專利名稱：一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是生命的基本單位，細(xì)胞的特殊性決定了個(gè)體的特殊性，因此，對(duì)細(xì)胞的深入 研究是揭開(kāi)生命奧秘、改造生命和征服疾病的關(guān)鍵。細(xì)胞的主要生命活動(dòng)包括增殖、分化、 衰老和凋亡等，細(xì)胞的這些生命活動(dòng)對(duì)生物體的生存和發(fā)展具有重要意義。細(xì)胞增殖是生 物體生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖和遺傳的基礎(chǔ)；細(xì)胞分化是個(gè)體發(fā)育的一個(gè)重要階段，胚層細(xì)胞的分 化導(dǎo)致組織形成、器官發(fā)生和系統(tǒng)建成，細(xì)胞的異常分化會(huì)導(dǎo)致癌變；細(xì)胞的衰老和凋亡與 生物體衰老有著極為密切的關(guān)系。對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)的研究已經(jīng)成為現(xiàn)在生物學(xué)研究的熱 點(diǎn)之一，有研究表明，細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡等生命活動(dòng)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)核酸調(diào)控，細(xì)胞內(nèi) 核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，因此，觀察檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核酸變化可以有效 的分析細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡狀況，進(jìn)一步可以研究整個(gè)生物體的代謝?，F(xiàn)最成熟的檢測(cè)和分析細(xì)胞內(nèi)核酸變化的方法，是核酸標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)法，這種方 法首先將特殊標(biāo)記(如放射性標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等)的核苷或核苷酸探針插入細(xì)胞內(nèi) 核酸，然后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸探針信號(hào)達(dá)到檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核酸變化的目的?，F(xiàn)普遍應(yīng)用 的核苷和核苷酸探針可分為兩類，一類是同位素探針，另一類是免疫識(shí)別探針。雖然這兩類 探針已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞周期研究，DNA復(fù)制以及細(xì)胞增值等研究方面，但這兩種方法都存在很 大缺陷。同位素探針由于其放射性，操作條件要求很高，不能在普通實(shí)驗(yàn)室完成，同位素標(biāo) 記的顯微圖片的分辨率差，信噪比低，另外，放射自顯影法實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(檢測(cè)通常要 幾個(gè)月)，就不能用于快速高通量檢測(cè)。免疫識(shí)別探針通常采用5-溴-2’ -脫氧尿嘧啶核 苷(BrdU)、5_溴尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷酸等，采用這種免疫識(shí)別探針最大缺陷在于， 插入核酸的5-溴代核酸一定要暴露在核酸分子表面同識(shí)別抗體結(jié)合。為檢測(cè)插入核酸分 子鏈中的探針需要通過(guò)各種條件使核酸分子變性，現(xiàn)在經(jīng)常使用的條件包括醋酸的甲醇溶 液，濃鹽酸等，這些變性條件使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，經(jīng)常出現(xiàn)難以重復(fù)的結(jié)果。隨著對(duì)細(xì)胞研究的深入，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)核酸的檢測(cè)技術(shù)要求越來(lái)越高，基于這種要 求本發(fā)明開(kāi)發(fā)出了一種全新的核酸標(biāo)記方法。本發(fā)明應(yīng)用分子連接的思想，通過(guò)“點(diǎn)擊”反 應(yīng)將細(xì)胞內(nèi)核酸同活性分子連接，從而可以使各種檢測(cè)方法準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)核酸分布、含 量等指標(biāo)?！包c(diǎn)擊”化學(xué)的概念是2001年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Sharpless提出?！包c(diǎn)擊”反應(yīng)是在 傳統(tǒng)Huisgen三唑反應(yīng)基礎(chǔ)上，發(fā)展出一類條件溫和，選擇性高和產(chǎn)率高的化學(xué)反應(yīng)。傳統(tǒng) 的Huisgen三唑反應(yīng)(如圖1)是有機(jī)疊氮和炔基化合物在加熱條件下發(fā)生1，3_ 二偶極 [3+2]環(huán)加成反應(yīng)，得到五元雜環(huán)[1，2，3]-三氮唑。Huisgen三唑反應(yīng)為連接兩個(gè)化合物 提供了一種很好的手段，但是該反應(yīng)條件通常需要通過(guò)加熱活化等條件才能完成?！包c(diǎn)擊” 反應(yīng)是亞銅離子催化下的Huisgen三唑反應(yīng)，由于亞銅離子的催化Huisgen三唑反應(yīng)活化
4能降低，使該反應(yīng)可以在常溫下水和多種有機(jī)溶劑中高產(chǎn)率完成。另外，“點(diǎn)擊”反應(yīng)僅得到 1，4，位三氮唑產(chǎn)物，不同于加熱條件下得到1，5，位同1，4，位混和產(chǎn)物。目前“點(diǎn)擊”反 應(yīng)已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用于各種生物大分子修飾，并被認(rèn)為是“搭建起化學(xué)和生物學(xué)橋梁的杰 出反應(yīng)”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒。該方法和試劑盒可 用于方便、準(zhǔn)確、快速地標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸。解決上述目的的技術(shù)方案如下一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，主要包括有能夠在核酸合成的過(guò)程中插入細(xì)胞內(nèi)核酸序列中的、帶有1，3_ 二偶極基團(tuán)或親 偶極基團(tuán)的核苷類似物；含有與上述1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3_ 二偶極基 團(tuán)的生物分子探針；所述核苷類似物與生物分子探針通過(guò)1，3_ 二偶極基團(tuán)與對(duì)應(yīng)的親偶 極基團(tuán)進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)。所述1，3_ 二偶極基團(tuán)優(yōu)選為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、腈胺基等等； 親偶極基團(tuán)優(yōu)選為烯基、炔基。更優(yōu)選地，所述烯基為乙烯基、丁烯基等；所述炔基為乙炔 基、丙炔基，環(huán)狀炔基等。優(yōu)選地，帶有1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物可為5_乙炔 基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’_脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿 嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5_乙炔基_2’ -脫氧胞嘧啶核苷 (YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5_(1，7 辛二炔)"胞嘧啶核苷(XC)、2’ -脫氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤 核苷(YA)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷 (XA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷 (QYA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核 苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮 雜_腺嘌呤核苷(QXA)、2’ -脫氧-8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷 (YG)、2，-脫氧-8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XTG)、8_(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、 7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基_7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、 7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基_7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、 7_ (1，7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXTG)、7- (1，7辛二炔)~7~氮雜-鳥(niǎo)嘌呤 核苷(QXG)。5-疊氮基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷(DTU)、5_乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5_疊氮 基_2’ -脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脫氧-8-疊氮基-腺嘌呤 核苷(DTA)、8_疊氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DTG)、8_疊氮 基_鳥(niǎo)嘌呤核苷(DG)。生物分子探針可為任何已知的小分子或大分子探針，包括生物熒光探針、免疫 探針、生物素、抗原或半抗原、放射性探針?lè)肿?、光感探針?lè)肿?、以及任何的蛋白?biāo)簽和底 物分子；優(yōu)選為吸收波長(zhǎng)350-1000nm的熒光探針和生物素，更優(yōu)選為吲哚類菁熒光探針，BODIPY類熒光探，Alexa Fluor類熒光探針，以及FAM、FITC、羅丹明熒光探針。所述標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒還包括催化劑和溶劑，所述催化劑包為含亞銅 離子的化合物，含亞銅離子化合物優(yōu)選為硫酸銅和抗壞血酸、溴化亞銅、Cu(CH3)4PF6、 C54H45BrP5Cu、Cu絲。所述溶劑可為各種溶劑，優(yōu)選為水、四氫呋喃、DMSO(二甲基亞砜)、 乙腈、或四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或幾種溶劑的混合物。所述標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒還包括有催化劑穩(wěn)定劑，該催化劑穩(wěn)定劑優(yōu)選為 TBTA(tris-(benzyltriazolylethy) amine)，TCEP (Tri-(2-carboxyethyl)phosphine)中的 一種或多種。