一種保護痰液中核酸(dna和rna)的痰紙及核酸提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物學領域中如何保存痰液樣本中核酸(DNA和RNA)完整性的方法。本發(fā)明提供了一種痰紙，可在常溫下方便貯存痰液樣本中核酸。痰紙上浸潤了核酸保護液，可作用于痰液樣本中的核酸酶，使酶失活，有效保護痰液中的DNA和RNA免受降解，便于保存和運輸痰液樣本。在室溫(25～35℃)下，痰液樣本中的核酸可穩(wěn)定保存7～14天。本發(fā)明同時提供了相應的核酸提取方法。
【專利說明】-種保護痰液中核酸（DNA和RNA)的痰紙及核酸提取方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學領域中如何保存痰液樣本中核酸（DNA和RNA)完整性的方法， 具體地涉及在常溫下方便貯存痰液樣本中核酸的痰紙和核酸提取方法。 技術背景
[0002] 在人體氣管、支氣管的內(nèi)壁都覆蓋著一層粘膜，在粘膜下層含較多的粘液腺和漿 液腺。正常情況下，杯狀細胞和腺體分泌少量粘液覆蓋在粘膜層表面，對粘膜起保護作用， 可保持氣管粘膜的濕潤，以便把吸入氣管、支氣管內(nèi)的塵埃顆粒、細菌等粘附住，阻擋其進 入肺組織深處。當氣管、支氣管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而發(fā)生炎癥時，呼吸 道的粘膜充血、水腫，大量炎性細胞浸潤，血管擴張，滲出增加，粘膜層的杯狀細胞和粘膜下 層的腺體增生肥大，粘液分泌大量增多，產(chǎn)生一些變性壞死組織細胞，潴留在支氣管內(nèi)，粘 液和這些變性壞死的組織細胞就構成了痰。正常人一般不咯痰或僅有少量泡沫樣痰或粘液 樣痰，當呼吸道有病變時，呼吸道粘膜受刺激，分泌物增多，痰也增多。病變包括支氣管擴張 癥、肺膿腫、肺結核、肺癌等；痰液中包含粘液、異物、病原微生物，各種炎癥細胞及壞死脫落 的粘膜上皮細胞、腫瘤細胞等成分。
[0003] 痰液中的核酸（DNA和RNA)是呼吸道惡性腫瘤和呼吸道感染等疾病的分子診斷的 重要標本。從肺癌患者痰液脫落細胞中提取核酸（DNA和RNA)，通過PCR、熒光定量PCR等分 子生物學檢測手段進行基因檢測，可用于肺癌病人的普查與診斷。但是，痰液中含有高活性 的核酸分解酶（DNA酶和RNA酶），導致痰液中的DNA和RNA很容易被降解。DNA和RNA降 解可導致分子檢測準確性和靈敏度降低，在降解嚴重的情況下甚至不能用于分子診斷，這 直接限制了通過痰液檢測呼吸道腫瘤或感染等疾病的臨床應用，降低了痰液這一重要臨床 樣本在疾病診斷中的價值。因此，發(fā)明一種能用于常溫下貯存痰液，保護痰液中DNA和RNA 不受降解的方法，對臨床應用痰液進行分子檢測具有重要的應用價值。本發(fā)明提供了一種 保護痰液中核酸（DNA和RNA)的痰紙及核酸提取方法。在痰紙上浸潤了核酸保護液，其中 含有螯合劑、還原劑和緩沖液，提供保存核酸的最適宜環(huán)境。將肺癌病人的痰液包裹在痰紙 內(nèi)，在吸附痰液中水分的同時，可有效保護痰液中的游離核酸和脫落細胞中的核酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種保存痰液樣本的一次性痰紙，用于解決痰液的方便儲存及痰液 中核酸的保護問題。
[0005] 痰紙預先經(jīng)核酸保護液浸潤處理，核酸保護液由螯合劑、還原劑和緩沖液等成分 組成。病人將痰吐到痰紙上，痰紙在吸收水分的同時，核酸保護液的成分作用于痰液中的核 酸酶，使酶失活，有效保護痰液中的DNA和RNA免受降解，便于保存和運輸痰液樣本。提取 核酸時，將痰紙加到特定裂解液中，震蕩30min，再將裂解液加到核酸吸附柱上，經(jīng)過特定洗 滌液（WB1、WB2)洗滌后，用洗脫液將核酸從吸附柱上洗脫下來。提取出的核酸（DNA和RNA) 包括了痰液中的游離核酸和細胞/組織中的核酸。
[0006] 核酸保護液的成分包括但不限于DTT、EDTA、Tris-HCl，在配方中的濃度見表I :
[0007] 表1 :核酸保護液配方
[0008]

【權利要求】
1. 一種痰紙，包裹痰液后可在常溫下保護痰液中的核酸（DNA和RNA)不被降解。
2. 如權利要求1所述的痰紙上浸潤了核酸保護液，成分包括DTT(DL-Dithiothreitol， 二硫蘇糖醇）、EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸及其二鈉鹽）、 Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）。
3. 如權利要求2所述的核酸保護液，DTT濃度為5mmol/L?500mmol/L，其中最適濃度 為 115mmol/L ?135mmol/L ;EDTA 濃度為 10mmol/L ?1. Omol/L，其中最適濃度為 720mmol/ L ?850mmol/L ;Tris_HCl 濃度為 10mmol/L ?200mmol/L，其中最適濃度為 50mmol/L ? 150mmol/L，最適 pH 為 ρΗ5· 8 ?ρΗ7· 2。
4. 如權利要求1所述的痰紙，由正反面構成，正面浸潤核酸保護液，反面為防水材料。
5. 如權利要求1所述的痰紙，在外形上可以為方形或圓形紙片、信封式或盒式。
6. -種用于提取保存于痰紙上的痰液樣本核酸的裂解液，成分包括 DTT(DL_Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）、EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid， 乙二胺四乙酸及其二鈉鹽）、吐溫 _20 (Tween-20，Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)、曲拉通 X-100 (Triton X-100, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)和鹽酸 狐（Guanidine Hydrochloride)〇
7. 如權利要求6所述的裂解液，DTT濃度為5mmol/L?500mmol/L，其中最適濃度為 215mmol/L ?260mmol/L ;EDTA濃度為 10mmol/L ?1. Omol/L，其中最適濃度為 180mmol/L ? 285mmol/L ;吐溫-20濃度為0. 5%?10%，其中最適濃度為3. 5%?4. 2% ;曲拉通X-100 濃度為〇· 5%?10%，其中最適濃度為3. 8%?4. 5% ;鹽酸胍濃度為2mol/L?6mol/L，其 中最適濃度為4mol/L?6mol/L。
【文檔編號】C12N15/10GK104263721SQ201410481817
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權日:2014年9月19日
【發(fā)明者】唐濤, 周細武, 邱英華 申請人:寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司