專利名稱：核酸標(biāo)記方法以及核酸標(biāo)記用液組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的核酸標(biāo)記方法是特征如下的核酸標(biāo)記方法在邊摻入標(biāo)記底物，邊通過PCR法進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增的核酸標(biāo)記方法中，選擇ATCG的4種底物中的一種至3種的底物，與沒有被選擇的剩下的底物相比，將上述被選擇的底物的濃度減少，而且作為上述被選擇的底物含有無標(biāo)記脫氧核苷酸和帶標(biāo)記脫氧核苷酸。
另外，本發(fā)明中涉及的靶核酸的檢測方法是特征如下的靶核酸檢測方法在使含有靶核酸的產(chǎn)物與固定于固相上的探針反應(yīng)，利用標(biāo)記對與固相上探針雜交的上述靶核酸進(jìn)行檢測的靶核酸檢測方法中，對于上述產(chǎn)物通過上述的核酸標(biāo)記方法將該產(chǎn)物中含有的靶核酸做成實(shí)施了標(biāo)記的PCR產(chǎn)物之后，與上述固相上的探針反應(yīng)。
另外，本發(fā)明中涉及的用于核酸標(biāo)記的PCR用溶液組合物是特征如下的溶液組合物作為邊摻入標(biāo)記物質(zhì)，邊通過PCR進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增時的含有ATCG的4種脫氧核苷酸的溶液組合物，選擇1種至3種脫氧核苷酸，使上述被選擇的脫氧核苷酸的濃度比沒有被選擇的剩下的脫氧核苷酸的濃度低，相對于上述被選擇的脫氧核苷酸，含有帶標(biāo)記脫氧核苷酸。
另外，本發(fā)明涉及到的用于檢測靶核酸的試劑盒含有如下引物和探針 A)用于擴(kuò)增靶核酸的PCR引物， B)作為含有ATCG 4種脫氧核苷酸的溶液組合物，選擇1種至3種脫氧核苷酸，使上述被選擇的脫氧核苷酸的濃度比沒有被選擇的剩下的脫氧核苷酸的濃度低，相對于上述被選擇的脫氧核苷酸，含有帶有標(biāo)記的脫氧核苷酸， C)在固相上配置了用于與上述靶核酸反應(yīng)的探針的固相探針。
固相探針最好是DNA微陣列。
利用本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法在邊摻入標(biāo)記底物，邊通過PCR法進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增時，對于添加了帶標(biāo)記脫氧核苷酸的底物通過將濃度調(diào)低，可以更有效地?fù)饺霕?biāo)記物質(zhì)。而利用本發(fā)明的靶核酸的檢測方法，通過固相雜交可以使靶核酸的檢測靈敏度提高。



圖1表示在pUC118 EcoRI/BAP中兩個引物以及一個探針的圖。箭頭表示在各個引物中由5’至3’的方向。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法其特征是在邊摻入標(biāo)記底物，邊通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增時，選擇A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)4種底物中一種至3種底物作為賦予標(biāo)記的底物，使上述被選擇的底物的濃度比沒有被選擇的剩下的底物的濃度低，而且在選擇的底物中含有帶標(biāo)記脫氧核苷酸。另一特征是將作為選擇的底物的“無標(biāo)記脫氧核苷酸”和“帶標(biāo)記脫氧核苷酸”的總濃度調(diào)整到比沒有被選擇的各個底物的濃度都低。通過使用這樣標(biāo)記化條件的PCR擴(kuò)增，制備產(chǎn)物，靶核酸在擴(kuò)增過程中可以有效地?fù)饺霕?biāo)記物質(zhì)。
另外，帶標(biāo)記脫氧核苷酸的濃度越高，越有利于標(biāo)記物質(zhì)的摻入。作為被選擇的底物中的帶標(biāo)記脫氧核苷酸，如果將PCR反應(yīng)液中的濃度調(diào)整到20μM以上，本發(fā)明可更有效地發(fā)揮作用。將沒有被選擇的堿基在PCR反應(yīng)液中的脫氧核苷酸的濃度調(diào)整為150～300μM，被選擇的底物濃度調(diào)整為沒有被選擇的底物的5～80％(摩爾數(shù)基準(zhǔn))，優(yōu)選將被選擇的底物中帶標(biāo)記脫氧核苷酸對被選擇的底物中的無標(biāo)記脫氧核苷酸的比例(摩爾基準(zhǔn)數(shù))調(diào)整到0.25以上。另外，更優(yōu)選將被選擇的底物調(diào)整到?jīng)]有被選擇的底物的10～40％(摩爾基準(zhǔn)數(shù))。最優(yōu)選如果將作為被選擇的底物中的帶標(biāo)記脫氧核苷酸對無標(biāo)記脫氧核苷酸的比例(摩爾基準(zhǔn)數(shù))調(diào)整到1以上。在這樣的條件下進(jìn)行產(chǎn)物制備，即使少量的帶標(biāo)記核苷酸也可以有效地將標(biāo)記物質(zhì)摻入到靶核酸中。
作為標(biāo)記物質(zhì)，無論什么樣的標(biāo)記物質(zhì)都可以沒有特別限制地用于本發(fā)明，但一般使用可高靈敏度檢測的熒光物質(zhì)等。其中，以Cy3、Cy5為代表的CyDye(Amersham Bioscience公司生產(chǎn))常用作核酸標(biāo)記用的熒光物質(zhì)，這些熒光物質(zhì)在本發(fā)明中特別有效。另外，生物素、氨基烯丙基系化合物等核酸標(biāo)記用物質(zhì)在本發(fā)明的產(chǎn)物制備方法中也都有效。