一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，主要包括以下步驟(A)將1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物在活細(xì)胞核酸合成的過(guò)程中 插入到核酸序列中，核酸被修飾；(B)再加入含與上述1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1， 3_ 二偶極基團(tuán)的生物分子探針，含亞銅離子化合物的催化劑和溶劑，在常溫下被修飾的核 酸與生物分子探針進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)，核酸被標(biāo)記。所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，該核酸為離體的游離活細(xì)胞內(nèi)核酸，(A)步驟 為將1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物與含有待標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的細(xì)胞共孵 育，核苷類似物插入到待標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸序列中，核酸被修飾；所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，該核酸為生物體組織的活細(xì)胞內(nèi)中核酸，(A)步 驟為將1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物以任何一種給藥方式注入生物體的組 織的活體中，0 960小時(shí)后，獲取各種器官，用福爾馬林固定和石蠟包埋并切片，去除石蠟 和復(fù)水后，核酸被修飾。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單有效的生物分子探針標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒。 本發(fā)明方法合成一類核苷類似物，該類似物能夠在細(xì)胞核酸合成的過(guò)程中插入細(xì)胞內(nèi)核 酸，核苷類似物上攜帶可“點(diǎn)擊”反應(yīng)的活性基團(tuán)(如炔基、疊氮基等)。化學(xué)合成或酶合 成或細(xì)胞中的核酸經(jīng)“點(diǎn)擊”反應(yīng)核苷修飾后可以同任何已有生物分子探針連接，該生物 探針?lè)肿訑y帶另外一部分互補(bǔ)的“點(diǎn)擊”反應(yīng)基團(tuán)即可，這樣在適當(dāng)條件下核酸就可以同活 性探針?lè)肿油ㄟ^(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)連接。所述“點(diǎn)擊”反應(yīng)的條件溫和，反應(yīng)時(shí)間快，產(chǎn) 率高，故適用于已知的全部生物分子探針同核酸連接，使被標(biāo)記的核酸可方便于多種方式 在分子、細(xì)胞、組織水平上被準(zhǔn)確分離鑒定、檢測(cè)、分析，從而可有利于進(jìn)一步的檢測(cè)細(xì)胞增 值，細(xì)胞凋亡；標(biāo)記質(zhì)粒載體，病毒，小干擾RNA，micr0RNA以及研究早期發(fā)育。


圖1是Huisgen三唑反應(yīng)；圖2是含親偶極基團(tuán)嘧啶核苷類似物；圖3是含親偶極基團(tuán)嘌呤核苷類似物；圖4是1，3- 二偶極基團(tuán)修飾嘧啶核苷；圖5是1，3- 二偶極基團(tuán)修飾嘌呤核苷；圖6為YTU和YU標(biāo)記Hela細(xì)胞的結(jié)果示意圖，其中A C圖為對(duì)照組；D F圖 為YTD標(biāo)記組；G I圖為YD標(biāo)記組；其中圖A，D和G為Hoechst染色；圖B，E和H為Cy3染色；圖C，F(xiàn)和I為疊加圖；圖7為YTU和YU標(biāo)記NIH3T3細(xì)胞結(jié)果示意圖，其中A C圖為對(duì)照組；D F圖 為YTD標(biāo)記組；G I圖為YD標(biāo)記組；其中圖A，D和G為Hoechst染色；圖B，E和H為Cy3 染色；圖C，F(xiàn)和I為疊加圖；圖8其中A為無(wú)銅離子條件下的“點(diǎn)擊”反應(yīng)；B為CuSO4終濃度為IOOnM條件下 的“點(diǎn)擊”反應(yīng)；C為CuSO4終濃度為IOOOnM條件下的“點(diǎn)擊”反應(yīng)；圖9是激發(fā)光譜390 492nm系列生物分子探針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物標(biāo)記 DNA ；A為DNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加圖；圖10是激發(fā)光譜492 597nm系列生物分子探針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物標(biāo) 記DNA ；A為DNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加圖；圖11是激發(fā)光譜597 770nm系列生物分子探針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物標(biāo) 記DNA ；A為DNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加12是激發(fā)光譜390 492nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物 標(biāo)記RNA ；A為RNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加圖；圖13是激發(fā)光譜492 597nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物 標(biāo)記RNA ；A為RNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加圖；圖14是激發(fā)光譜597 770nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物 標(biāo)記RNA ；A為RNA “點(diǎn)擊”反應(yīng)標(biāo)記；圖B為Hoechst染色；圖C為疊加圖；圖15為檢測(cè)凋亡因子對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響結(jié)果示意圖，其中A圖為對(duì)照組；B 圖為凋亡誘導(dǎo)因子A刺激組；C圖為凋亡誘導(dǎo)因子B刺激組；圖D為含有EdU細(xì)胞數(shù)目的比 率分布圖；圖16為檢測(cè)凋亡因子對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果示意圖，其中A C圖為對(duì)照 組；D F圖為凋亡刺激組；其中圖A，D為Hoechst染色；圖B，E為Cy3染色；圖C，F(xiàn)為疊 加圖；圖G為DNA/RNA比率頻率分布圖；圖17為YTU標(biāo)記小鼠小腸組織結(jié)果示意圖，其中A D圖為對(duì)照組；E H圖為 YTD標(biāo)記組A，E為透射圖；圖B，F(xiàn)為Hoechst染色；圖C，G為Cy3染色；圖D，H為疊加圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒的應(yīng)用范圍其可以標(biāo)記任何形式活細(xì)胞 內(nèi)的核酸(通過(guò)DNA聚合酶或RNA聚合酶合成等等)；所述活細(xì)胞，是能夠合成核酸的細(xì)胞。 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所指的生物分子探針包括任何已知的小分子或大分子探針，包括生 物熒光探針、免疫探針、生物素、抗原或半抗原、放射性探針?lè)肿印⒐飧刑结樂(lè)肿?、以及任?的蛋白標(biāo)簽和底物分子等，其可通過(guò)直接檢測(cè)到的，也可以是通過(guò)間接檢測(cè)到的；可使用任 何一種檢測(cè)儀器(包括光學(xué)儀器，生物儀器，化學(xué)儀器，如高內(nèi)涵篩選儀，流式細(xì)胞儀)檢測(cè) 分子水平、細(xì)胞水平和組織水平上核酸的分布和含量變化，有效地分析細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋 亡以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。核苷類似物(nucleosideanalogues)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，是一類具有類似脫 氧核糖核苷和核糖核苷結(jié)構(gòu)的化合物，本發(fā)明所述的核苷類似物能在細(xì)胞內(nèi)的核酸合成時(shí) 插入核酸中，且其帶有1，3_ 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)，可用于點(diǎn)擊反應(yīng)。
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1.標(biāo)記不同離體的游離細(xì)胞中的核酸時(shí)，所述細(xì)胞包括正常細(xì)胞和衍生細(xì)胞，包 括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(人或動(dòng)物，如老鼠、猴等)，包括從體液、器官、組織中提取的細(xì)胞(如 血液、腦，肝，肺，心臟，骨骼等)，包括各種類型的細(xì)胞(如基底細(xì)胞，上皮細(xì)胞，血小板， 淋巴細(xì)胞，τ細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞等)。以女性子宮頸癌細(xì)胞 (Hela)和小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)為例，本發(fā)明所提供的試劑盒可用于標(biāo)記其核酸，方便 于下一步檢測(cè)細(xì)胞中核酸變化。本發(fā)明將合成的不同“點(diǎn)擊”化學(xué)的核苷底物插入細(xì)胞內(nèi) 的核酸。以5-乙炔基尿嘧啶核苷為例，5-乙炔基尿嘧啶核苷進(jìn)入細(xì)胞后磷酸化成5-乙炔 基三磷酸尿苷，5-乙炔基三磷酸尿苷在細(xì)胞內(nèi)RNA合酶的作用下插入細(xì)胞的RNA序列中。2本發(fā)明可應(yīng)用于任何有生長(zhǎng)能力的生物組織的細(xì)胞中的核酸標(biāo)記，生物組織來(lái) 源包括單細(xì)胞生物、多細(xì)胞生物；包括人類，動(dòng)物，植物，細(xì)菌，原生動(dòng)物和真菌等；包括小 鼠，大鼠，兔，狗，貓，牛，豬，羊，馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物等)。本發(fā)明將合成的不同“點(diǎn)擊”化學(xué)的核苷類似物插入活體組織細(xì)胞內(nèi)的核酸?？梢?為各種給藥方式包括口腔，直腸，跨膜，經(jīng)皮或者腸道給藥；包括非腸道分布肌注，皮下， 脊髓內(nèi)給藥(注射)以及鞘內(nèi)的，直接心室和靜脈注射、腹腔的，鼻內(nèi)的(經(jīng)鼻的)或者眼 內(nèi)注射，另外，核苷類似物可用于局部給藥、非全身給藥、在長(zhǎng)效或緩釋配方中，通過(guò)直接注 射特定組織。以腹腔注射為例，本發(fā)明以腹腔注射給藥的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠注射炔基脫氧尿 嘧啶核苷。本發(fā)明將活體組織細(xì)胞中攜帶含“點(diǎn)擊”化學(xué)活性基團(tuán)的核酸，同對(duì)應(yīng)的“點(diǎn)擊” 化學(xué)活性基團(tuán)的生物分子探針，用“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)連接，使核酸被標(biāo)記，然后被標(biāo)記的核酸 可通過(guò)分子探針檢測(cè)方法檢測(cè)活體組織細(xì)胞中核酸?；铙w組織細(xì)胞可以通過(guò)不同方式獲 取，包括采集血樣、活檢法獲取組織(如針吸活檢、雷射捕捉微選取技術(shù)、切開(kāi)式活組織檢 驗(yàn))、器官或部分器官中獲取等等。獲取的細(xì)胞按照如前介紹檢測(cè)細(xì)胞中核酸方法檢測(cè)。本發(fā)明將攜帶“點(diǎn)擊”化學(xué)活性基團(tuán)核酸的組織同對(duì)應(yīng)的“點(diǎn)擊”化學(xué)活性基團(tuán)的 生物分子探針通過(guò)“點(diǎn)擊”化學(xué)反應(yīng)連接，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法著色(如固定、切片，在“點(diǎn) 擊”化學(xué)試劑的作用下培養(yǎng))。