專利名稱：一種池塘底泥樣品高純度總dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是池塘底泥樣品總DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
池塘底泥中富含細(xì)菌、病毒、原生動物、寄生蟲卵和其它微生物，其微生物多樣性豐富、群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜。研究底泥微生物種群結(jié)構(gòu)的時空動態(tài)變化，分析養(yǎng)殖池塘底泥微生態(tài)的功能變化趨勢，一直具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值。早期的微生物研究多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，主要是根據(jù)微生物的個體形態(tài)、培養(yǎng)特性和生理生化等特征，運(yùn)用平板計數(shù)、鏡檢等方法進(jìn)行環(huán)境微生物學(xué)研究。然而環(huán)境中能被分離培養(yǎng)的微生物種類只占自然界微生物總量的左右，通過傳統(tǒng)方法得到的研究結(jié)果并不能真實(shí)、全面反映出養(yǎng)殖池塘底泥微生物的真實(shí)情況，難以獲得微生物群落結(jié)構(gòu)和空間分布的有關(guān)信息。隨著近十余年來分子生物學(xué)技術(shù)的日益成熟，池塘底泥的研究也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。借助分子生物學(xué)手段可以進(jìn)行微生物的特異性檢測，分析微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和種群演替狀況，不過開展這些研究的前提是建立高效、可靠的微生物總DNA提取方法。 目前關(guān)于從土壤、水體、海洋沉積物取DNA的方法已得到較好發(fā)展，如專利CN101372689A、 CN101230342A中分別介紹了土壤基因組DNA的兩種提取方法，CN18M809A介紹了一種水生動物糞樣細(xì)菌DNA提取試劑盒及其使用方法，和CN1584051A提出了一種分析城市污水污泥微生物群落構(gòu)成的方法等。不過由于土壤、污泥等環(huán)境樣品成分復(fù)雜，所含腐殖質(zhì)和微生物類群存在較大的差異(如菌種的多樣性、大小和豐度)，從而導(dǎo)致不同提取方法獲得的DNA 質(zhì)量差異較大。對于有機(jī)質(zhì)含量豐富的土壤或活性污泥樣品來說，“機(jī)械破壁+酶作用”的提取方法對樣品中腐植酸等雜質(zhì)的去除能力有限，所得總DNA中殘余的腐植酸或其它一些雜質(zhì)會對后續(xù)的PCR擴(kuò)增、酶切和克隆等操作造成非常大的影響。池塘底泥樣品在物理、化學(xué)性質(zhì)上與土壤和活性污泥樣品相比，均存在一定的異質(zhì)性，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，所以建立簡單易行并能最大限度反映池塘底泥微生物多樣性的DNA提取方法成為亟待解決的問題，同時在研究中還需根據(jù)不同池塘底泥特點(diǎn)對DNA的提取和純化方法加以優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法。本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案1.池塘底泥預(yù)處理①稱取采集的池塘底泥樣品1 5g置于離心管中，SOOOrpm室溫離心3min，棄上清；②向離心管中加入3倍體積20mmol/L EDTA緩沖液，與樣品充分混勻，于8000rpm
室溫離心5min，棄上清，并將此步驟重復(fù)一次；③向離心管中加入PBS緩沖液5 15mL，該緩沖液按以下配比配制NaCl 4g，KCl0. lg, Na2HPO4 0. 72g, KH2PO4 0. 12g,加 ddH20 至 500mL，pH7. 4，與樣品充分混勻，于 8000rpm 室溫離心5min，棄上清，即樣品預(yù)處理完畢；上述預(yù)處理后的樣品用于后續(xù)分析；
2.粗提取池塘底泥總DNA ①向預(yù)處理后的樣品中加入0. 8 3g酸洗石英砂，然后加入3 15mL的DNA提取緩沖液和10 50 yL蛋白酶K 20mg/L,強(qiáng)力震蕩5min混勻后，用搖床在37°C、225rpm條件下震蕩20 30min ；②向上述樣品中加入500 2000 μ L SDS緩沖液，于65 °C水浴60 90min，每 15min反復(fù)上下顛倒離心管3次，將樣品搖勻；然后于SOOOrpm室溫離心lOmim，并將上清轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中；③向沉淀中加入1 5mL的DNA提取緩沖液和200 800 μ L SDS緩沖液，于65°C 水浴lOmin，然后IOOOOrpm室溫離心lOmin，合并上清后，再重復(fù)一次；④收集的上清中加入等體積的氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心lOmin，
