專利名稱：重組載體以及轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及重組載體以及轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
機(jī)體損傷修復(fù)的機(jī)制是必須先有微血管的生成，隨后形成新生的肉芽組織，然后才能輸入所需的各種細(xì)胞和營養(yǎng)成分，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。血管新生是一個復(fù)雜的、有步驟、有序的過程，不僅需要刺激因素的激發(fā)，諸多細(xì)胞的參與，還需要各種細(xì)胞因子、生長因子的參與以及細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)作。Ang-1、VEGF、FGF、PDGF對傷口肉芽組織形成、血管增生和膠原纖維合成有重要作用。VEGF是由兩個相同亞基以二硫鍵交聯(lián)結(jié)合成的二聚體糖蛋白，分子量40-45KD， 其基因位于染色體6p21. 3，全長141Λ，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，由于其mRNA的剪接方式不同，形成多種存在形式，其中VEGF121和VEGF165為分泌性可溶性蛋白，可通過與鄰近的血管內(nèi)皮受體結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和增加血管通透性的作用。血管新生中，VEGF及其受體被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性最高的關(guān)鍵調(diào)控因子。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，在體內(nèi)可以誘導(dǎo)血管發(fā)生。近年來，在血管新生過程中Ang-I及受體Tie2對新生血管的形成、重塑、成熟等的重要調(diào)節(jié)作用正逐漸受到關(guān)注。Ang-I和VEGF在血管的再生中二者協(xié)同發(fā)揮作用，VEGF作用于血管形成的早期，可促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成，而Ang則作用于隨后的血管改建、塑形， 促進(jìn)形成成熟且有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)，因而VEGF和Ang-I雙基因共表達(dá)的基因治療有可能是促進(jìn)血管新生的創(chuàng)新探索。目前，雙基因共表達(dá)載體的構(gòu)建策略主要有1.基因之間以IRES (internal ribosome entry site)(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)序列連接；2.雙啟動子表達(dá)載體；3.剪切載體；4.基因之間以Furin的切割靶點序列連接；5.基因之間以2A序列連接；6.表達(dá)融合基因。基因之間以IRES (internal ribosome entry site)(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)序列連接，該IRES序列及與之相連的基因可同時轉(zhuǎn)錄，并以不依賴帽的方式啟動遠(yuǎn)端mRNA的翻譯，從而在同一個轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白；基因之間插入polyA-promotoHCMV)雙啟動子表達(dá)盒構(gòu)建雙基因共表達(dá)載體，帶有polyA-promotoHCMV)各自獨立啟動子的兩個表達(dá)盒構(gòu)建于一個載體上，雙基因各自獨立轉(zhuǎn)錄出兩種不同的mRNA，并各自獨立翻譯出不同的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知腺病毒載體是一類很有應(yīng)用前景的基因治療病毒載體，腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，腺病毒載體與其他載體相比有如下許多優(yōu)點1.宿主范圍廣，對人致病性低；2.具有感染率高、對分裂和非分裂細(xì)胞都能感染；3.能攜帶很長的治療基因和同時表達(dá)多個基因；4.不整合到染色體中，無插入致突變性，安全性好；5.能有效進(jìn)行增殖，滴度高，易加工制備等。采用PAdEasy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有明顯優(yōu)點1.腺病毒質(zhì)粒的同源重組可在大腸桿菌BJ5183中高效進(jìn)行，且細(xì)菌繁殖快，同源重組能力強(qiáng)，因而從根本上克服細(xì)胞內(nèi)同源重組率低的缺陷；2.腺病毒中可插入111Λ的基因片段或同時插入多個基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP報告基因，非常便于監(jiān)測病毒包裝成功與否、 檢測病毒滴度及感染效率等。所有這些都避免了病毒的空斑克隆純化過程，大大減少了病毒的制備時間。構(gòu)建雙基因共表達(dá)重組轉(zhuǎn)移載體是作為腫瘤的基因治療藥物的有效途徑之一，但到目前為止，國內(nèi)外沒有關(guān)于利用IRES策略構(gòu)建VEGF和Ang-I雙基因載體的報道；另外， 利用構(gòu)建polyA+promoter雙啟動子策略構(gòu)建雙基因重組轉(zhuǎn)移載體，雖然理論有相關(guān)研究， 實踐中卻并沒有相關(guān)報道，而且該方法存在以下難點在利用在構(gòu)建polyA+promoter雙啟動子策略構(gòu)建雙基因重組轉(zhuǎn)移載體的過程中，發(fā)現(xiàn)PolyA中有pacl酶切位點，無法采用 pad酶切線性化后在細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒包裝，影響雙基因的正常表達(dá)。