實(shí)施例1 構(gòu)建核酸標(biāo)記試劑盒1.核苷類似物合成1. 1含親偶極基團(tuán)核苷類似物合成本發(fā)明合成了如圖(2) (3)中結(jié)構(gòu)的親偶極基團(tuán)核苷類似物，5-乙炔基_2’ -脫 氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷 (XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5_乙炔 基胞嘧啶核苷(YC)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞 嘧啶核苷(XC)、2’ -脫氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、 2 ’ -脫氧-8- (1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8- (1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔 基-7-氮雜_2’脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔 基-7-氮雜_2 ’脫氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7- (1，7辛 二炔)-7-氮雜-2 ’脫氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7- (1，7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QXA)、 2’ -脫氧-8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YG)、2’ -脫氧_8_(1，7 辛二炔)"鳥(niǎo)嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基_7_氮雜-2’ 脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮 雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXG)。合成方 法是通過(guò)引入碘原子后引入各種炔基，合成路線類似，僅以2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿 嘧啶核苷(XTU)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶 核苷(父扔、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(乂0、8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG),5-乙炔 基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷(YTU)和5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)合成為例。2，-脫氧-5-(1，7辛二炔)_尿嘧啶核苷(XTU)合成5-碘-2 ‘-脫氧尿嘧啶核苷(1. 50g，4. 26mmol)PdC12(PPh3)2(0. 299g， 0. 426mmol)碘化亞銅(0. 161g,0. 852mmol)溶于 3mlDMF，加入(3. 9ml，21. 3mmol)N，N-二 異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三甲硅基-1，6 二辛炔(0. 908g，5. 54mmol)溶于lmlDMF， 緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^(guò)夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用IOOml乙酸乙酯溶 解，分別用IOOml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將 得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離， 梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0-10% )，得到產(chǎn)物0. 89g(63% )。譜圖數(shù)據(jù)=1HNMR(d6-DMS0, 400MHz) 61. 57 (m, 4H)，2. 11 (m, 2H)，2. 19 (m, 2H)，2. 38 (m, 2H)，2. 75 (m, 1H)，3. 55-3. 65 (m, 2H) ,3. 78 (dd, 1H)，4. 23 (m, 1H) ,5. 06 (t, 1H)，5. 22 (b，1H)，6. 10 (t，1H)，8· 10 (s, 1H)， 11. 3(bs, 1H)。2’ -脫氧-5-(l，7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XTC)合成5-碘-2'-脫氧尿嘧啶核苷(0. 6g, 1. 7mmol)Pd(PPh3)4(196mg,0. 17mmol)碘化 亞銅65. 5mg,0. 34mmol)溶于3mlDMF，加入Iml N，N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三 甲硅基_1，6 二辛炔(1. 8g，17mmol)溶于lmlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^(guò) 夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用IOOml乙酸乙酯溶解，分別用IOOml水、飽和NaCl溶液洗， 硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的 碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0-10% )， 得到產(chǎn)物 0. 42g(75% )。譜圖數(shù)據(jù)譜圖數(shù)據(jù)=1H NMR (d6-DMS0,400MHz) 1. 54-1. 62 (m， 4H, 2CH2)，2. 0-2. 15 (m, 3H, HR-C (2 ‘ )，CH2)，2. 22-2. 44 (m, 3H, H__C (2 ‘ )，CH2)，2. 76 (s, 1H, C = CH), 3. 54-3. 62 (m, 2H-C(5‘ ))，3. 79 (m，H-C(4' )),4. 20 (m, H-C(3‘ )) ,5. 04(t, OH-C(5‘ )) ,5. 20 (d, OH-C(3‘ )) ,6. 12 (t, H-C(1' ))，6. 71 (s，NH)，7. 67 (s，NH)，8. 07 (s， H-C (6))。5-(1，7辛二炔)_尿嘧啶核苷(KU)將2，3，5，-氧-三乙?；蜍?14g，37. 81mmol，leq)溶于 230mlCH3CN 中，向反 應(yīng)液中加入 I2 (4. 8g，18. 91mmol,0. 5eq)及 Ce (NH4)2 (NO3)6 (10. 36g，18. 9mmol,0. 5eq)，加熱 到80°C恒溫?cái)嚢鑜h。旋蒸除去溶劑，殘余物用300ml CH2Cl2溶解，有機(jī)層分別用200mlH20， 200ml 5% NaHSOjK溶液，200ml飽和食鹽水洗滌。水相用200ml CH2Cl2返萃，合并有機(jī)層。 旋干溶劑，過(guò)柱分離，洗脫劑比例PE EA 1 1，得白色固體產(chǎn)物5-碘-2’ 3’ 5’-氧-三 乙?；蜍?6. 9g，產(chǎn)率90%。將5-碘-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?5g，Iikimol，Ieq)溶于 IOOml CH2Cl2 (C2H5)3N 1 1 混合溶液中，N2保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdCl2(0. 53g，0. 757mmol，
90.075.q)，Cul(0.29g，1.5mmol，0·15eq)，l-三甲硅基 _1，6 二辛炔(3. 12g,6. 7ml, 21. 17mmol,2. Ieq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用IOOmlCH2Cl2溶解，有 機(jī)層用2X200ml 10% EDTA 二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200ml CH2Cl2 返萃，合并有機(jī)層，旋干溶劑，過(guò)柱分離，洗脫劑比例PE EA 3 1 1 1，得淡黃色泡沫 5_(三甲基硅1，7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?g，產(chǎn)率78. 2%。將5-(三甲基硅1，7辛二炔基)-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?12g，21. 22mmol， leq)溶于200mlCH3OH中，向其中加入28% NH3 · H2O(35ml, IOeq)，常溫?cái)嚢?h，向反應(yīng)液中 加入K2CO3 (2. 22g，16mmol, 1. 5eq)，常溫?cái)嚢柽^(guò)夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用少CH3OH H2O
1 1混合液溶解后過(guò)柱分離，洗脫劑比例CH2Cl2 CH3OH 7 1 1 1，得白色粉末狀 固體產(chǎn)物 4. 5g，產(chǎn)率 62%。1H NMR(d6-DMS0,400MHz) δ 1· 57 (m，4H)，2· 11 (m，2H)，2· 19 (m， 2H)，2. 38 (m, 2H)，2. 75 (m, 1H)，3. 55-3. 65 (m, 2H)，3. 78 (dd, 1H)，4. 23 (m, 1H)，5. 06 (t, 1H)， 5. 22 (b, 1H), 5. 26 (b, 1H) ,6. 10 (t, 1H) ,8. 10 (s，1H)，11. 3(bs, 1H)。5-(1，7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XC)5-碘-胞嘧啶核苷(3. Ig, 8. 5mmol)，Pd (PPh3) 4 (980mg, 0. 85mmol)，碘化亞銅 (327. 5mg，0. 34mmol)溶于30mlDMF，加入8ml N，N- 二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1-三 甲硅基_1，6 二辛炔(9g，85mmol)溶于lmlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^(guò) 夜。蒸干反應(yīng)溶劑后，混合物用IOOml乙酸乙酯溶解，分別用IOOml水、飽和NaCl溶液洗， 硫酸鎂干燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于2ml水，加入2當(dāng)量的 碳酸鉀，攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0-10% )， 得到產(chǎn)物 4. Ig (70% )。譜圖數(shù)據(jù)譜圖數(shù)據(jù)=1H NMR(d6-DMS0,400MHz) :1· 54-1. 62(m，4H， 2CH2)，2. 0-2. 15 (m, 3H, HR-C (2 ‘ )，CH2)，2. 22-2. 44 (m, 2H, CH2)，2. 76 (s, 1H, C = CH), 3. 54-3. 62(m,2H-C(5' ))，3. 79 (m，H-C(4' )),4. 20 (m, H-C(3‘ )) ,5. 04(t, OH-C(5‘))， 5. 20 (d, OH-C(3‘ )) ,5. 26 (d, OH-C(2‘ )) ,6. 12 (t, H-C(1' ))，6. 71 (s，NH)，7. 67 (s，NH)， 8. 07 (s，H-C (6)).8-(1，7辛二炔)_鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)8-碘-鳥(niǎo)嘌呤核苷 4. 08g，(IOmmol)，Pd (PPh3) 4(1. lg，lmmol)，碘化亞銅(0. 28g,