進(jìn)行本發(fā)明產(chǎn)物制備的靶核酸可以用于通過固相上雜交進(jìn)行檢測中。雖然利用本發(fā)明的PCR有時產(chǎn)量低，但在可高靈敏度地對少量產(chǎn)物進(jìn)行檢測的檢測裝置中可以特別發(fā)揮作用。其中，對DNA微陣列特別有效。另外，優(yōu)選DNA微陣列的每一點(diǎn)的面積在10-6平方米以下。點(diǎn)面積的下限可以根據(jù)相應(yīng)于目的分析用途使用的掃描器等用于測定結(jié)果的儀器的靈敏度等設(shè)定，例如也可做小到10-12平方米左右。
另外，本發(fā)明還提供在上述制備方法中使用的溶液組合物。
以下對于本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法進(jìn)行更詳細(xì)說明。
本發(fā)明提供的核酸標(biāo)記方法通過在作為利用PCR對靶核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增時使用的底物ATCG 4種脫氧核苷酸中，選擇1種至3種底物，使被選擇的底物的濃度比沒被選擇的底物濃度低，而且作為被選擇的底物至少使用帶標(biāo)記脫氧核苷酸實(shí)施。特別是作為賦予標(biāo)記的底物選擇的底物可以使用賦予標(biāo)記和沒有實(shí)施標(biāo)記的底物的混合物，通過將沒有實(shí)施標(biāo)記的底物的濃度調(diào)整到比作為實(shí)施標(biāo)記沒有被選擇的底物濃度都低，使帶有標(biāo)記的底物所占的比例增大，可以有效地?fù)饺霕?biāo)記物質(zhì)。
另外，通過將被選擇的底物的濃度調(diào)整到比沒被選擇的底物的濃度都低，可以獲得更好的效果。例如，選擇T作為標(biāo)記底物時，將沒有標(biāo)記的dTTP和標(biāo)記的dUTP并用，使dTTP和標(biāo)記的dUTP的總量比沒有標(biāo)記的dATP、dCTP以及dGTP的各個濃度都低[(dTTP+標(biāo)記的dUTP的濃度＜(dATP、dCTP或dGTP的濃度)]。
另外，被選擇的底物和沒有被選擇的底物的上述關(guān)系以及下面敘述的關(guān)系可各自獨(dú)立應(yīng)用于各個底物。例如，被選擇的底物是2種時，每一種都可以應(yīng)用對于沒有被選擇的2種底物中的每一個底物的濃度關(guān)系。
另外，“底物”表示“dATP”、“dTTP”、“dCTP”以及“dGTP”脫氧核苷酸的種類。
在PCR中，酶高效作用的的脫氧核苷酸的濃度為200μM左右(Takara公司生產(chǎn)Ex Taq等)。從酶的底物特異性觀點(diǎn)看，原來帶標(biāo)記脫氧核苷酸難以摻入。因此有關(guān)選作標(biāo)記的底物，將其整體的制備濃度調(diào)低到例如100μM左右，最好將帶標(biāo)記脫氧核苷酸調(diào)整到例如其中的50μM，結(jié)果在得到的含有靶核酸序列的PCR產(chǎn)物中可以摻入更多的標(biāo)記物質(zhì)。通過將選作標(biāo)記的底物之中的沒有被標(biāo)記的脫氧核苷酸的量減少，具有反應(yīng)少許停止，使得難以大量摻入的帶標(biāo)記脫氧核苷酸變得容易摻入的效果。另外，即使將脫氧核苷酸的量增減30％左右，本發(fā)明的產(chǎn)物制備方法也是有效的。
因此，將選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度(被標(biāo)記的底物和沒有被標(biāo)記的底物的合計(jì)濃度)調(diào)整到?jīng)]有被選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度的5％至80％(摩爾基準(zhǔn)數(shù))之間比較好。而將選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度(被標(biāo)記的底物和沒有被標(biāo)記的底物的合計(jì)濃度)調(diào)整到?jīng)]有被選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度的10％至40％(摩爾基準(zhǔn)數(shù))之間更好。另外，最好是將沒有被選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度調(diào)整到150μM～300μM。另外，最好是將選作進(jìn)行標(biāo)記的各個底物的濃度(被標(biāo)記的底物和沒有標(biāo)記的底物的合計(jì)濃度)調(diào)整到20μM以上。另外，將選作進(jìn)行標(biāo)記的底物的總量中的“帶標(biāo)記脫氧核苷酸”對“沒有標(biāo)記的脫氧核苷酸”的比例(摩爾基準(zhǔn)數(shù))調(diào)整到0.25以上，最好是調(diào)整到1以上。而其上限為50左右好。
作為具有靶核酸的堿基序列被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的堿基長度雖然沒有特別限制，但在100至2000bp之間特別有效。
標(biāo)記物質(zhì)可以使用熒光物質(zhì)等。其中，以Cy3、Cy5為代表的CyDye(Amersham Bioscience公司生產(chǎn))常用作核酸標(biāo)記用的熒光物質(zhì)，這些熒光物質(zhì)在本發(fā)明中特別有效。另外，生物素、氨基烯丙基系化合物等對于本發(fā)明的核酸標(biāo)記用物質(zhì)也都有效。生物素與Cy3相比由于分子的大小小，進(jìn)行PCR時的立體障礙比較少，所以利用本發(fā)明的方法可以使標(biāo)記物質(zhì)更有效地?fù)饺氲絇CR產(chǎn)物中。作為被標(biāo)記的脫氧核苷酸一般常用胸苷酸，相應(yīng)的標(biāo)記試劑也有很多市售商品，本發(fā)明對于這些試劑也能較好地適用。