收集上清；⑤收集的上清中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心 lOmin，收集上清，抽提1 2次;⑥收集的上清中加入1.5倍體積的冷乙醇和0.2倍體積的乙酸鈉，漩渦震蕩 5min, _20°C放置 2h ；⑦將步驟⑥處理后的樣品于12000rpm室溫離心lOmin，棄上清，并加入100 500 μ L 70%乙醇，搖勻后于40°C干燥；⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50 200 μ L TE緩沖液，即得到底泥總DNA的粗提液；上述步驟①中DNA 提取緩沖液為 Tris IOOmM, EDTA IOOmM, NaCl 2OOmM，PVPP 1 %, CTAB 2%，調(diào) ρΗ 至 8.0 ；步驟②中 SDS 緩沖液為 Tris IOOmM, NaCl 200mM, SDS 2%，調(diào) PH至8.0;步驟④中氯仿-異戊醇體積比為M 1 ；步驟⑤中苯酚-氯仿-異戊醇體積比為 25 24 1 ；如果總DNA的粗提液呈淡棕黃或淡棕黑色，則采用柱式腐殖酸清除劑對獲得的 DNA粗提液進(jìn)行過柱純化。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是提取底泥總DNA的方法具有針對性，技術(shù)方案簡單易行，本發(fā)明通過樣品預(yù)處理和總DNA粗提液去腐植酸的純化過程，可有效去除底泥樣品中的腐植酸等雜質(zhì)，提取的池塘底泥樣品總DNA純度高，OD260nm/OD280nm可達(dá)1. 57以上，可直接用于后續(xù)的PCR、酶切和雜交等分子生物學(xué)操作。本發(fā)明與割膠回收的純化方式相比，不僅成本低， 而且對操作者更安全。


圖1為采用本方法提取出的某蝦蟹混養(yǎng)池塘底泥總DNA的瓊脂糖凝膠(1 % )電泳圖。圖2為16S rDNA V3區(qū)基因片段瓊脂糖凝膠(1% )電泳圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1 1.準(zhǔn)確稱取Ig底泥樣品(采集自某養(yǎng)殖場的蝦蟹混養(yǎng)池塘)，置于IOmL滅菌離心管中，8000rpm室溫離心;3min，棄上清；向離心管中加入3mL 20mmol/L EDTA緩沖液，與樣品充分混勻，于8000rpm室溫離心5min，棄上清，重復(fù)一次；向離心管中加入PBS緩沖液5mL， 混勻后再離心5min，棄上清，所得樣品即可用于后續(xù)分析。其中PBS緩沖液為NaCl 4g，KCl 0. lg, Na2HPO4 0. 72g, KH2PO4 0. 12g，力口 ddH20 至 500mL，調(diào)溶液 pH 至 7· 4 即可。2.底泥樣品總DNA的粗提取①向預(yù)處理后的樣品中加入0. Sg酸洗石英砂，然后加入3mL的DNA提取緩沖液和 10 μ L蛋白酶K (20mg/L)，強(qiáng)力震蕩5min混勻后，在37°C、225rpm條件下用搖床震蕩20min。 其中 DNA 提取緩沖液為 TrislOOmM，EDTA IOOmM, NaCl 200mM, PVPP 1 %, CTAB 2%，調(diào)溶液 pH至8. 0即可。②向上述樣品中加入500 μ L SDS緩沖液，于65°C水浴60min，每15min反復(fù)上下顛倒離心管3次，將樣品搖勻；然后于SOOOrpm室溫離心lOmin，并將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。其中SDS緩沖液為TrislOOmM，NaCl 200mM, SDS 2%，調(diào)溶液pH至8. O即可。③向沉淀中加入ImL的DNA提取緩沖液和200 μ L SDS緩沖液，于65°C水浴lOmin， 然后IOOOOrpm室溫離心lOmin，合并上清后，再重復(fù)一次。④收集的上清中加入等體積的氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心lOmin， 取上清，其中氯仿-異戊醇的體積比為M 1。⑤收集的上清中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心 lOmin，取上清，抽提1 2次，其中苯酚-氯仿-異戊醇的體積比為25 24 I0⑥加入1.5倍體積的冷乙醇和0.2倍體積的乙酸鈉至上清液，漩渦震蕩 5min, _20°C放置 2h。