1.5mmol)溶于lOOmlDMF，加入IOml N，N-二異丙基乙胺室溫?cái)嚢?0分鐘。1_三甲硅基_1， 6 二辛炔17. 8g, IOOmmol)溶于15mlDMF，緩慢滴入反應(yīng)體系，滴加完后常溫?cái)嚢柽^(guò)夜。蒸干 反應(yīng)溶劑后，混合物用500ml乙酸乙酯溶解，分別用200ml水、飽和NaCl溶液洗，硫酸鎂干 燥有機(jī)層后旋干，直接用于下一步反應(yīng)。將得到的固體溶于20ml水，加入2當(dāng)量的碳酸鉀， 攪拌1小時(shí)。旋干反應(yīng)液，直接柱層析分離，梯度洗脫(甲醇乙酸乙酯0-10% )，得到產(chǎn) 物 2. lg(56% ) ο 譜圖數(shù)據(jù)=1H NMR(d6-DMS0,400MHz) 1. 54-1. 62 (m，4H)，2. 0-2. 15(m，4H)，
2.79 (s，1H)，3· 2-3. 8(m，2H)，4-4. 5 (m，2H)，4. 8 (d，1H)，5. 1 (t, 1H)，6· 5(d, 1Η)，8· 5—9 (b， 1Η).將5-碘-3，5，-氧-二乙?；?2，-脫氧尿苷(16g，36. 52mmol，leq)溶于 200ml CH2Cl2 (C2H5)3Nl 1 混合溶液中，N2 保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdCl2(l. 59g，2. 27mmol， 0. 075eq)，CuI (0. 86g, 4. 52mmol, 0. 15eq),三甲基硅基乙炔(6. 24g, 8. 8ml，63. 53mmol, 2. leq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用300mlCH2Cl2溶解，有機(jī)層用
2X 200ml 10 % EDTA 二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200ml CH2Cl2返萃，合并有機(jī)層，旋干溶劑，過(guò)柱分離，洗脫劑比例PE EA 3 1 1 1，得淡黃色泡沫11.65g， 5_[(三甲基硅基)乙炔基]_3，5，-氧-二乙?；鵢2，-脫氧尿苷，產(chǎn)率78%。將5_[(三甲基硅基)乙炔基]-3，5，-氧-二乙?；?2，-脫氧尿苷(llg， 26. 93mmol, leq)溶于 IOOmlCH3OH 中，向其中加入 28% NH3 .H2O (15ml，IOeq)，常溫?cái)嚢?2h， 向反應(yīng)液中加AK2CO3 (4. 44g，32. 13mm0l，1.5eq)，常溫?cái)嚢柽^(guò)夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用 少CH3OH H2O 1 1混合液溶解后過(guò)柱分離，洗脫劑比例CH2Cl2 CH3OH 7 1 1 1， 得白色粉末狀固體產(chǎn)物4. lg，產(chǎn)率64%。核磁數(shù)據(jù)=1H NMR δ 2. 10-2. 14 (m，2Η，Η-2，2，，)， 3. 54-3. 64(m，2H，H-5，，5”)，3. 78-3. 80 (m, 1H，H_4，)，4. 23-4. 25 (m, 1H，H_3，)，5. 14，5. 24 (t and d ； IH and IH ；OH，s),6.09 (t, J = 6. 6Hz,1H, H_l，),8. 39(s,1H, H—61，11. 65(s,1H, NH)；5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)將5-碘-2，3，5，-氧-三乙?；蜍?15g，30. 23mmol, leq)溶于 200ml CH2Cl2 (C2H5)3N 1 1 混合溶液中，N2 保護(hù)下向其中加入(PPh3)2PdCl2(l. 59g，2. 27mmol， 0. 075eq)，CuI (0. 86g, 4. 52mmol, 0. 15eq),三甲基硅基乙炔(6. 24g, 8. 8ml，63. 53mmol, 2. leq)，N2保護(hù)下常溫?cái)嚢?0h，旋蒸除去溶劑，殘余物用300mlCH2Cl2溶解，有機(jī)層用 2 X 200ml 10 % EDTA 二鈉水溶液，200ml飽和食鹽水溶液洗滌，水層用200ml CH2Cl2返萃，合 并有機(jī)層，旋干溶劑，過(guò)柱分離，洗脫劑比例PE EA 3 1 1 1，得淡黃色泡沫5-[(三 甲基硅基)乙炔基]_2，3，5，-氧-三乙?；蜍?1. 4g，產(chǎn)率81%。將5_[(三甲基硅基)乙炔基]-2，3，5，-氧-三乙酰基尿苷(10g，21. 44mmol， leq)溶于IOOmlCH3OH中，向其中加入28 % NH3 · H2O(15ml，IOeq)，常溫?cái)嚢?h，向反應(yīng) 液中加入K2CO3 (4. 44g，32. 13mmo 1，1. 5eq)，常溫?cái)嚢柽^(guò)夜。旋蒸除去溶劑，殘余物用少 CH3OH H2O 1 1混合液溶解后過(guò)柱分離，洗脫劑比例CH2Cl2 CH3OH 7 1 1 1，得 白色粉末狀固體產(chǎn)物3. 65g，產(chǎn)率67. 53%。譜圖數(shù)據(jù)=1H NMR δ 3. 54-3. 70 (m，2H，H-5，， 5”)，3. 85-3. 87 (m, 1H，H_4，)，3. 96-3. 99 (m, 1H，H_3，，4. 01-4. 05 (m, 1H，H_2，)，5. 07,5. 26， 5. 42 (d, t, and d, 1H, 1H, and 1H, OH，s)，5. 72 (d, J = 4. 6Hz, 1H, Η-Γ )，8. 48 (s, 1H, H_6)， 11. 65 (br s，lH，NH)；1. 2. 1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物本發(fā)明合成了圖(4) (5)中含1，3_二偶極基團(tuán)核苷類似物，包括5-疊氮基-2’-脫 氧尿嘧啶核苷(DTU)、5_乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5_疊氮基-2’ -脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、 5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脫氧-8-疊氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8_疊氮基-腺嘌呤核 苷(DA)、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DTG)、8_疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DG)。其中1， 3- 二偶極基團(tuán)修飾嘌呤核苷按照已有文獻(xiàn)合成。1，3_ 二偶極基團(tuán)修飾嘧啶核苷合成是首 先合成氨基核苷通過(guò)重氮化反應(yīng)活化氨基，用疊氮基取代氨基，得到對(duì)應(yīng)的1，3_ 二偶極基 團(tuán)修飾嘧啶核苷，以5-疊氮基-尿嘧啶核苷合成為例。5-疊氮基_尿嘧啶核苷合成將2. 59g (IOmmol) 5_氨基-尿嘧啶核苷在冰浴中溶于30ml的IN HCl，加入 10mmOlNaN02，攪拌2分鐘后加入20gNaN3，室溫?cái)嚢?小時(shí)后用氨水中和至中性，蒸干溶劑 后，直接上柱，二氯甲烷甲醇10 1得到產(chǎn)物1.31g產(chǎn)率46%譜圖數(shù)據(jù)=1H NMR(d6-DMS0, 400MHz) 3. 5-4 (m, 4H)，4. 1-4. 53 (m, 3H)，4. 8-5. 1 (m, 3H)，6. 12 (d, 1H)，6. 71 (s，1H)，7. 97 (s，1H)2.生物探針?lè)肿雍铣杀景l(fā)明合成了疊氮基和炔基吲哚類菁熒光探針，合成了 6-疊氮己胺，購(gòu)買了丙炔 胺和BODIPY類熒光探針琥珀酰亞胺酯，Alexa Fluor類熒光探針琥珀酰亞胺酯，以及FAM、 FITC、羅丹明琥珀酰亞胺酯。用6-疊氮己胺和丙炔胺同購(gòu)買的熒光探針琥珀酰亞胺酯反應(yīng) 得到對(duì)應(yīng)的含1，3-二偶極基團(tuán)和親偶極基團(tuán)的熒光探針，并合成了生物素探針。吲哚菁類 熒光探針如下，6-疊氮己胺合成和氨基同琥珀酰亞胺酯反應(yīng)按照文獻(xiàn)報(bào)道不加贅述。吲哚菁類熒光探針合成1,1, IM'-四甲基-3-乙基-3，-疊氮基丙基-吲哚三甲川花菁(Cy3)合成4. 55g(IOmmol) 1,1-甲基3_乙基_2_(β-苯胺)乙烯基-吲哚啉和 4. 20g(IOmmol) 1，1，2_三甲基-3-疊氮基丙基-吲哚啉于50mL吡啶和2mL乙酸酐中，加 熱回流過(guò)夜。將溶劑蒸發(fā)后反應(yīng)混合物溶于IOOml 二氯甲烷，IOOml水洗二氯甲烷層三 次，IOOml飽和NaCl溶液洗二氯甲烷層，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析。洗脫劑甲醇二氯 甲烷(0-10% )的產(chǎn)物 2. 12g(36. 8% )譜圖數(shù)據(jù)=1HNMR (CDCl3,400ΜΗζ) δ 0. 98-1. 02 (t, 3H)，1. 52-1. 61 (m, 2H)，1. 89-1. 96 (m, 2H)，2. 06 (s, 12H)，2. 81 (s,3H)，4. 17-4. 25 (t,2H)， 7. 25-7. 53 (m, 4H)，7. 55-7. 60 (d, 2H)，7. 62-7. 68 (d, 2H)，7. 90-8. 00 (d, 4H)，8. 08-8. 15 (d, 2H) ,8. 58-8. 62 (t, 1H)。1-乙基-1’-疊氮正己基-3，3，3’，3’_四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁(Cy5) 合成3. 96g(IOmmol) 1_乙基_2_正苯胺基丁二烯基_3，3_ 二甲基_6_磺酸基吲哚， 3. 98g (IOmmol) 1-疊氮正己基_2，3，3-三甲基吲哚碘鹽溶于25mL吡啶和25mL乙酸酐中， 加熱回流過(guò)夜。將溶劑蒸發(fā)后反應(yīng)混合物溶于IOOml 二氯甲烷，IOOml水洗二氯甲烷層三 次，IOOml飽和NaCl溶液洗二氯甲烷層，硫酸鈉干燥后旋干，柱層析。洗脫劑甲醇二氯甲 燒(0-10% )的產(chǎn)物 2. 85g(35. 9% )譜圖數(shù)據(jù)=1Hnmr(CdcI3JOOMHz) δ 1. 24-1. 39 (m，5H)， 1. 53 (s，12H)，1. 68 (m, 6H)，3. 25 (t,2H)，3. 36 (t,2H)，4. 05 (t, 2H)，6. 09 (d, 1H)，6. 29 (d, 1H)，6. 74 (t, 1H)，6. 94-7. 35 (m, 7H)，7. 94 (q, 2H)。本發(fā)明購(gòu)買了BODIPY 630/650-X，SE、BODIPY FL，SE,BODIPY 530/550, SE、BODIPY 493/503，SE、BODIPY 558/568，SE、BODIPY 564/570，SE、BODIPY 576/589，SE、BODIPY 581/591，SE、BODIPY FL-X，SE、BODIPY TR-X，SE、BODIPY TMR-X, SE、BODIPY R6G，SE、BODIPY FLC5, SEiH^SAlexa Fluor 350、405、430、488、 500、514、532、555、546、568、594、610、633、647、660、680、700、750 和 FAM、FITC、羅丹明琥珀 酰亞胺酯，用這些活化好的熒光探針和丙炔胺反應(yīng)，得到含親偶極基團(tuán)的熒光探針，用這些 活化好的熒光探針和6-疊氮己胺反應(yīng)得到含1，3-二偶極基團(tuán)的熒光探針。疊氮基三甘醇生物素合成Ig (4. 09mmol)生物素溶于 10ml DMF，加入 0. 942g(8. 19mmol) N-羥基琥珀酰亞胺， 1.57g(8. 19mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。蒸干 溶劑將反應(yīng)物溶于二氯甲烷，水洗，產(chǎn)物析出。干燥后得產(chǎn)物1.02g(73% )。將lg(2. 93mmol)產(chǎn)物直接溶于5ml DMF，加入1. 531g(8. 79mmol)疊氮三甘醇 胺，攪拌過(guò)夜。蒸干反應(yīng)液，將反應(yīng)物混合物溶于IOml 二氯甲烷，IOml水洗三次，飽和