利用本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法標(biāo)記的靶核酸可以通過與固定在固相上或固相表面的探針雜交形成雙鏈，通過測定與該探針結(jié)合的靶核酸帶有的標(biāo)記物質(zhì)的信號可以進(jìn)行高靈敏度檢測。作為利用固相雜交的高靈敏度的檢測裝置，已知有各種各樣的物質(zhì)、形態(tài)，但本發(fā)明可沒能限制地適用于這些裝置。其中，在玻璃基板上固定了核酸的DNA微陣列是其代表例子，對通過本發(fā)明的方法做成的靶核酸的檢測特別適合。作為用于固相的材料除了玻璃以外，還有樹脂、金屬、金屬薄膜、纖維等。另外其輪廓上形態(tài)還有微粒子、光纖維頂端、多孔材料、纖維等。
作為探針與固相的結(jié)合樣式，存在著吸附、化學(xué)結(jié)合等各種各樣的方式，無論哪一種結(jié)合樣式都適用于本發(fā)明的靶核酸的檢測方法。例如，如果離子結(jié)合，對于包被氨基的玻璃基板或樹脂表面，可以只要提供通常的核酸，就可使其進(jìn)行離子結(jié)合。另外，也可以使用5’末端、3’末端修飾了氨基、巰基等官能團(tuán)的修飾寡核苷酸進(jìn)行固定。例如利用氨基時，使固相表面預(yù)先結(jié)合可有效與氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺，通過將5’末端或3’末端修飾了氨基的寡核苷酸供給給固相表面，可以容易形成共價鍵，適于用作檢測本發(fā)明靶核酸的探針。另外，當(dāng)使用巰基時，通過將例如馬來酰亞胺預(yù)先結(jié)合于固相，與氨基情形一樣，容易形成共價鍵，適于用作檢測本發(fā)明靶核酸的探針。作為向固相的供給方法，有通過噴墨法將DNA溶液向固相印字的方法等。通過該噴墨法制作的DNA微陣列探針的點(diǎn)小是其特長。在檢測中，S/N比也是重要的因子，利用本發(fā)明標(biāo)記方法擴(kuò)增的靶核酸由于每個靶的標(biāo)記量多，所以也有S/N比提高的效果，特別有效。
另外，本發(fā)明的標(biāo)記方法不僅在對1種靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的單一PCR，而且在Multiplex PCR、或使引物的濃度有差別，使任一單鏈積極擴(kuò)增的非對稱PCR中也都有效。
另外，通過本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法中使用的含有脫氧核苷酸的溶液組合物也可以作為診斷試劑盒、PCR預(yù)混合物提供。溶液組合物在例如可用作PCR用的適當(dāng)?shù)乃疄橹黧w的水性溶劑中，除了上述脫氧核苷酸的組合之外，還可含有酶起作用所必需的成分以及用于獲得引物進(jìn)行退火所必需的鹽濃度的各種添加劑等，具體來說可以含有Tris-Cl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2等。
因此，本發(fā)明的標(biāo)記方法可以邊標(biāo)記邊擴(kuò)增檢體(樣品)中含有的檢測對象的靶核酸序列，適合用于向固相雜交法等的對核酸樣品進(jìn)行標(biāo)記后與探針進(jìn)行雜交的分析方法供給的檢體(樣品)的制備方法。
另外，本發(fā)明為了對靶核酸進(jìn)行檢測，提供具有如下構(gòu)成的試劑盒 A)用于擴(kuò)增靶核酸的PCR引物， B)作為含有ATCG 4種脫氧核苷酸的溶液組合物，選擇1種至3種脫氧核苷酸，與沒有被選擇的剩下的脫氧核苷酸相比，使上述被選擇的脫氧核苷酸的濃度減少，相對于上述被選擇的脫氧核苷酸，含有帶標(biāo)記的脫氧核苷酸， C)在固相上配置了用于與上述靶核酸反應(yīng)的探針的固相探針。固相探針最好是DNA微陣列。通過本構(gòu)成可以提供可進(jìn)行靶核酸的高靈敏度檢測的檢測試劑盒。
實(shí)施例
以下通過實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行更具體說明。但是以下所述實(shí)施例雖然是本發(fā)明的最好實(shí)施方式的一個例子，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于這些實(shí)施例。
<實(shí)施例1> I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR (1)引物的設(shè)計(jì) 從市售的Takara公司生產(chǎn)的載體pUC118 EcoRI/BAP(全長3162bp)的堿基序列中設(shè)計(jì)兩種具有下述序列的引物。而有關(guān)pUC118 EcoRI/BAP的全堿基序列信息由Takara公司提供，另外可以從公開的數(shù)據(jù)庫等獲得。當(dāng)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時，要充分考慮到序列、GC％、融解溫度(Tm)后進(jìn)行設(shè)計(jì)，以使pUC118 EcoRI/BAP中所希望的部分堿基序列通過PCR特異、而且有效地被擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)的引物，正向一側(cè)(F)、反向一側(cè)(R)各一種，共計(jì)2種。以pUC118 EcoRI/BAP作為模板，以F和R的組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1324bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。表1給出了涉及到的引物的堿基序列以及Tm值。
表1 名稱 堿基序列Tm(℃)F 5’TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAG 3’60.9R 5’ATCAGCAATAAACCAGCCAGCC 3’61.5 圖1給出了在pUC118 EcoRI/BAP全長中2種引物(F和R)和探針(P)的位置。該圖中箭頭指示方向表示各個引物鏈5’末端至3’末端的方向。