絲素蛋白膜作為一種新型醫(yī)用生物材料，具有無毒性、無刺激性、透濕性好等許多優(yōu)異性能，可以用作傷口敷料，也可用作組織修復(fù)的支架材料，甚至可以開發(fā)成人工皮膚。 而如何使支架材料充足血管化，進(jìn)一步開發(fā)和制備血管誘生絲素蛋白基支架材料聯(lián)合MSC 的小口徑人工血管仍未見進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供基因表達(dá)效率高，血管誘導(dǎo)能力強(qiáng)的VEGF165及Ang-I 的重組載體。本發(fā)明提供的VEGF165與Ang-I雙轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-VEGF165_Poly A-promoter-Ang-1，其保藏號為CCTCCM 2010221。所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的基因VEGF165在Genebank中登錄號為AF016050. 1，基因Ang-I公開在 NCBI Reference Sequence :NM_001146. 3 中。本發(fā)明還提供所述重組質(zhì)粒M 2010221與腺病毒pAdEasy-Ι同源重組，在 QBI-293A 細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒 Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l。本發(fā)明提供的VEGF165與Ang-I雙轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒 pA(Trrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-l，其保藏號為；CCTCCM 2010220。本發(fā)明還提供所述重組質(zhì)粒M 2010220與腺病毒pAdEasy-Ι同源重組，在 QBI-293A細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒Ad-VEGF165-IRES-Ang-1。通過在Ad-polyA+promoter 及 Ad-IRES 空載體間亞克隆入 Ang-I 和 VEGF165 構(gòu)建Ang-I和VEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒表達(dá)載體。PCR、酶切及基因測序表明 polyA-promoter/IRES介導(dǎo)的Ang-I和VEGF165雙基因共表達(dá)載體構(gòu)建成功；RT-PCR結(jié)果表明，上述Ang-I和VEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒載體均能介導(dǎo)外源性Ang-I和VEGF165 基因的轉(zhuǎn)錄，成功獲得了 Ang-I和VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒。ELISA結(jié)果證實，不僅polyA-promoter比IRES介導(dǎo)的雙基因表達(dá)效率高，而且還進(jìn)一步證明了在用腺病毒表達(dá)載體中Ang-I和VEGF165基因位于IRES或PolyA-promoter 下游基因的表達(dá)量均明顯低于上游基因表達(dá)量。本發(fā)明還提供所述重組腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l、 Ad-VEGF165-IRES-Ang-1在制備促血管生長藥物中的應(yīng)用。
兔角膜緣注射本發(fā)明所述重組腺病毒Ad—VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l及 Ad-VEGF165-IRES-Ang-1能成功誘導(dǎo)角膜新生血管形成，在腺病毒表達(dá)載體中，VEGF165 基因位于IRES或polyA-promoter上游比位于其下游時能更好的誘導(dǎo)角膜新生血管形成。 這一結(jié)果與ELISA所檢測到的Ang-I及VEGF165細(xì)胞因子表達(dá)水平也基本一致。兔角膜緣注射重組腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l 及 Ad-VEGF165-IRES-Ang-1能成功誘導(dǎo)角膜新生血管形成，且前者比后者效果更為顯著，而無論是IRES載體還是polyA-promoter載體，VEGF165基因位于載體下游時則不能很好的誘導(dǎo)角膜新生血管形成。這可能與VEGF165基因位于載體下游時的表達(dá)量的高低有關(guān)。因為血管生成是多種正、負(fù)性調(diào)節(jié)因子直接或間接作用的結(jié)果，VEGF/VEGFR、Ang/Tie 2只有在空間、時間和數(shù)量上進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)才能形成有功能的血管，VEGF165作用于血管形成早期，促進(jìn)原始血管網(wǎng)形成，而Angl則作用于隨后的血管改建、塑形，促進(jìn)形成成熟、 有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)。VEGF在此過程中起主要作用，Angl則起到協(xié)同作用。當(dāng)VEGF165 位于載體下游時，表達(dá)量很低，僅為上游基因表達(dá)量30% _40%，所以兔角膜邊緣注射 Ad-Ang-1 -po 1 yA-promoter-VEGF 165, Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 —月后，幾乎未見角膜新生血管生成，結(jié)果不能很好的誘導(dǎo)角膜新生血管形成。