12NaCl洗三次，干燥旋干后柱層析純化。得到產(chǎn)物0.93g(79% )。譜圖數(shù)據(jù)^HNMRO^Cl， 400MHz) δ 1. 34-1. 47 (m, 2H)，1. 54-1. 78 (m, 4H)，2. 15-2. 13 (t,2H)，2. 68-2. 76 (d, 1H)， 2. 84-2. 92 (m, 1H)，3. 06-3. 16 (m, 1H)，3. 34-3. 44 (m, 4H)，3. 52-3. 7 (m, 10H)，4. 28-4. 31 (m, 1H)，4. 44-4. 5 (m, 1H)。3.催化劑、催化劑穩(wěn)定劑和反應(yīng)體系的建立 以上反應(yīng)條件下反應(yīng)過(guò)夜，旋干反應(yīng)液直接柱層析純化。本實(shí)驗(yàn)表明，在不同銅催 化劑下，不同催化劑穩(wěn)定劑下，不同溶劑體系中，都可以進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)。譜圖數(shù)據(jù)=1HNMR (CDCl3, 400MHz) δ 0. 75-2. 5 (m，44H)，3. 0-3. 2 (s，1H)， 3. 4-3. 8 (m, 14H)，3. 9-4. 2 (b,4H)，4. 3-4. 8 (b,3H)，5. 2-5. 4 (s, 1H)，6. 20-6. 5 (s, 1H)， 8. 1-9. 5(b，3H)。實(shí)施例2 細(xì)胞水平利用“點(diǎn)擊”反應(yīng)試劑盒標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有親偶極基團(tuán)核苷類似物5_乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5_乙炔基尿嘧啶 核苷(YU)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷 (XU)、5_乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧_5_(1， 7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脫氧-8-乙炔 基_腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)_腺嘌 呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤 核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌 呤核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-2’脫 氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤核苷_、2，-脫氧-8-乙炔 基_鳥(niǎo)嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YG)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)_鳥(niǎo)嘌呤 核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基_7_氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷 (QYTG)、7_乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7_乙炔基-7-氮雜_2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷 (QYTG)、7_乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7_(1，7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌 呤核苷(QXTG)、或7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXG)。其中可分為2’脫氧核糖 核苷和核糖核苷兩類，前者可修飾DNA后者修飾RNA。在實(shí)際操作中，可選擇其中的一種或 多種與分子探針、催化劑等組成試劑盒使用，其效果一致。激發(fā)光譜492 597nm含1，3_ 二偶極基團(tuán)的熒光分子探針含1，3-二偶極基 團(tuán)的吲哚三甲川菁、BODIPY FL、BODIPY 530/550、BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY FL-X, BODIPY TMR-X、BODIPY R6G、BODIPY FLC5,以及 Alexa Fluor 350、405、430、488、 500、514、532、555、546、568和FITC、羅丹明，在實(shí)際操作中，可選擇其中的一種或多種與對(duì) 應(yīng)的核苷類似物、催化劑等組成試劑盒使用，其效果一致。催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；
14
溶劑水和DMSO混合溶液(2)核酸標(biāo)記“點(diǎn)擊”反應(yīng)液配置lyM-lMlTris(pH 8. 5)，1 μ M-1M CuS04， 0. 5 μ Μ-5Μ分子探針(花菁疊氮基染料)和1 μ M-IM抗壞血酸鈉以及DMSO配置而成。炔基核苷標(biāo)記細(xì)胞Hela細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞接種于96孔板，分別用含10%胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)液和含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終 濃度InM-IOOOnM含親偶極基團(tuán)的2’脫氧核糖核苷類似物(如5-乙炔基-2'-脫氧尿 嘧啶核苷(YTU))或InM-IOOOnM含親偶極基團(tuán)核糖核苷類似物(如5-乙炔基尿嘧啶核苷 (YU))，再培養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸 沖洗5min，0. 2% Tritonx-100透化lOmin，然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完 后，用0. 5% Tritonx-IOO沖洗若干次，核酸被標(biāo)記。其標(biāo)記的原理是2’脫氧核糖核苷類 似物和核糖核苷類似物加入培養(yǎng)基后，進(jìn)入細(xì)胞。在Hela細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，取 代正常的核苷參與細(xì)胞的DNA和RNA合成，新生成的DNA和RNA含有相應(yīng)YTU和YU基團(tuán)， 經(jīng)過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)，被熒光分子探針標(biāo)記。染完色的細(xì)胞可以進(jìn)行Hoechst染色或免疫熒光染色等常規(guī)染色。制備好的樣品 直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像或置4°C暫時(shí)保存。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7。從圖6和圖7 可知，Hela和NIH3T3細(xì)胞的DNA和RNA已被標(biāo)記。細(xì)胞內(nèi)的DNA主要分布在細(xì)胞核；RNA 則分布在整個(gè)細(xì)胞，但含量存在區(qū)域差異，其中核仁區(qū)域的RNA含量最強(qiáng)。實(shí)施例3 細(xì)胞水平利用不同濃度銅離子催化“點(diǎn)擊”反應(yīng)(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有核苷類似物YTU生物分子探針花菁疊氮基染料(1，1，1’，1’ -四甲基-3-乙基-3’ -疊氮基丙 基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’ -疊氮正己基-3，3，3’，3’ -四甲基-6-磺酸基-吲哚 五甲川花菁)；催化劑CuSO4、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸=Hela細(xì)胞接種于96孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。 培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM 5-乙炔基-2 ‘-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)， 再培養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗 5min,0. 2% Tritonx-100透化lOmin，然后分別加入不同終濃度CuSO4的“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵 育 10-30min。CuSO4 終濃度分別為 OnMUOOnM 和 ΙΟΟΟηΜ。反應(yīng)完后，用 0. 5% Tritonx-100 沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像和數(shù)據(jù)分析。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。 從圖8可知，在無(wú)銅離子催化條件下，“點(diǎn)擊反應(yīng)”無(wú)法發(fā)生。比較CuSO4終濃度為IOOnM和 IOOOnM時(shí)的點(diǎn)擊反應(yīng)強(qiáng)度，CuSO4終濃度為IOOOnM的“點(diǎn)擊”反應(yīng)比較強(qiáng)。實(shí)施例4 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜300 492nm系列生物分子探針和含親偶極基 團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有含親偶極基團(tuán)核苷類似物5_乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5_乙炔基尿嘧 啶核苷(YU)、2’_脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷
15(XU)、5_乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧_5_(1， 7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脫氧-8-乙炔 基_腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤 核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基_7_氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷 (QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7_乙炔基-7-氮雜_2’脫氧-腺嘌呤核苷 (QYTA) ,7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌 呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤核苷_、2，-脫氧-8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌 呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YG)、2’_脫氧-8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XTG)、 8_ (1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙 炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙 炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7- (1，7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXTG)、 7_(1，7辛二炔)-7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXG)中的任一種，其效果一致。