(2)引物合成 合成實(shí)施例1(1)中設(shè)計(jì)的2種引物。各個引物的合成根據(jù)常規(guī)方法用DNA合成儀合成具有各自堿基序列的DNA鏈。純化通過萃取柱進(jìn)行，得到2種引物。得到的引物用TE緩沖液稀釋到10μM。
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 使用實(shí)施例1(2)中合成的2種引物、作為模板基因的Takara公司生產(chǎn)的載體pUC118 EcoRI/BAP，以及Takara Bio公司生產(chǎn)的PCR試劑盒Takara Ex Taq，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在該P(yáng)CR試劑盒中含有包括dATP、dCTP、dTTP、dGTP 4種脫氧核苷酸在內(nèi)的dNTP混合物(各2.5mM)，為了調(diào)整各個核苷酸的濃度，使用Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的Sequencing Grade Solution dNTPs。而為了通過熒光標(biāo)記對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，加Amersham Bioscience公司生產(chǎn)的Cy3dUTP，通過Cy3對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。另外，沒有被標(biāo)記的脫氧核苷酸，做成下面表2所示那樣的濃度的dNTP混合物。為了比較也一起實(shí)施以往的制備方法(STd.)。
表2dNTP混合物組成 Std.Mix1Mix2Mix3Mix4Mix5Mix6dATP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdCTP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdGTP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdTTP5.0mM4.0mM2.0mM1.0mM0.5mM0.25mM0mM 正向引物和反向引物使用(1)中記載的組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的條件按照下面的程序，就表2所示的Low dT dNTP Mixture Mix0至Mix6各混合物進(jìn)行下述表3所示組成的反應(yīng)液的制備。
表3反應(yīng)液組成 成分組成Takara Ex Taq0.5μl(2.5U)10×Ex Taq緩沖液(加20mM Mg2+)5.0μl模板DNA(Takara公司pUC118稀釋物)1.0μl(10ng)正向引物(F)2.5μl(25pmol/tube)反向引物(R)2.5μl(25pmol/tube)dNTP混合物(Std.，Mix1～Mix6)2.0μl(※)Cy3dUTP(1.0mM、Amersham Bioscience公司生產(chǎn))2.0μl(40μM)H2O34.5μl合計(jì)50μl (※)濃度由于Mix1～Mix6以及Std.都不相同，在表4中另外給出。
下面表4給出了表3那樣制備的反應(yīng)溶液中的脫氧核苷酸的濃度。而dATP、dCTP、dGTP使用各個表中記載的濃度(在表4中200μM)(在以下表中也同樣)。
表4反應(yīng)液中的脫氧核苷酸的濃度 Std. A(Mix1) B(Mix2) C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6) Datp、dCTP、dGTP、 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM dTTP、 200μM 160μM 80μM 40μM 20μM 10μM 0μM Cy3-dUTP 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM dTTP+Cy3-dUTP 240μM 200μM 120μM 80μM 60μM 50μM 40μM 對于制備的反應(yīng)液可以使用市售的熱循環(huán)儀，按照下面表5的溫度循環(huán)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
表5PCR擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件 步驟 溫度保持時間重復(fù)次數(shù)1 94℃(變性)30秒25個循環(huán)2 55℃(退火)45秒3 72℃(延伸)1分鐘4 72℃10分鐘 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用純化用柱(QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒)進(jìn)行純化。純化后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液的溶液量調(diào)整到50μl。取一部分得到的純化好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液，按照常規(guī)方法進(jìn)行電泳，確認(rèn)在7種各個PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)了具有所希望的堿基長度的帶。表6給出了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。