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜的方法，包含以下步驟將骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于絲素膜上，加入所述重組腺病毒 Ad-VEGF 16 5-Po 1 yA-pr omo t er-Ang-1 或 Ad-VEGF165-IRES_Ang-l，所述再生絲素膜每平方厘米上骨髓基質(zhì)細(xì)胞濃度為0. 5X IO5--I X IO5,重組腺病毒接種量為20-30M0I，于37°C， 5% CO2條件培養(yǎng)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Marrow stromal cells，MSC)具有典型的干細(xì)胞特點，有多向分化潛能和強(qiáng)大的增殖能力，骨髓基質(zhì)細(xì)胞取材方便，可在細(xì)胞培養(yǎng)時利用該細(xì)胞貼壁生長的特性將其分離純化，而造血細(xì)胞在換液時逐步被清除，便于自體移植。作為優(yōu)選，所述骨髓基質(zhì)細(xì)胞處于對數(shù)生長期。作為優(yōu)選，所述骨髓基質(zhì)細(xì)胞為原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞濃度1 X IO8LA作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)時間為48-72小時。本發(fā)明還提供所述方法制備的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜。本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜在制備制備血管誘導(dǎo)性的醫(yī)用生物材料的應(yīng)用。絲素膜是由絲素蛋白經(jīng)物理或化學(xué)方法合成一種生物相容性很好的新型醫(yī)用生物材料，不僅無細(xì)胞毒性，對種子細(xì)胞遺傳學(xué)特性無影響，對細(xì)胞周期和凋亡沒有不良影響，對機(jī)體也不引起炎癥反應(yīng)，不引起溶血，而且表現(xiàn)出卓越的生物相容性，細(xì)胞在絲素材料上能很好的粘附、擴(kuò)增和增殖，利于內(nèi)皮化形成血管樣組織，體內(nèi)試驗?zāi)苄迯?fù)骨缺損和愈合皮膚創(chuàng)傷。在本發(fā)明的實施例中，絲素膜是物理交聯(lián)再生絲素膜，家蠶絲素是由乙氨酸、 丙氫酸、絲氨酸等18種氨基酸所組成的天然蛋白質(zhì)，將家蠶絲用Na2CO3溶液脫膠， CaCl2 WH3CH2OH ·H2O (摩爾比為1 2 8)三元溶劑溶解，經(jīng)透析、過濾后，流延法60°C干燥成膜，經(jīng)Co-60輻照滅菌后密封保存?zhèn)溆?，即為物理交?lián)再生絲素膜，以下簡稱為再生絲素膜。將處于對數(shù)生長期的兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞消化調(diào)至細(xì)胞濃度IX 105/ml，以Iml/孔接種于鋪有再生絲素膜的M孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，實驗分組同前，感染病毒4 后，取各組上清， 按ELISA檢測試劑盒說明測定Angl、VEGF的含量。結(jié)果顯示未經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞僅能低水平自分泌VEGF165及Ang-I細(xì)胞因子，但接種本發(fā)明所述重組腺病毒組表達(dá)VEGF165及Ang-I水平明顯提高。植入轉(zhuǎn)Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Angl基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜后角膜基質(zhì)內(nèi)SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-l組的HE染色可見豐富的毛細(xì)血管，⑶34免疫組化分析呈現(xiàn)明顯強(qiáng)陽性，微血管密度為(17士3. 5)個/高倍視野，而SF+MSC+Ad-GFP組與SF+MSC組角膜基質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管少見，未見明顯CD34陽性表達(dá)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(*P < 0. 05)。兔角膜層植入轉(zhuǎn)VEGF165及Ang-I基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜后的 SF+MSC+Ad-VEGF 165-Ang-1組角膜基質(zhì)內(nèi)可見VEGF165、Ang_l陽性表達(dá)，呈現(xiàn)棕黑色，而而 SF+MSC+Ad-GFP組與SF+MSC組角膜基質(zhì)內(nèi)未見明顯VEGF及Ang-I陽性表達(dá)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05)。兔角膜層植入轉(zhuǎn)VEGF165及Ang-I基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜后的 SF+MSC+Ad-VEGF 165-Ang-1 組 HIF-α、bFGF 的表達(dá)呈棕黑色，顯著高于 SF+MSC+Ad-GFP 組與SF+MSC對照組(P < 0. 05)；而EGF、PDGF的表達(dá)與SF+MSC+Ad-GFP組與SF+MSC對照組均呈現(xiàn)棕色，組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0. 