激發(fā)光譜300 492nm含1，3-二偶極基團(tuán)的熒光分子探針包括含1，3_ 二偶極 基團(tuán)的BODIPY FL、Alexa Fluor 350、405、430、488、500 中的任一種，其效果一致。催化劑CuSO4、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸A549細(xì)胞接種于96孔板，用含10%胎牛血清的F12培 養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM含親偶極基團(tuán)核苷類似物，再培 養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min， 0. 2% Tritonx-100透化lOmin，然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完后，用0. 5% Tritonx-IOO沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像。以標(biāo)記DNA的含親偶極基團(tuán)核苷類似 物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。從圖9可知，利用激發(fā)光譜390 492nm系列生物分子探 針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的DNA。實(shí)施例6 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜492 597nm系列生物分子探針探針和含親偶 極基團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有親偶極基團(tuán)核苷類似物5_乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5_乙炔基尿嘧啶 核苷(YU)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷 (XU)、5_乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧_5_(1， 7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脫氧-8-乙炔 基_腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤 核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基_7_氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷 (QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7_乙炔基-7-氮雜_2’脫氧-腺嘌呤核苷 (QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7_(1，7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-腺嘌 呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-腺嘌呤核苷(QXA)、2’ -脫氧-8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌 呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YG)、2’_脫氧-8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XTG)、 8_ (1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙 炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7- (1，7辛二炔)-7-氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXTG)、 7_(1，7辛二炔)-7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXG)。其中可分為2’脫氧核糖核苷和核糖核苷兩 類，前者可修飾DNA后者修飾RNA ；選擇其中的任一種，其效果一致。激發(fā)光譜492 597nm含1，3_ 二偶極基團(tuán)的熒光分子探針含1，3_ 二偶極基 團(tuán)的吲哚三甲川菁、BODIPY FL、BODIPY 530/550、BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY FL-X, BODIPY TMR-X、BODIPY R6G、B0DIPY FLC5、以及 Alexa Fluor 350、405、430、488、 500、514、532、555、546、568和FITC、羅丹明；選擇其中的任一種，其效果一致。催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸A549細(xì)胞接種于96孔板，用10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)培 養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM含親偶極基團(tuán)核苷類似物，再培養(yǎng)24h。 移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min，0. 2 % Tritonx-100透化IOmin,然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完后，用0. 5 % Tritonx-100沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像。以標(biāo)記DNA的含親偶極基團(tuán)核苷類似 物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。從圖10可知，利用激發(fā)光譜492 597nm系列生物分子 探針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的DNA。實(shí)施例7 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜597 770nm系列生物分子探針和含親偶極基 團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有親偶極基團(tuán)核苷類似物5_乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)、5_乙炔基尿嘧啶 核苷(YU)、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷 (XU)、5_乙炔基-2，-脫氧胞嘧啶核苷(YTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2，-脫氧_5_(1， 7辛二炔)_胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2，-脫氧-8-乙炔 基_腺嘌呤核苷(YTA)、8_乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)_腺嘌 呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤 核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7_乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌 呤核苷(QYTA)、7_乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-2’脫 氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤核苷_、2，-脫氧-8-乙炔 基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(YG)、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤 核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基_7_氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷 (QYTG)、7_乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7_乙炔基-7-氮雜_2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷 (QYTG)、7_乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QYG)、7_(1，7辛二炔)~7~氮雜-2，脫氧-鳥(niǎo)嘌 呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷(QXG)。其中可分為2’脫氧核糖核 苷和核糖核苷兩類，前者可修飾DNA后者修飾RNA。選擇其中的任一種，與相應(yīng)的分子探針 配用，其效果一致。激發(fā)光譜597 770nm含1，3_ 二偶極基團(tuán)的熒光分子探針含1，3_ 二偶極基團(tuán)的 吲哚五甲川菁、BODIPY 630/650-X、BODIPY TR_X、BODIPY FLC5、以及 Alexa Fluor594、610、633、647、660、680、700、750。催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸A549細(xì)胞接種于96孔板，用含10 %胎牛血清的F12培養(yǎng)液培 養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM含親偶極基團(tuán)核苷類似物，再培養(yǎng)24h。 移走培養(yǎng)液，每孔加入100μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min，0. 2 % Tritonx-100透化IOmin,然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完后，用0. 5 % Tritonx-IOO沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像。以標(biāo)記DNA的含親偶極基團(tuán)核苷類似 物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。從圖11可知，利用激發(fā)光譜597 770nm系列生物分子 探針和含親偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的DNA。實(shí)施例8 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜300 492nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶極 基團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物5_疊氮基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷(DTU)、5_乙炔基 尿嘧啶核苷(DU)、5_疊氮基-2’-脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脫 氧-8-疊氮基_腺嘌呤核苷(DTA)、8_疊氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo) 嘌呤核苷(DTG)、8_疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DG)中的任一種。