表6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度 Std. A(Mix1) B(Mix2)C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6)產(chǎn)物量51.0nM 47.9nM 30.1μM14.2nM 9.6nM 3.0nM 0nM 就象表6所示的那樣，作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量，反應(yīng)液中的dTTP的量越多，產(chǎn)物量也越多。
II.DNA微陣列的制作 (1)探針的設(shè)計(jì)和合成 對上述PCR產(chǎn)物A設(shè)計(jì)探針。設(shè)計(jì)與引物的設(shè)計(jì)一樣，要充分考慮到序列、GC％、融解溫度(Tm值)，以便能夠特異識別設(shè)計(jì)的部分堿基序列。
表7給出了設(shè)計(jì)的探針的堿基序列和Tm值。 表7 名稱 堿基序列Tm(℃)P 5’GATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGC 3’75.7 在該探針設(shè)計(jì)中，由R引物延伸的DNA鏈與探針進(jìn)行雜交，與探針形成雜化體。
(2)玻璃基板的清洗 將合成石英玻璃基板(大小(W×L×T)25mm×75mm×1mm，飯山特殊玻璃公司生產(chǎn))放到耐熱、耐堿性的架上，浸入到調(diào)整到所定濃度的超聲清洗用清洗液中。于清洗液中浸泡過夜后，用超聲清洗20分鐘。然后取出玻璃基板，用純水輕輕涮洗后，于純水中超聲清洗20分鐘。然后將玻璃基板于加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。再進(jìn)行純水清洗和超純水清洗，制備DNA芯片用的清洗后石英玻璃基板。
(3)表面處理 使硅烷偶聯(lián)劑KBM-603(信越硅公司生產(chǎn))溶解于純水中，使終濃度為1％，于室溫下攪拌2小時。然后將清洗后的石英玻璃基板浸入到該硅烷偶聯(lián)劑水溶液中，于室溫下放置20分鐘。將玻璃基板提出后，用純水輕輕清洗表面后，用氮?dú)獯挡ＡЩ宓膬擅妫蛊涓稍?。然后將氮?dú)饬鞲稍锏牟ＡЩ宸诺郊訜岬?20℃的烘箱中烘烤1小時，使偶聯(lián)劑處理完結(jié)。通過該偶聯(lián)劑處理，在玻璃基板表面導(dǎo)入了來自硅烷偶聯(lián)劑的氨基。
另一方面，制備在二甲基亞砜和乙醇的1∶1混合溶劑中溶解了同仁化學(xué)研究所公司生產(chǎn)的N-馬來酰亞胺己酰氧琥珀酰亞胺(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(終濃度為0.3mg/ml)的EMCS溶液。烘烤結(jié)束后，將偶聯(lián)劑處理后的玻璃基板放冷，在制備的EMCS溶液中于室溫下浸泡2小時。在浸漬處理期間，導(dǎo)入到偶聯(lián)劑處理后的玻璃基板表面的氨基與EMCS的琥珀酰亞胺基反應(yīng)，在玻璃基板表面導(dǎo)入來自EMCS的馬來酰亞胺基。將從EMCS溶液中提出的玻璃基板用上述的二甲基亞砜和乙醇的混合溶劑洗凈，再用乙醇洗凈后，于氮?dú)夥諊率蛊涓稍铩?br> (4)探針用DNA的合成 合成上述(1)中設(shè)計(jì)的探針。
為了使探針DNA與在上述表面導(dǎo)入馬來酰亞胺的玻璃基板共價結(jié)合，按照常規(guī)方法在5’末端實(shí)施巰基化處理。然后為了避免DNA合成時的副反應(yīng)，對實(shí)施了保護(hù)的保護(hù)基進(jìn)行脫保護(hù)，再進(jìn)行HPLC純化和脫鹽處理。
得到的探針DNA溶解于純水中，進(jìn)行分注(墨水溶解時)，終濃度為10μM后，進(jìn)行冷凍干燥，除去水分。
(5)通過BJ打印機(jī)吐出探針DNA、以及與基板表面的結(jié)合 制備含有甘油7.5質(zhì)量％、硫二甘醇7.5質(zhì)量％、尿素7.5質(zhì)量％、アセチレノ-ルEH(川研Fine Chemical公司生產(chǎn))1.0質(zhì)量％的水溶液。然后，將分注的探針DNA按照規(guī)定濃度(10μM)溶解在上述混合溶劑中。將得到的探針DNA溶液充填到泡沫噴墨打印機(jī)(商品名BJF-850佳能公司生產(chǎn))用墨盒中，裝到印字頭上。
而上述泡沫噴墨打印機(jī)是實(shí)施改造使得可以進(jìn)行平板噴墨印刷的打印機(jī)。另外，該改造的泡沫噴墨打印機(jī)通過按照所定的膜做成方法輸入印字圖樣，可以在約120μm芯片點(diǎn)印約5pl DNA溶液的液滴。
然后，使用該改造的閥噴墨打印機(jī)，對玻璃基板進(jìn)行探針DNA溶液的點(diǎn)印操作。每枚DNA微陣列，預(yù)先做成進(jìn)行16點(diǎn)的探針吐出的印字圖樣，進(jìn)行噴墨印字。通過放大鏡等確認(rèn)DNA溶液的點(diǎn)確實(shí)點(diǎn)在目的圖樣中后，于常溫下在加濕盒內(nèi)靜置30分鐘，使玻璃基板表面的馬來酰亞胺基與探針DNA 5’末端的巰基(-SH)反應(yīng)。
(6)清洗 于加濕盒內(nèi)反應(yīng)30分鐘后，用含有100mM的NaCl的10mM磷酸緩沖液(pH7.0)將殘存在玻璃基板表面的未反應(yīng)的探針DNA洗掉。得到在玻璃基板表面，每一DNA芯片16個點(diǎn)處分別固定了所定的單鏈探針DNA的DNA微陣列型DNA芯片。
III.雜交反應(yīng) 使用實(shí)施II項(xiàng)中制作的DNA微陣列和作為樣品核酸產(chǎn)物在I制作的7種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在微陣列上進(jìn)行雜交。
