(shí)ZM1-5和AQ 在各種濃度NaCl條件下在YPD平板上的照片見(jiàn)圖2。30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度乙醇 條件下在YPD平板上的照片見(jiàn)圖3。30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度乙酸條件下在YPD平板 上的照片見(jiàn)圖4。30°C時(shí)ZM1-5和AQ在各種濃度G418條件下在YPD平板上的照片見(jiàn)圖5。 30°C時(shí)ZM1-5和AQ在50%葡萄糖條件下在YPD平板上的照片見(jiàn)圖6。二、釀酒酵母ZM1-5的鑒定
ZM1-5 分別在 YPD 平板上 32°C、37°C、42°C培養(yǎng) 2 天，32°C、37°C 生長(zhǎng)旺盛，42°C也 能生長(zhǎng)。菌落為乳白色、隆起、表面光滑、邊緣整齊(見(jiàn)圖7)。顯微鏡下細(xì)胞圓形或橢圓形， 無(wú)性繁殖方式為多邊芽殖(見(jiàn)圖8)。ZM1-5可同化果糖、棉子糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、蜜二糖、海藻糖、松三糖、 α-甲基D葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；ΖΜ1-5可同化硫酸銨、硝酸鉀；ΖΜ1-5可發(fā)酵葡萄糖、 蔗糖、麥芽糖、半乳糖，不可發(fā)酵乳糖。根據(jù)ΖΜ1-5的形態(tài)與生理生化特征，參考《The Yeast))和《常見(jiàn)與常用真菌》，將 ZM1-5鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。將釀酒酵母ZM1-5保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3761。實(shí)施例2、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長(zhǎng)pH值的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進(jìn)行處理，確定最適生長(zhǎng)pH 值。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過(guò)夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01終濃度將菌液接入不同pH值(3、4、5、6、7、8或9)的YPD液體培 養(yǎng)基中，28°C、ISOrpm培養(yǎng)24小時(shí)，用分光光度計(jì)于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(0D_值)。設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ生長(zhǎng)24h的菌體量比較見(jiàn)圖9。釀 酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長(zhǎng)pH均為4-5。實(shí)施例3、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長(zhǎng)溫度的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進(jìn)行處理，確定最適生長(zhǎng)溫度。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過(guò)夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01終濃度將菌液接入YPD液體培養(yǎng)基(pH4. 5)中，不同溫度(28°C、 32°C、35°C、37°C、40°C或 42°C )、180rpm 培養(yǎng) 20 小時(shí)，檢測(cè)菌液的 OD600 值。設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度條件下生長(zhǎng)20h的菌體 量比較見(jiàn)圖10。釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長(zhǎng)溫度均為32°C，釀酒酵母ZM1-5 在28-42°C溫度下生長(zhǎng)量均比安琪酵母AQ高。實(shí)施例4、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ在不同溫度下生長(zhǎng)曲線的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進(jìn)行處理，比較不同溫度下的 生長(zhǎng)曲線。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過(guò)夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的0D_值。2、按0D_ = 0.01終濃度將菌液接入YPD液體培養(yǎng)基(pH4. 5)中，分別不同溫度 (281、321、351、371、401或42°0、180卬111培養(yǎng)72 小時(shí)，分別在 4h、16h、22h、28h、48h、 68h取樣，檢測(cè)菌液的0D_值。設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線比 較見(jiàn)圖11。兩者于22h基本達(dá)到穩(wěn)定期，22h之后安琪酵母AQ在32°C時(shí)的生長(zhǎng)曲線趨于平 穩(wěn)，而釀酒酵母ZM1-5在22h后仍趨于緩慢生長(zhǎng)階段。