激發(fā)光譜300 492nm含親偶極基團(tuán)的熒光分子探針包括含親偶極基團(tuán)的 BODIPY FL、Alexa Fluor 350、405、430、488、500 中的任一種；催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸NIH3T3細(xì)胞接種于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM的1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似 物，再培養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖 洗5min，0.2% Tritonx-100透化lOmin，然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完 后，用0. 5% Tritonx-100沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像。以標(biāo)記RNA的1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷 類似物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。從圖12可知，利用激發(fā)光譜390 492nm系列生物 分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的RNA。實(shí)施例9 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜492 597nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶極 基團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物5_疊氮基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷(DTU)、5_乙炔基 尿嘧啶核苷(DU)、5_疊氮基-2’-脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脫 氧-8-疊氮基_腺嘌呤核苷(DTA)、8_疊氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo) 嘌呤核苷(DTG)、8_疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DG)中的任一種。激發(fā)光譜492 597nm含1親偶極基團(tuán)的熒光分子探針含親偶極基團(tuán)的吲哚 三甲川菁、BODIPY FL、BODIPY 530/550、BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、
18BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY FL_X、BODIPY
TMR-X> BODIPY R6G、BODIPY FLC5、以及 Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、 532、555、546、568和FITC、羅丹明中的任一種；催化劑CuSO4、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸NIH3T3細(xì)胞接種于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培 養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM的1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物，再培 養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min， 0. 2% Tritonx-100透化lOmin，然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育l_300min。反應(yīng)完后，用0. 5% Tritonx-IOO沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像和數(shù)據(jù)分析。以標(biāo)記RNA的1，3_二偶極 基團(tuán)核苷類似物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示。從圖13可知，利用激發(fā)光譜492 597nm 系列生物分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞 內(nèi)的RNA。實(shí)施例10 細(xì)胞水平利用激發(fā)光譜597 770nm系列生物分子探針和1，3_ 二偶 極基團(tuán)核苷類似物通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)檢測(cè)核酸(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物5_疊氮基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷(DTU)、5_乙炔基 尿嘧啶核苷(DU)、5_疊氮基-2’-脫氧胞嘧啶核苷(DTC)、5_乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脫 氧-8-疊氮基_腺嘌呤核苷(DTA)、8_疊氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo) 嘌呤核苷(DTG)、8_疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷(DG)中的任一種。激發(fā)光譜597 770nm含親偶極基團(tuán)的熒光分子探針含親偶極基團(tuán)的吲哚五甲 川菁、BODIPY 630/650-X、BODIPY TR-X、BODIPY FLC5、以及 Alexa Fluor 594、610、 633、647、660、680、700、750 中的任一種。催化劑CuSO4、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸NIH3T3細(xì)胞接種于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培 養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液加入終濃度InM-IOOOnM的1，3-二偶極基團(tuán)核苷類似物，再培 養(yǎng)24h。移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min， 0. 2% Tritonx-100透化lOmin，然后加入“點(diǎn)擊”反應(yīng)液孵育10_30min。反應(yīng)完后，用0. 5% Tritonx-100沖洗若干次，核酸被標(biāo)記，其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像和數(shù)據(jù)分析。以標(biāo)記RNA的1，3_二偶極 基團(tuán)核苷類似物為例，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示。從圖14可知，利用激發(fā)光譜597 770nm 系列生物分子探針和1，3_ 二偶極基團(tuán)核苷類似物，通過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)可以清楚地標(biāo)記細(xì)胞 內(nèi)的RNA。實(shí)施例11 細(xì)胞水平利用“點(diǎn)擊”反應(yīng)試劑盒檢測(cè)凋亡因子對(duì)細(xì)胞增殖的影響(1)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有核苷類似物YTU生物分子探針花菁疊氮基染料(1，1，1’，1’ -四甲基-3-乙基-3’ -疊氮基丙基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-Γ _疊氮正己基_3，3，3，，3，-四甲基-6-磺酸基-吲哚 五甲川花菁)；催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸A549細(xì)胞接種于96孔板，含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng) 24h后，在對(duì)照組加入終濃度InM-IOOOnM 5-乙炔基-2 ‘-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)；在凋亡 誘導(dǎo)因子A刺激組加入終濃度InM-IOOOnM 5-乙炔基-脫氧尿嘧啶核苷(YTU)和1 μ 1 凋亡誘導(dǎo)因子A ；在凋亡誘導(dǎo)因子B刺激組加入終濃度InM-IOOOnM 5-乙炔基-2'-脫氧 尿嘧啶核苷(YTU)和1凋亡誘導(dǎo)因子B。培養(yǎng)12h后，移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4% 多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min，0. 2 % Tritonx-100透化lOmin，然后加入 click反應(yīng)液(同實(shí)施例2)孵育10-30min。反應(yīng)完后，用0. 5% Tritonx-100沖洗若干次， 核酸被標(biāo)記。其標(biāo)記原理與實(shí)施例2相同。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集圖像和數(shù)據(jù)分析。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。 從圖15的圖象和數(shù)據(jù)分析可知，正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞增殖正常。而在凋亡誘導(dǎo)因子A和 凋亡誘導(dǎo)因子B刺激條件下，細(xì)胞增殖受阻，與對(duì)照組相比，其增殖細(xì)胞數(shù)目明顯下降。實(shí)施例12 細(xì)胞水平利用“點(diǎn)擊”反應(yīng)試劑盒檢測(cè)凋亡因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(1.)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有核苷類似物YU生物分子探針花菁疊氮基染料(1，1，1’，1’ -四甲基-3-乙基-3’ -疊氮基丙 基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’ -疊氮正己基-3，3，3’，3’ -四甲基-6-磺酸基-吲哚 五甲川花菁)；催化劑CuS04、抗壞血酸鈉；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)標(biāo)記核酸A549細(xì)胞接種于96孔板，含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。培 養(yǎng)24h后，在對(duì)照組加入終濃度0. 01-100 μ M 5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)，在凋亡刺激組加 入終濃度0.01-100 μ M 5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)和1μ 1凋亡誘導(dǎo)因子Α，再培養(yǎng)12h。 移走培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 4%多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸沖洗5min，0. 2 % Tritonx-100透化lOmin，然后加入click反應(yīng)液(同實(shí)施例2)孵育10_30min。反應(yīng)完后， 用0. 5% Tritonx-100沖洗若干次。核酸被標(biāo)記。染完色的細(xì)胞可以進(jìn)行Hoechst常規(guī)染色。制備好的樣品直接用高內(nèi)涵儀器采集 圖像和數(shù)據(jù)分析。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示。從圖16可知，正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 良好，DNA和RNA的合成正常。而在凋亡誘導(dǎo)因子A刺激條件下，細(xì)胞核固縮，DNA和RNA的 合成出現(xiàn)異常，其DNA/RNA比值與正常條件下的DNA/RNA比值相比偏大。實(shí)施例13 在動(dòng)物水平利用“點(diǎn)擊”反應(yīng)試劑盒標(biāo)記小鼠體內(nèi)核酸(1.)本實(shí)施例核酸標(biāo)記試劑盒包括有核苷類似物YTU生物分子探針花菁疊氮基染料(1，1，1’，1’ -四甲基-3-乙基-3’ -疊氮基丙 基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’ -疊氮正己基-3，3，3’，3’ -四甲基-6-磺酸基-吲哚 五甲川花菁)；