05)，說明轉(zhuǎn)VEGF165及Ang-I基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜不僅VEGF165及Ang-I目的基因使能在角膜層中有效表達(dá)，而且能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞自分泌的HIF- α ,bFGF水平提高，并維持骨髓基質(zhì)細(xì)胞自分泌的EGF、PDGF的正常穩(wěn)定表達(dá)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的經(jīng)PolyA-promoter和IRES構(gòu)建的VEGF165 及 Ang-I 雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pA(Trrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l (保藏編號為 CCTCCM 2010221)和 pA(Trrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-l (保藏編號為 CCTCC M 2010220),以及經(jīng) QBI-293A 細(xì)胞包裝產(chǎn)生的 Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l 和 Ad-VEGF165-IRES-Ang-1重組腺病毒載體使VEGF165和Ang-I基因理想而又成功的組合在同一個載體上，均能獲得成功表達(dá)，并且通過雙基因表達(dá)產(chǎn)物的聯(lián)合作用，促進(jìn)血管生成和創(chuàng)傷修復(fù)。大鼠創(chuàng)傷修復(fù)實驗進(jìn)一步證明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素材料還可促進(jìn)創(chuàng)傷組織的血管生成，為進(jìn)一步研制出具血管誘導(dǎo)性的醫(yī)用生物材料如小口徑人工血管創(chuàng)造了條件。生物材料保藏信息說明1,pAdTrack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF165 質(zhì)粒，已于 2010 年 9 月 3 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC M 2010220，分類命名為大腸桿菌 Dffia/pAcTrrack-CMV-hVEGF1654RES-hAng-l。2,pAdTrack-CMV-VEGF 165-Po 1 yA-promoter-Ang-1 質(zhì)粒，已于 2010 年 9 月 3 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC M 2010221，分類命名為大腸桿菌 DH5a/pAdTrack-CMV-hVEGF165-polyA-Promter-hAng-l。


圖 1 示本發(fā)明所述 AdTrack-CMV-PolyA-promoter 質(zhì)粒圖譜。圖2示兔角膜新生血管生長面積計算圖例。圖3示HE及免疫組化法檢測病毒注射角膜緣后誘導(dǎo)血管形成的能力。圖4示再生絲素膜上兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中VEGF165、Ang_l基因的RT-PCR電泳圖。1. SF+MSC 組；2. SF+MSC+Ad-GFP 組；3. SF+MSC+Ad-VA 組。圖5示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜植入兔角膜層后對角膜新生血管形成的影響；SF 再生絲素膜；MSC 兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞。圖6示植入轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的再生絲素膜的兔角膜層中VEGF165、Ang-U HIF- α、bFGF、EGF, PDGF免疫組化分析統(tǒng)計圖。圖7示免疫組化檢測大鼠創(chuàng)傷恢復(fù)組織中VEGF的表達(dá)SFMSCVA組分別與PBS組， SF 組，SFMSC 組比較，ΔΡ < 0. 05 ；SFMSC 組分別與 PBS 組，SF 組比較，*P < 0. 05。圖8示免疫組化檢測大鼠創(chuàng)傷恢復(fù)組織中Ang-I的表達(dá)SFMSCVA組分別與PBS 組，SF組，SFMSC組比較，ΔΡ < 0. 05 ；SFMSC組分別與PBS組，SF組比較，*P < 0. 05。圖9示免疫組化檢測大鼠創(chuàng)傷恢復(fù)組織中⑶34的表達(dá)SFMSCVA組分別與PBS組， SF 組，SFMSC 組比較，ΔΡ < 0. 05 ；SFMSC 組分別與 PBS 組，SF 組比較，*P < 0. 05。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種雙基因共表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的再生絲素膜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。按照本發(fā)明，角膜緣注射本發(fā)明所述重組腺病毒能成功誘導(dǎo)角膜新生血管形成； 培養(yǎng)于絲素膜上生長的兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明所述重組腺病毒感染細(xì)胞后，可成功表達(dá)VEGF165及Ang-I基因；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜植入兔角膜層后2周新生血管長入絲素膜植入?yún)^(qū)域的角膜內(nèi)且維持1月以上，HE染色與免疫組化顯示血管密度明顯增多， VEGF165、Ang-U⑶34在兔角膜層中獲得成功表達(dá)。大鼠創(chuàng)傷修復(fù)實驗進(jìn)一步證明本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜還可促進(jìn)創(chuàng)傷組織的血管生成，說明本發(fā)明所述重組腺病毒以及轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜具有潛在的應(yīng)用價值。