(1)DNA微陣列的封閉 將BSA(牛血清白蛋白Fraction VSigma公司生產(chǎn))溶解于100mMNaCl/10mM磷酸緩沖液，使終濃度為0.1質(zhì)量％，在該溶液中將II中制作的DNA微陣列于室溫下浸泡2小時，進(jìn)行玻璃基板面的封閉。封閉結(jié)束后，用含有0.1質(zhì)量％SDS(十二烷基硫酸鈉)的0.1×SSC溶液(NaCl15mM、檸檬酸鈉(水合檸檬酸三鈉鹽，C6H5Na3·2H2O)1.5mM、p.H.7.0)清洗后，用純水淋洗。然后用旋轉(zhuǎn)干燥裝置除去DNA微陣列的水分。
(2)雜交溶液的制備 制備對于各個PCR產(chǎn)物的雜交溶液。而各個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液分別使用2.0μl，使最終液量為120μl。
<雜交溶液> 6×SSPE/10％ Form amide/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) (3)雜交 將除去水分后的DNA芯片放到雜交裝置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中，使用上述的雜交溶液，按照下面表8給出的步驟和條件進(jìn)行雜交反應(yīng)。
表8雜交條件和步驟 操作操作步驟和條件反應(yīng)65℃3分鐘→92℃2分鐘→55℃4小時清洗2×SSC/0.1％SDS 25℃下2×SSC 20℃下(淋洗)H2O(手動淋洗)干燥旋轉(zhuǎn)干燥 (4)熒光測定 雜交反應(yīng)結(jié)束后，對旋轉(zhuǎn)干燥的DNA芯片使用DNA微陣列用熒光檢測裝置(Axon公司生產(chǎn)、Genepix 4000B)對來自雜交體的熒光進(jìn)行測定。下面表9給出了對來自PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Std.、以及A至F的熒光輝度進(jìn)行測定的結(jié)果。在計(jì)算輝度時，將在DNA芯片上沒有探針DNA的點(diǎn)的部分觀測到的熒光強(qiáng)度作為背景值，將從來自各個點(diǎn)的表觀熒光強(qiáng)度減去背景值后的值作為熒光強(qiáng)度的實(shí)測值。另外，測定進(jìn)行2次，給出其平均值。
表9PCR擴(kuò)增后的濃度和雜交后的熒光輝度 Std. A(Mix1) B(Mix2)C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6)產(chǎn)物量51.0nM 47.9nM 30.1μm14.2nM 9.6nM 3.0nM 0nM(※)熒光輝度3243 5052 1056529659 29948 16956 176 (※)檢測靈敏度以下 由表9給出的結(jié)果與以往方法Std.相比，其他的A～E的樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量雖然少，但通過雜交檢測的熒光輝度值都高。就是說，標(biāo)記摻入效率高。即，反應(yīng)液中加的標(biāo)記物質(zhì)的量即使少，對于帶標(biāo)記堿基，通過將脫氧核苷酸的總濃度調(diào)整到比其他堿基的濃度低，也可以有效地使標(biāo)記物質(zhì)摻入。而，沒有標(biāo)記的脫氧核苷酸為0時，幾乎不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使雜交也不能檢測(樣品F)。以上結(jié)果表明，相對于沒添加帶標(biāo)記脫氧核苷酸的堿基的脫氧核苷酸(這里指dATP、dCTP、dGTP)的濃度，通過將作為標(biāo)記對象的堿基種的無標(biāo)記脫氧核苷酸(這里指dTTP)的濃度調(diào)整到5至80摩爾％，可以有效地進(jìn)行核酸標(biāo)記。
另外，表9的C、D樣品的輝度值與以往方法Std.相比高出約10倍多。即，本發(fā)明的核酸標(biāo)記方法相對于沒添加帶標(biāo)記脫氧核苷酸的堿基的脫氧核苷酸(這里指dATP、dCTP、dGTP)的濃度，通過將作為標(biāo)記對象的堿基種的無標(biāo)記脫氧核苷酸(這里指dTTP)的濃度調(diào)整到10至40摩爾％，可以有效地進(jìn)行核酸標(biāo)記。另外，在本實(shí)施例中只對1種堿基使標(biāo)記物質(zhì)摻入，即使對多個堿基使標(biāo)記物質(zhì)摻入也可獲得同樣的效果。
<實(shí)施例2> 在實(shí)施例1的表6那樣的PCR產(chǎn)物中，在將各個PCR產(chǎn)物相互都調(diào)整到等摩爾的基礎(chǔ)上，使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液2μl制備使終濃度為下面構(gòu)成那樣的雜交溶液120μl。
<雜交溶液> 6×SSPE/10％Form amide/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照表8給出的雜交條件和步驟進(jìn)行雜交反應(yīng)。另外，象實(shí)施例1的III(4)熒光測定中所述那樣，對各個DNA芯片進(jìn)行熒光測定。表10給出了其平均值。
表10雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光輝度A(Mix1)B(Mix2)C(Mix3)D(Mix4)熒光輝度5052143516053063600 由該結(jié)果可以準(zhǔn)確確認(rèn)對于單鏈靶，C、D的樣品與A相比摻入了更多的標(biāo)記物質(zhì)。另外，帶標(biāo)記脫氧核苷酸對無標(biāo)記脫氧核苷酸的比例為1以上時效果更好。