⑦將步驟⑥處理后的樣品于12000rpm室溫離心lOmin，棄上清，并加入IOOyL 70%乙醇，搖勻后于40°C干燥。⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50 100 μ L TE緩沖液，即得到底泥總DNA的粗提液。3.由于總DNA粗提液呈淡棕黃色，故采用柱式腐殖酸清除劑對獲得的DNA粗提液進(jìn)行過柱純化，結(jié)果見附圖1，圖中從右至左依次為泳道1是DNA marker，泳道2-5是提取出的底泥總DNA。4.使用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的通用引物，對獲得的底泥總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。上引物序列為 5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3，；下引物為 5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系10 X PCR 緩沖液 2. 5 μ L, 2. 5mmol/L dNTP 2μ L,25mmol/L 引物各 1 μ L，Taq 酶 0· 2 μ U250U)，DNA 模板 1 μ L，ddH20 補(bǔ)足至 25 μ L。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C預(yù)變性60s，55°C退火60s，72°C延伸40s，30個循環(huán)，72°C 延伸6min。然后用瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果見附圖2，圖中從左至右依次為泳道1是DNA marker,泳道2_5是某蝦蟹混養(yǎng)池塘底泥總DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖譜上均出現(xiàn)清晰的條帶，表明用本發(fā)明的方法提取的底泥總DNA樣品可以直接進(jìn)行PCR等后續(xù)分子生物學(xué)操作。實(shí)例2
1.準(zhǔn)確稱取5g底泥樣品(采集自某異育銀鯽、花鰱和白鰱混養(yǎng)池塘)，置于IOmL 滅菌離心管中，8000rpm室溫離心;3min，棄上清；向離心管中加入15mL 20mmol/L EDTA緩沖液，與樣品充分混勻，于SOOOrpm室溫離心5min，棄上清，重復(fù)一次；向離心管中加入PBS 緩沖液15mL，混勻后再離心5min，棄上清，所得樣品即可用于后續(xù)分析。其中PBS緩沖液為 NaCl 4g, KCl 0. lg, Na2HPO4 0. 72g, KH2PO4 0. 12g，力口 ddH20 至 500mL，調(diào)溶液 pH 至 7. 4 即可。2.底泥樣品總DNA的粗提?、傧蝾A(yù)處理后的樣品中加入3g酸洗石英砂，然后加入15mL的DNA提取緩沖液和 50口1^蛋白酶1((201^/1)，強(qiáng)力震蕩51^11混勻后，在371、225印111條件下用搖床震蕩30111土11。 其中 DNA 提取緩沖液為 TrislOOmM，EDTA IOOmM, NaCl 200mM, PVPP 1 %, CTAB 2%，調(diào)溶液 pH至8. 0即可。②向上述樣品中加入2mL SDS緩沖液，于65°C水浴90min，每15min反復(fù)上下顛倒離心管3次，將樣品搖勻；然后于SOOOrpm室溫離心lOmin，并將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。 其中SDS緩沖液為TrislOOmM，NaCl 200mM, SDS 2%，調(diào)溶液pH至8. O即可。③向沉淀中加入5mL的DNA提取緩沖液和800 μ L SDS緩沖液，于65°C水浴lOmin， 然后IOOOOrpm室溫離心lOmin，合并上清后，再重復(fù)一次。④收集的上清中加入等體積的氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心lOmin， 取上清，其中氯仿-異戊醇的體積比為M 1。⑤收集的上清中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心 lOmim，取上清，抽提1 2次，，其中苯酚-氯仿-異戊醇的體積比為25 24 I0⑥加入1.5倍體積的冷乙醇和0.2倍體積的乙酸鈉至上清液，漩渦震蕩 5min, _20°C放置 2h。⑦將步驟⑥處理后的樣品于12000rpm室溫離心lOmin，棄上清，并加入500 μ L 70%乙醇，搖勻后于40°C干燥。⑧向干燥后的DNA沉淀中加入100 200 μ L TE緩沖液，即得到底泥總DNA的粗提液。
權(quán)利要求