兩株菌均在32°C時(shí)生長(zhǎng)最快，菌量最 多。在42°C，釀酒酵母ZM1-5存活能力明顯高于安琪酵母AQ，說(shuō)明釀酒酵母ZM1-5比安琪 酵母AQ有更強(qiáng)的耐受高溫的能力。實(shí)施例5、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ發(fā)酵葡萄糖的比較將酵母菌菌液(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Glu液體培養(yǎng)基，接種量為1.5X107個(gè)/mL(終濃度)，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下發(fā)酵，發(fā)酵72h后取發(fā)酵液測(cè)酒精度(酒份)。酒精度檢測(cè)方法取IOOml發(fā)酵液加入IOOmL蒸餾水，混勻后加熱蒸餾。收集 IOOmL餾出液，加入蒸餾水IOOmL,混勻，用酒精計(jì)測(cè)定酒精度，溫度計(jì)測(cè)定混合液溫度；得 到的值查酒度溫度校正表?yè)Q算成20°C時(shí)的酒精度％ (體積百分含量)，再乘以2，即得發(fā)酵 液的酒精度。設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵葡萄糖72h后的 酒份比較見(jiàn)圖12。釀酒酵母ZM1-5在32°C時(shí)酒份達(dá)到最高(11. 3% )，37°C時(shí)酒份稍低 (10.8% )，40°C時(shí)酒份為10. 5%，42°C時(shí)酒份為7.4%0安琪酵母AQ，40°C時(shí)酒份為9.9%, 42°C時(shí)酒份為6. 7%。40°C、42°C時(shí)釀酒酵母ZM1-5酒份均顯著高于安琪酵母AQ，說(shuō)明釀酒 酵母ZM1-5高溫下利用葡萄糖產(chǎn)酒能力比安琪酵母AQ更強(qiáng)。實(shí)施例6、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ發(fā)酵蔗糖比較將酵母菌菌液(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Sue液體 培養(yǎng)基，接種量為1.5X107個(gè)/mL(終濃度)，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下發(fā)酵，發(fā)酵72h取發(fā)酵液測(cè)酒精度(酒份)。酒精度檢測(cè)方法同實(shí)施例5。設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵蔗糖72h后的酒份 比較見(jiàn)圖13。兩個(gè)菌株均是在32°C發(fā)酵時(shí)酒份最高，37°C、40°C時(shí)酒精產(chǎn)量稍低。42°C時(shí)， 釀酒酵母ZM1-5的酒份顯著高于安琪酵母AQ，說(shuō)明了釀酒酵母ZM1-5高溫下利用蔗糖產(chǎn)酒 能力比安琪酵母AQ更強(qiáng)。實(shí)施例7、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用木薯粉液化醪發(fā)酵產(chǎn)酒精比較木薯粉液化醪廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，每IOOmL醪液含27g總糖。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養(yǎng)基中28°C、180rpm 搖床培養(yǎng)約24h，使活菌濃度達(dá)到OD6tltl = 2. 0以上，于顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度。2、分別按1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/mL，2. OXlO7個(gè)細(xì)胞/mL，2. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/mL的接種 量(終濃度)將菌液接入9個(gè)裝有500mL木薯粉液化醪的IL三角瓶中(每個(gè)接種量3瓶)， 32°C培養(yǎng)70小時(shí)，得到發(fā)酵液。3、測(cè)定發(fā)酵液中各種成分(酒精，活菌數(shù)、殘總糖、殘還原糖)的含量。酒精度檢測(cè)方法同實(shí)施例5。活菌數(shù)檢測(cè)方法(平板計(jì)數(shù)法)以10倍為梯度稀釋發(fā)酵液，各梯度取100 μ 1涂 布YPD平板三塊，32°C恒溫培養(yǎng)2-3天，依次觀察涂布各個(gè)稀釋液的平板，用涂布最大稀釋 度的稀釋液且有單菌落生長(zhǎng)的平板進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算生長(zhǎng)的單菌落個(gè)數(shù)(能生長(zhǎng)菌落的最大 稀釋度的平板上)；計(jì)算公式活菌數(shù)/ml =(三塊平板上生長(zhǎng)的單菌落個(gè)數(shù)/3) XlOX稀
釋倍數(shù)。殘總糖的測(cè)定①取ImL發(fā)酵液加入5mL ddH20、ImL濃鹽酸；②于沸水中反應(yīng) 20min后于冷水中冷卻；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微紅，最后將溶液定容 至IOOmL,得到反應(yīng)液；④取400 μ L的反應(yīng)液加入800 μ L DNS溶液(四水合酒石酸鉀鈉 200g，氫氧化鈉10g，無(wú)水亞硫酸鈉0. 5g，結(jié)晶酚2g，DNS 10g，蒸餾水1L，室溫避光靜置7天 后可用)，沸水浴5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標(biāo)板，OD540處測(cè)值；⑤所得的值代入葡萄 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線即得還原糖的量(殘總糖的量)。