20
催化劑CuS04、抗壞血酸；溶劑水和DMSO混合溶液。(2)核酸標(biāo)記小鼠腹腔注射1 μ g-0. 5mg的YTU/YU。注射l_240h的過(guò)程中獲取 小鼠小腸等器官，用福爾馬林固定和石蠟包埋并切片。去除石蠟和復(fù)水后，加入同實(shí)施例3 所述的點(diǎn)擊反應(yīng)液孵育lmin-48h。反應(yīng)完后，0. 5% Tritonx-IOO沖洗若干次，核酸被標(biāo)記。 其標(biāo)記的原理是YTU/YU以腹腔注射方式注入小鼠體內(nèi)后，進(jìn)入小腸細(xì)胞。在小腸細(xì)胞增 殖時(shí)，YTU/YU以脫氧尿嘧啶類似物參與細(xì)胞的DNA/RNA合成，新生成的DNA和RNA含有相 應(yīng)YTU或YU基團(tuán)，經(jīng)過(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)，被花菁疊氮基染料標(biāo)記。染完色的細(xì)胞可以進(jìn)行Hoechst染色或免疫熒光染色。制備好的樣品直接用高內(nèi) 涵儀器采集圖像或置4°C暫時(shí)保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17，從圖17可知，小鼠小腸細(xì)胞的DNA 已被標(biāo)記。小腸細(xì)胞內(nèi)的DNA主要分布在細(xì)胞核。以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的 專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
權(quán)利要求
一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，主要包括有(A)能夠在活細(xì)胞內(nèi)核酸合成的過(guò)程中插入核酸序列中的、帶有1，3 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物；(B)含有與上述1，3 二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3 二偶極基團(tuán)的生物分子探針；核苷類似物與生物分子探針通過(guò)所述1，3 二偶極基團(tuán)能與對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述1，3_二偶極基 團(tuán)為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；親偶極基團(tuán)為烯基、或炔基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述烯基為乙烯基、 或丁烯基；所述炔基為乙炔基、丙炔基，或環(huán)狀炔基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述核苷類似物為 5-乙炔基_2’ -脫氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基尿嘧啶核苷、2’ -脫氧-5-(1，7辛二炔)_尿嘧 啶核苷、5_(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2’-脫氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核 苷、2’-脫氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、2’-脫氧_8_乙 炔基_腺嘌呤核苷、8-乙炔基-腺嘌呤核苷、2’ -脫氧-8-(1，7辛二炔)_腺嘌呤核苷、 8_(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮 雜_腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮雜-腺嘌呤 核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-2’脫氧-腺嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮雜-腺嘌呤 核苷、2’ -脫氧-8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷、8-乙炔基-鳥(niǎo)嘌呤核苷、2’ -脫氧-8-(1，7辛二 炔)"鳥(niǎo)嘌呤核苷、8_(1，7辛二炔)-鳥(niǎo)嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核 苷、7-乙炔基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷、7-乙炔 基-7-氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7_氮雜-2’脫氧-鳥(niǎo)嘌呤核苷、7-(1，7辛二 炔)-7_氮雜-鳥(niǎo)嘌呤核苷、5-疊氮基-2’ -脫氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基尿嘧啶核苷、5-疊 氮基-2’ _脫氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核苷、2’脫氧-8-疊氮基-腺嘌呤核苷、8-疊 氮基_腺嘌呤核苷、2’脫氧-8-疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷、或8-疊氮基-鳥(niǎo)嘌呤核苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針 為生物熒光探針、免疫探針、生物素、抗原或半抗原、放射性探針?lè)肿印⒐飧刑结樂(lè)肿?、或?白標(biāo)簽分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針 為激發(fā)波長(zhǎng)300nm-1000nm的熒光探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述生物分子探針 為吲哚菁類、BODIPY類、Alexa Fluor類、FAM、FITC、或羅丹明生物熒光探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述試劑盒還包括 有催化劑、溶劑，所述催化劑為含亞銅離子化合物；所述溶劑為水、四氫呋喃、DMS0、乙腈、或 四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或上述化合物的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，含亞銅離子化合物 為硫酸銅和抗壞血酸、溴化亞銅、Cu (CH3) 4PF6、C54H45BrP5Cu、或Cu絲。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述試劑盒還 包括催化劑穩(wěn)定劑，該催化劑穩(wěn)定劑為TBTA，TCEP中的一種或多種。
11.一種標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)將1，3_二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物在核酸合成的過(guò)程中插入到核酸 序列中，核酸被修飾；(2)再加入含與上述1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3_二偶 極基團(tuán)的生物分子探針，含亞銅離子化合物的催化劑和溶劑，在常溫下被修飾的核酸與生 物分子探針進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)，核酸被標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，所述核酸為體外游 離細(xì)胞內(nèi)核酸，(1)步驟為將1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物與含有待標(biāo)記核 酸的細(xì)胞共孵育，核苷類似物插入到待標(biāo)記核酸序列中，核酸被修飾。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，該核酸為生物體的 組織細(xì)胞中核酸，(1)步驟為將1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物以任何一種給 藥方式注入生物體的組織的活體中，4 96小時(shí)后，獲取需標(biāo)記核酸的器官，用福爾馬林固 定和石蠟包埋并切片，去除石蠟和復(fù)水后，核酸被修飾。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，所述1，3_二偶極基 團(tuán)為氧化腈基、疊氮基、重氮甲基、硝酮基、或腈胺基；親偶極基團(tuán)為烯基、或炔基。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，所述烯基為乙烯基、 或丁烯基；所述炔基為乙炔基、丙炔基，或環(huán)狀炔基。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的試劑盒，其特征是，所述生物分子探 針為激發(fā)波長(zhǎng)300nm-1000nm的熒光探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，所述溶劑為水、四氫 呋喃、DMS0、乙腈、或四氫呋喃與水的混合物、或DMSO與水的混合物、或其中多種溶劑混合 物；所述催化劑為硫酸銅和抗壞血酸、溴化亞銅、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Ciu或Cu絲。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法，其特征是，步驟(2)中點(diǎn)擊反應(yīng) 時(shí)還加入催化劑穩(wěn)定劑，該催化劑穩(wěn)定劑為TBTA，TCEP中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種活細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒，該試劑盒主要包括有能夠插入核酸序列中的、帶有1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物；和含有與上述1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)或1，3-二偶極基團(tuán)的生物分子探針；所述1，3-二偶極基團(tuán)與對(duì)應(yīng)的親偶極基團(tuán)可進(jìn)行“點(diǎn)擊”反應(yīng)。標(biāo)記時(shí)，被含1，3-二偶極基團(tuán)或親偶極基團(tuán)的核苷類似物修飾的核酸可以同對(duì)應(yīng)的活性探針?lè)肿油ㄟ^(guò)“點(diǎn)擊”反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)連接。所述標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)核酸的方法和試劑盒使核酸標(biāo)記后進(jìn)一步可應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增值，細(xì)胞凋亡；標(biāo)記質(zhì)粒載體，病毒，小干擾RNA，microRNA以及研究早期發(fā)育。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921835SQ20101018321
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者張必良, 渠德忠, 王瑋 申請(qǐng)人:廣州市銳博生物科技有限公司