1.一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，包含池塘底泥的預(yù)處理、總DNA的粗提取和DNA粗提液的純化，其特征在于池塘底泥預(yù)處理按以下步驟進(jìn)行①稱取采集的池塘底泥樣品1 5g置于離心管中，SOOOrpm室溫離心3min，棄上清；②向離心管中加入3倍體積20mmol/LEDTA緩沖液，與樣品充分混勻，于SOOOrpm室溫離心5min，棄上清，并將此步驟重復(fù)一次；③向離心管中加入PBS緩沖液5 15mL與樣品充分混勻，于8000rpm室溫離心5min， 棄上清，即樣品預(yù)處理完畢；上述預(yù)處理后的樣品用于后續(xù)分析；粗提取池塘底泥總DNA按以下步驟進(jìn)行①向預(yù)處理后的樣品中加入0.8 3g酸洗石英砂，然后加入3 15mL的DNA提取緩沖液和10 50 yL蛋白酶K 20mg/L,強(qiáng)力震蕩5min混勻后，用搖床在37°C、225rpm條件下震蕩20 30min ；②向上述樣品中加入500 2000μ L SDS緩沖液，于65°C水浴60 90min，每15min 反復(fù)上下顛倒離心管3次，將樣品搖勻；然后于SOOOrpm室溫離心lOmin，并將上清轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中；③向沉淀中加入1 5mL的DNA提取緩沖液和200 800μ L SDS緩沖液，于65°C水浴 lOmin，然后IOOOOrpm室溫離心lOmin，合并上清后，再重復(fù)一次；④收集的上清中加入等體積的氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心lOmin，收集上清；⑤收集的上清中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行抽提，12000rpm室溫離心 lOmin，收集上清，抽提1 2次；⑥收集的上清中加入1.5倍體積的冷乙醇和0.2倍體積的乙酸鈉，漩渦震蕩 5min, _20°C放置 2h ；⑦將步驟⑥處理后的樣品于12000rpm室溫離心lOmin，棄上清，并加入100 500μ L 70%乙醇，搖勻后于40°C干燥；⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50 200μ L TE緩沖液，即得到底泥總DNA的粗提液。
2.按權(quán)利要求1所述的一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，其特征在于用柱式腐殖酸清除劑對獲得的呈現(xiàn)淡棕黃或淡棕黑色的DNA粗提液進(jìn)行過柱純化。
3.按權(quán)利要求1所述的一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，其特征在于PBS 緩沖液為 NaCl 4g，KCl 0. IgjNa2HPO4 0. 72g, KH2PO4 0. 12g，加 ddH20 至 500mL，調(diào) pH 至 7· 4。
4.按權(quán)利要求1所述的一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，其特征在于所述 DNA 提取液為 Tris IOOmM, EDTA IOOmM, NaCl 200mM, PVPP 1 %，CTAB 2%，調(diào) pH 至 8. O ；所述SDS緩沖液為Tris IOOmM, NaCl 200mM, SDS 2%，調(diào)pH至8. O ；所述氯仿-異戊醇和苯酚-氯仿-異戊醇體積分別為M 1和25 M 1。
全文摘要
一種池塘底泥樣品高純度總DNA的提取方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首先用EDTA緩沖液和PBS緩沖液預(yù)處理池塘底泥樣品，然后進(jìn)行底泥總DNA的粗提取，具體為向底泥樣品中加入適量石英砂、DNA提取緩沖液和蛋白酶K，37℃于搖床震蕩20～30min，再加入SDS緩沖液混勻，65℃水浴60～90min，離心取上清；用等體積的氯仿-異戊醇抽提，離心，取水相；再用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇抽提1～2次；加入冷乙醇和乙酸鈉，-20℃放置2h，離心，收集DNA沉淀，經(jīng)乙醇潤洗后干燥，加入TE溶解，即得到池塘底泥總DNA的粗提液。本發(fā)明可用于PCR擴(kuò)增、酶切和雜交等分子生物學(xué)操作。
文檔編號C12N15/10GK102260666SQ201010183580
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者寫臘月, 周俊芳, 周帥, 房文紅 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所