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實施例1 :pA(Trrack-CMV-Ang-l-PolyA-promoter-VEGF 165 雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒圖譜在申請?zhí)枮?00810244301. 3中國發(fā)明專利申請說明書公開polyA Δ 296 298-promoter (簡稱PolyA-promoter)和IRES序列。本發(fā)明所述雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒是在pAdTrack-CMV-PolyA-promoter轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在Bgl II、Sal I酶切位點間插入 Ang-I片段，在Not I,Xho I酶切位點間插入VEGF165片段，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。實施例2 目的基因的克隆比對Ang-I的保守序列，設(shè)計引物PI、P2(如表1)，兩端分別引入Bgl II, Sal I酶切位點；以本科室已構(gòu)建的含有Ang-I片段的pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得的Ang-I目的片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。比對VEGF165的保守序列，設(shè)計引物P3、P4(如表1)，兩端分別引入Not I,Xho I 酶切位點，以本科室已構(gòu)建的含有VEGF165片段的pA(Trrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得的VEGF165目的片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。表IPCR 引物
SenseAntisenseAng-IP1:5，-tagagatctatgacagttttcP2:5'-Accgtcgacctcaaaaatct(BglII、Sal I )ctttcctttgc -3'aaaggtcgaatcatc-3'VEGF165P3:5' -gcagcggccgcatgaacP4:5'-Taactcgagtcaccgcctcg(Not I、Xho I )tttctgctgtcttgggtg-3'gcttgtcacatc-3'VEGF165P5:5'-gcaagatctatgaactttctP6:5' -Taagtcgacctcaccgcctc(Bgl II、Sal I )gctgtcttgggtg -3'ggcttgtcacatc-3'Ang-IP7:5' -taggcggccgcatgacagP8:5'-accctcgagtcaaaaatctaa(Not I、Xho I )ttttcctttcctttgc-3'aggtcgaatcatc-3'PCR條件為94°C預(yù)變性anin，94°C變性50s，58°C退火50s，72°C延伸50s，共循環(huán) 30次，最后72°C后延伸IOmin0PCR體系如下10XPCR 緩沖液(含有 Mg2+)5 μ 1dNTPmix(IOmM each)1 μ 1引物 Pl 05 μ Μ)1 μ 1引物 Ρ2 05 μ Μ)1 μ 1pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165質(zhì)粒模板1 μ 1ddH2040 μ 1Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1_終體積50 μ 1實施例3 pAdTrack-CMV-Ang-I-PolyA-promoter單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建將由DNA清潔試劑盒純化的Ang-I基因的PCR產(chǎn)物和小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pAcTTrack-CMV-PolyA-promoter 分別用 Bgl II,Sal I 37°C雙酶切 ^!后，割膠回收目的片段，按試劑盒膠回收方法和步驟操作，然后用T4DNA連接酶將其在4°C連接過夜， 繼而再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在含Kana (50 μ g/ml)抗性平板中挑選陽性單克隆，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和DNA序列測定鑒定后，陽性克隆菌_20°C冰箱保種備用。雙酶切體系如下
pAdTrack-CMV-PolyA-promoter質(zhì)粒雙酶切體系 Ang-IPCR產(chǎn)物雙酶切體系 IOXBuffer H2μ 1
pAdTrack-CMV-PolyA-promoter 質(zhì)粒 15 μ 1 Bgl II1. 5μ 1
Sal I1. 5μ 1
IOXBuffer H VEGF165PCR 產(chǎn)物 Bgl II Sal I
3 μ 1 23 μ 1 2μ 1 2μ 1
20 μ 1
終體積