殘還原糖的測(cè)定①取ImL發(fā)酵液加入19mL ddH20,混勻；②取400 μ L混勻液加 入800 μ L的DNS溶液，沸水浴煮5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標(biāo)板，OD540處測(cè)值；③所 得的值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線即得還原糖的量(殘還原糖的量)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果見(jiàn)圖14。在接種量為2. 0X IO7個(gè)/mL時(shí)，釀酒酵母ZM1-5發(fā)酵的酒份最高，達(dá)到15. 2%，比 安琪酵母 AQ 高 0. 8% (t-test, ρ < 0. 05)。在各個(gè)接種量，釀酒酵母ZM1-5的活菌數(shù)均比安琪酵母AQ顯著高；在接種量為
1.5X IO7個(gè)細(xì)胞/mL并經(jīng)過(guò)70小時(shí)的發(fā)酵后，釀酒酵母ZM1-5增殖到3. 20X IO8個(gè)/mL活 菌濃度；說(shuō)明釀酒酵母ZM1-5在濃醪、高酒精環(huán)境下能較好地存活。釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ在接種濃度為2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)的殘總糖 量比其它兩個(gè)接種量低，說(shuō)明接種量為2. OX IO7個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)發(fā)酵效果最好；在接種量為
2.OX IO7個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，釀酒酵母ZM1-5的殘總糖量和殘還原糖量分別比安琪酵母AQ低 0. 2g/100mL和 0. 09g/100mL。實(shí)施例8、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用甘蔗汁發(fā)酵產(chǎn)酒精比較1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養(yǎng)基中28°C、180rpm 搖床培養(yǎng)約24h，使活菌濃度達(dá)到OD6tltl = 2. 0以上。2、取IOmL步驟1的菌液接入裝有IOOmL甘蔗汁(新鮮糖蔗壓榨取得，總糖含量為 18% )的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C、或42°C )下培養(yǎng)70小時(shí)， 得到發(fā)酵液。3、取IOmL步驟1的菌液接入裝有IOOmL滅菌甘蔗汁(新鮮糖蔗壓榨取得，總糖含 量為18%，分裝三角瓶后121°C滅菌20分鐘)的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度(32°C、 37°C、40°C、或42°C )下培養(yǎng)70小時(shí)，得到發(fā)酵液。4、測(cè)定步驟2和步驟3的發(fā)酵液的二氧化碳失重以及發(fā)酵液中各種成分(酒精、 殘總糖)的含量。二氧化碳失重發(fā)酵前后發(fā)酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度檢測(cè)方法同實(shí)施例5。殘總糖的測(cè)定方法①取ImL發(fā)酵液加入3mL ddH20和ImL的濃鹽酸； ②66°C -68°C反應(yīng)IOmin后于冷水中冷卻；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微 紅，最后將溶液定容至10mL，得到反應(yīng)液；④取400 μ L反應(yīng)液加入800 μ L的DNS溶液；⑤ 沸水浴煮5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標(biāo)板，OD54tl處測(cè)值；⑥所得的值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn) 曲線即得還原糖的量(殘總糖的量)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。釀酒酵母ΖΜ1-5與安琪酵母AQ發(fā)酵甘蔗汁產(chǎn) 物結(jié)果分析見(jiàn)圖15。滅菌后的甘蔗汁酒精發(fā)酵，釀酒酵母ΖΜ1-5與安琪酵母AQ的酒精產(chǎn)量 在32°C時(shí)相當(dāng)(10. )，釀酒酵母ZM1-5在37°C (10·3%)和42°C (7. 1% )時(shí)的酒精產(chǎn) 量均高于AQ的(10%，6. 5%) ；40°C和42°C時(shí)釀酒酵母ZM1-5的殘總糖含量比AQ的低。在 新鮮甘蔗汁的酒精發(fā)酵中，釀酒酵母ZM1-5在32°C時(shí)酒份為10. 1%、42°C時(shí)酒份為7. 6%， 安琪酵母AQ在32°C時(shí)酒份為9. 6%、42°C時(shí)酒份為7%，釀酒酵母ZM1-5的酒份均比安琪酵 母AQ的高；32°C和37°C時(shí)，釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的殘總糖含量都相當(dāng)?shù)停?0°C和 42°C時(shí)，釀酒酵母ZM1-5殘總糖含量低于安琪酵母AQ的。