<實(shí)施例3> 按照實(shí)施例1的表3將反應(yīng)液調(diào)整到表11所示那樣的脫氧核苷酸的濃度，在表5那樣溫度條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
表11反應(yīng)液中的脫氧核苷酸的濃度G(Mix7)H(Mix8)C(Mix3)dATP、dCTP、dGTP、 200μM200μM200μMdTTP、 100μM60μM40μMCy3-dUTP 100μM60μM40μMdTTP+Cy3-dUTP 200μM120μM80μM 表12給出了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。
表12PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度 G(Mix7)H(Mix8)C(Mix3)產(chǎn)物量35.0nM26.4nM14.2nM 反應(yīng)液中的dTTP的量越多，作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量就越多。
在與實(shí)施例1同樣的條件下，在表12的PCR產(chǎn)物中，制備終濃度為下面構(gòu)成那樣的雜交溶液。各個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液使用2.0μl，使最終液量為120μl。
<雜交溶液> 6×SSPE/10％Form amide/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照下面表8給出的雜交條件和步驟進(jìn)行雜交反應(yīng)。另外，象實(shí)施例1的(4)熒光測定中所述那樣進(jìn)行處理，對各個DNA芯片進(jìn)行熒光測定。表13給出了其平均值。
表13PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和熒光輝度 G(Mix7) H(Mix8) C(Mix3)熒光輝度24447 35457 29659 由該結(jié)果可知，可以得到H為最高的輝度值。即使帶標(biāo)記脫氧核苷酸與無標(biāo)記脫氧核苷酸比例為1時，無標(biāo)記脫氧核苷酸的濃度比其他堿基少的H、C方與G的條件相比檢測靈敏度好，可知用少的標(biāo)記物質(zhì)可以更有效地?fù)饺霕?biāo)記。
<實(shí)施例4> 按照實(shí)施例的表3制備表14所示那樣的脫氧核苷酸濃度的反應(yīng)液，在表5那樣的溫度條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。即，對不使用帶標(biāo)記脫氧核苷酸的堿基A、C、G，通過改變濃度條件進(jìn)行核酸標(biāo)記。
表14反應(yīng)液中的脫氧核苷酸濃度I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3)K(Mix11)L(Mix12)dATP、dCTP、dGTP、 100μM150μM200μM250μM300μMdTTP、 40μM40μM40μM40μM40μMCy3-dUTP 40μM40μM40μM40μM40μMdTTP+Cy3-dUTP 80μM80μM80μM80μM80μM 表15給出了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。
表15PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度 I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3)K(Mix11)L(Mix12)產(chǎn)物量10.7nM13.5nM14.2nM14.8nM14.3nM 作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量，雖然I(Mix9)略少一些，但無論哪一個樣品幾乎都一樣。
在與在實(shí)施例1同樣的條件下，在表14的PCR產(chǎn)物中，制備終濃度為下面構(gòu)成那樣的雜交溶液。各個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液使用2.0μl，使最終液量為120μl。
<雜交溶液> 6×SSPE/10％ Form amide/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照表8給出的雜交條件和步驟進(jìn)行雜交反應(yīng)。另外，象實(shí)施例1的(4)熒光測定中所述那樣進(jìn)行處理，對各個DNA芯片進(jìn)行熒光測定。表16給出了其平均值。
表16PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光輝度 I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3) K(Mix11) L(Mix12)產(chǎn)物量80732236929659 26758 26239 由該結(jié)果在除I以外的樣品(J、C、K、L)中得到幾乎都相同的輝度值。即，標(biāo)記效率與不使用帶標(biāo)記脫氧核苷酸的堿基A、C、G的濃度，可知調(diào)整到150μM至300μM之間比較妥當(dāng)。
序列表
<110>佳能株式會社
<120>核酸標(biāo)記方法以及核酸標(biāo)記用液組合物
<130>10003827CN01
<150>JP2003-430805
<151>2003-12-25
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>1
tgatttgggt gatggttcac gtag 24
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>2