30 μ 1終體積20 μ 1CaCl2法制備DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化技術(shù)路線如下轉(zhuǎn)化前一天，DH5a按接種5ml LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜，按1 %轉(zhuǎn)種5ml LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)，至0D600nm約為0. 2 (約培養(yǎng)1. 3h)，將菌液倒入5ml離心管中5000r/min， 離心5min收集菌體，加入5ml預(yù)冷的IOOmM CaCl2,懸浮菌體后0°C，20 30min后，5000r/ min,離心5min收集菌體用約600 μ 1 IOOmM預(yù)冷CaC12懸浮菌體，并按下表進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并置隔水式恒溫培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)IMi挑陽性克隆鑒定，即得到pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-pro moter單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，質(zhì)粒抽提、PCR和雙酶切鑒定方法同上。
終體積連接體系如下
純化的雙酶切Ang-IPCR產(chǎn)物8 μ 1
純化的雙酶切 pAdTrack-CMV-PolyA-promoter 大片段8 μ 1
IOXBuffer2μ 1
T4DNA Iigase2μ 權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒 pA(Trrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-l，其保藏號為CCTCC M 2010221。
2.經(jīng)權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒與腺病毒pAdEasy-Ι同源重組在QBH93A細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒 Ad-VEGF 165-PolyA-promoter-Ang-l。
3.一種重組質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-VEGF 165-IRES-Ang-l，其保藏號為；CCTCC M 2010220。
4.經(jīng)權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒與腺病毒pAdEasy-Ι同源重組，在QBH93A細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒Ad-VEGF165-IRES-Ang-1。
5.權(quán)利要求2或4所述重組腺病毒在制備促血管生長藥物中的應(yīng)用。
6.一種制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜的方法，其特征在于，包含以下步驟將骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于絲素膜上，加入權(quán)利要求2或4所述重組腺病毒，所述再生絲素膜每平方厘米上骨髓基質(zhì)細(xì)胞濃度為0. 5 X IO5--I X IO5,重組腺病毒接種量為20-30M0I，于 37°C,5% CO2條件培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述骨髓基質(zhì)細(xì)胞處于對數(shù)生長期。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述骨髓基質(zhì)細(xì)胞為原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞濃度IXlO8LA
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述方法制備的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜在制備血管誘導(dǎo)性和創(chuàng)傷修復(fù)的醫(yī)用生物材料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體公開了重組了VEGF165與Ang-1的pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-質(zhì)粒和pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1質(zhì)粒，其保藏編號分別為CCTCC NOM 2010221、CCTCC NOM 2010220。本發(fā)明還公開了經(jīng)所述質(zhì)粒與腺病毒同源重組和QBI-293A細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的重組腺病毒。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜。兔角膜緣注射本發(fā)明所述重組腺病毒能成功誘導(dǎo)角膜新生血管形成；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾的絲素膜植入兔角膜層后新生血管長入絲素膜植入?yún)^(qū)域的角膜內(nèi)且血管密度明顯增多，VEGF165、Ang-1、CD34在兔角膜層中獲得成功表達(dá)。大鼠創(chuàng)傷修復(fù)實驗進(jìn)一步證明本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜還可促進(jìn)創(chuàng)傷組織的血管生成和創(chuàng)傷修復(fù)，說明本發(fā)明所述重組腺病毒以及轉(zhuǎn)基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞修飾的絲素膜具有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
文檔編號C12N7/01GK102242148SQ201010512520
公開日2011年11月16日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者劉鐵連, 張曉峰, 楊吉成, 盛偉華, 繆競誠, 韓亞麗 申請人:蘇州大學(xué)