新鮮蔗汁發(fā)酵中，釀酒酵母ZM1-5的CO2失重在42°C顯著高于安琪酵母AQ的。結(jié)果表明，釀酒酵母ZM1-5在新鮮蔗汁中發(fā)酵 比在滅菌蔗汁中發(fā)酵效果好，且殘?zhí)呛康?，如果?yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，將可以節(jié)省大量能源。實(shí)施例9、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用糖蜜發(fā)酵產(chǎn)酒精比較1、糖蜜與自來(lái)水1 2體積比稀釋、混勻，pH調(diào)至4.0，即為糖蜜培養(yǎng)基。2、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養(yǎng)基中28°C、180rpm 搖床培養(yǎng)約24h，使活菌濃度達(dá)到OD6tltl = 2. 0左右。3、取IOmL菌液接入含IOOmL糖蜜培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度 (321、371、401或421)培養(yǎng)70小時(shí)，得到發(fā)酵液。4、測(cè)定步驟3的發(fā)酵液的二氧化碳失重以及發(fā)酵液的酒精度。二氧化碳失重發(fā)酵前后發(fā)酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度檢測(cè)方法同實(shí)施例5。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發(fā)酵甘蔗糖蜜結(jié)果 分析見(jiàn)圖16。釀酒酵母ZM1-5在不同溫度下的酒精度和二氧化碳失重均明顯比安琪酵母 AQ高，說(shuō)明它可以糖蜜為底物進(jìn)行發(fā)酵，且發(fā)酵結(jié)果較安琪酵母AQ好。
權(quán)利要求
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1 5，它的保藏編號(hào)為CGMCC No.3761。
2.權(quán)利要求1所述釀酒酵母ZM1-5在生產(chǎn)酒精中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用所述釀酒酵母ZM1-5時(shí)，pH值為3-9， 溫度為28-42°C ；應(yīng)用所述釀酒酵母ZM1-5時(shí)，pH值優(yōu)選為4_5 ；應(yīng)用所述釀酒酵母ZM1-5 時(shí)，溫度優(yōu)選為28-40°C，溫度最優(yōu)選為32°C。
4.一種生產(chǎn)酒精的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1所述釀酒酵母ZM1-5，得到酒Ib ο
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于發(fā)酵的底物為葡萄糖和/ 或蔴糖。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于發(fā)酵的底物為木薯、糖蜜 和甘蔗汁中的至少一種。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為32°C至42°C。
8.如權(quán)利要求4至7中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵起始時(shí)，權(quán)利要求1所 述釀酒酵母ZM1-5在發(fā)酵體系中的濃度為1. 5 X IO7至2. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/mL。全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株釀酒酵母菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1-5 CGMCC No.3761。釀酒酵母ZM1-5可用于生產(chǎn)酒精。酵母菌株ZM1-5具有生長(zhǎng)快、酒精產(chǎn)量高、耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇和耐酸等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于以木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等為原料的濃醪發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝(同步糖化發(fā)酵)中，解決工業(yè)生產(chǎn)中酵母菌不能耐受高滲透壓、高濃度乙醇和發(fā)酵后期效率低等問(wèn)題，降低酒精工業(yè)生產(chǎn)的成本。酵母菌株ZM1-5用于同步糖化發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝中，有望解決濃醪發(fā)酵中底物濃度高(滲透壓高)、發(fā)酵罐內(nèi)溫度高、發(fā)酵后期酵母菌受高濃度酒精抑制等問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12R1/865GK101962620SQ20101051266
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者馮家勛, 羅雪梅 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)