atcagcaata aaccagccag cc22
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>探針
<400>3
gataaagttg caggaccact tctgc 2權(quán)利要求
1、核酸標(biāo)記方法，是在邊摻入標(biāo)記底物邊經(jīng)PCR法進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增的核酸標(biāo)記方法中，其特征是選擇ATCG4種底物中的1種至3種底物，與沒有被選擇的剩下的底物相比，使上述被選擇的底物的濃度減少，而且作為上述被選擇的底物含有無標(biāo)記脫氧核苷酸和帶標(biāo)記脫氧核苷酸。
2、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其中將上述被選擇的底物的濃度調(diào)整到上述沒有被選擇的底物的濃度的5％至80％之間。
3、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其中將上述被選擇的底物的濃度調(diào)整到?jīng)]有被選擇的底物的濃度的10％至40％之間。
4、權(quán)利要求2或3中任一項(xiàng)中所述的核酸標(biāo)記方法，其中將上述沒有被選擇的底物的濃度調(diào)整到150μM～300μM范圍。
5、權(quán)利要求2或3所述的核酸標(biāo)記方法，其中將作為上述被選擇的底物的帶標(biāo)記脫氧核苷酸的濃度調(diào)整到20μM以上。
6、權(quán)利要求5所述的核酸標(biāo)記方法，其中將作為上述被選擇的底物的帶標(biāo)記脫氧核苷酸對無標(biāo)記脫氧核苷酸的比例調(diào)整到0.25以上。
7、權(quán)利要求5所述的核酸標(biāo)記方法，其中將作為上述被選擇的底物的帶標(biāo)記脫氧核苷酸對無標(biāo)記脫氧核苷酸的比例調(diào)整到1以上。
8、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其特征是標(biāo)記物質(zhì)是熒光物質(zhì)。
9、權(quán)利要求8所述的核酸標(biāo)記方法，其中熒光物質(zhì)是Cy3或Cy5。
10、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其中，標(biāo)記物質(zhì)是生物素。
11、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其中，標(biāo)記物質(zhì)是氨基烯丙基系化合物。
12、權(quán)利要求1所述的核酸標(biāo)記方法，其中上述被選擇的底物是1種。
13、權(quán)利要求12所述的核酸標(biāo)記方法，其中上述被選擇的1種底物是T。
14、靶核酸的檢測方法，是使含有靶核酸的產(chǎn)物與固定于固相上的探針反應(yīng)，利用標(biāo)記對與固相上的探針雜交的上述靶核酸進(jìn)行檢測的靶核酸的檢測方法，其特征是對于上述產(chǎn)物，通過權(quán)利要求1～13任一項(xiàng)所述的核酸標(biāo)記方法將上述產(chǎn)物中含有的靶核酸做成實(shí)施了標(biāo)記的PCR產(chǎn)物之后，與上述固相上的探針反應(yīng)。
15、權(quán)利要求14所述的檢測方法，其中上述探針被配置在作為DNA微陣列的固相上。
16、權(quán)利要求15所述的檢測方法，其特征是上述DNA微陣列中含有的上述探針的點(diǎn)的面積在10-6m2以下。
17、權(quán)利要求14所述的檢測方法，其中來自于通過PCR法對靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的上述檢體的PCR產(chǎn)物的堿基長度在100～2000bp范圍。
18、溶液組合物，是作為含有邊摻入標(biāo)記物質(zhì)，邊通過PCR進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增時的ATCG4種脫氧核苷酸的溶液組合物，其特征是
選擇1種至3種脫氧核苷酸，與沒有被選擇的剩下的脫氧核苷酸相比，使上述被選擇的脫氧核苷酸的濃度減少，而且在上述被選擇的脫氧核苷酸中含有帶標(biāo)記脫氧核苷酸。
19、用于檢測靶核酸的試劑盒，含有如下引物和探針
A)用于擴(kuò)增靶核酸的PCR引物，
B)作為含有ATCG4種脫氧核苷酸的溶液組合物，選擇1種至3種脫氧核苷酸，與沒有被選擇的剩下的脫氧核苷酸相比，使上述被選擇的脫氧核苷酸的濃度減少，而且在上述被選擇的脫氧核苷酸中含有帶標(biāo)記脫氧核苷酸，
C)在固相上配置了用于與上述靶核酸反應(yīng)的探針的固相探針。
20、權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中上述固相探針是DNA微陣列。
全文摘要
本發(fā)明提供盡可能控制標(biāo)記物質(zhì)使用量的而且可以有效地將標(biāo)記物質(zhì)摻入到產(chǎn)物(作為檢測對象的靶核酸)中的核酸標(biāo)記方法。本發(fā)明的方法是通過對產(chǎn)物中含有的靶核酸序列通過PCR法邊擴(kuò)增、邊標(biāo)記時，至少使用從ATCG 4種底物中至少選擇1種作為進(jìn)行標(biāo)記的底物，使被選擇的底物的濃度比沒有被選擇的剩下的各個底物的濃度都低，而且是被選擇的底物中被標(biāo)記的底物。
文檔編號C12N15/09GK1661111SQ200410104890
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者石井美繪, 鈴木智博 申請人:佳能株式會社