重組α-銀環(huán)蛇毒素αBtx的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組α-銀環(huán)蛇毒素αBtx的制備方法，所述方法包括如下步驟：(1)優(yōu)化重組α-銀環(huán)蛇毒素(αBtx)的編碼序列，優(yōu)化后的編碼序列如SEQ ID NO.15所示；(2)以SEQ ID NO.15所示編碼序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組α-銀環(huán)蛇毒素(rαBtx)的表達(dá)載體；(3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建αBtx重組表達(dá)工程菌，培養(yǎng)rαBtx重組表達(dá)工程菌后，以IPTG誘導(dǎo)rαBtx表達(dá)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組Ct -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組α -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] α -銀環(huán)蛇毒素 （a - B ungarotoxin, a Btx)是銀環(huán)蛇（BungarusMulticinctus) 毒液中的重要成分，由73個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為8kDa。aBtx可特異性結(jié)合并阻 斷哺乳動(dòng)物神經(jīng)肌接頭處的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR)，使神經(jīng)-肌肉電化學(xué)偶聯(lián)脫偶 聯(lián)，導(dǎo)致骨骼肌無(wú)法收縮。a Btx對(duì)nAChR有非常高的親和力和特異性，是研究nAChR的理 想工具。以往使用的aBtx均從銀環(huán)蛇的毒液中提取，過(guò)程復(fù)雜、成本昂貴，加之銀環(huán)蛇產(chǎn) 毒量底，因此商品化的a Btx非常昂貴。尋找并建立一個(gè)體外大量獲得a Btx的方法和途 徑是國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室競(jìng)相努力的目標(biāo)。由于a Btx合成加工的特殊性，由5對(duì)分子內(nèi)二 硫鍵交聯(lián)組成的特點(diǎn)，以及原核表達(dá)體系與蛇毒腺細(xì)胞的mRNA密碼子的偏愛(ài)性的不同，缺 乏對(duì)真核基因翻譯后的折疊伴侶，使以a Btx全序列cDNA作原核表達(dá)無(wú)法得到表達(dá)產(chǎn)物， 或即便得到了表達(dá)產(chǎn)物，也不具有野生aBtx的活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組α-銀環(huán)蛇毒素 aBtx的制備方 法。
[0004] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0005] 所述重組a -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的制備方法包括如下步驟：
[0006] (1)優(yōu)化重組a -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的編碼序列，優(yōu)化后的編碼序列如SEQ ID NO. 15所示，命名為BtxV31 ;
[0007] (2)以SEQ ID NO. 15所示編碼序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組a -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的表 達(dá)載體；
[0008] (3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建a Btx重組表達(dá)工程菌，培養(yǎng)a Btx重組表達(dá) 工程菌后，以IPTG誘導(dǎo)a Btx表達(dá)。
[0009] 其中，所述步驟（2)是構(gòu)建含有序列如SEQ ID NO. 1至4所示的表達(dá)載體；含SEQ ID NO. 1所示序列的表達(dá)載體命名BtxNdB，含SEQ ID NO. 2所示序列的表達(dá)載體命名為 BtxNdB2,含SEQ ID N0. 3所示序列的表達(dá)載體命名為BtxNcB，含SEQ ID N0. 4所示序列的 表達(dá)載體命名為BtxNcB2 ;然后以BtxNcB和BtxNcB2為基礎(chǔ)，構(gòu)建含序列SEQ ID N0. 5和6 所示的表達(dá)載體，含SEQ ID NO. 5所示序列的表達(dá)載體命名為BtxT60NcB，含SEQ ID NO. 6所 示序列的表達(dá)載體命名為表達(dá)載體BtxT60NcB2 ;再以BtxT60NcB和BtxT60NcB2為基礎(chǔ)，構(gòu) 建含序列SEQ ID N0. 7至14所示的表達(dá)載體，含SEQ ID N0. 7所示序列的表達(dá)載體命名為 BtxS5NcB，含SEQ ID N0. 8所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS5NcB2,含SEQ ID N0. 9所示序 列的表達(dá)載體命名為BtxS7NcB，含SEQ ID NO. 10所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS7NcB2， 含SEQ ID NO. 11所示序列的表達(dá)載體命名為BtxSllNcB，含SEQ ID NO. 12所示序列的表達(dá) 載體命名為BtxSllNcB2,含SEQ ID NO. 13所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS12NcB，含SEQ ID NO. 14所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS12NcB2。
[0010] 步驟（3)是將表達(dá)載體 BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB、BtxNcB2、BtxT60NcB、 BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、BtxS7NcB、BtxS7NcB2、BtxSllNcB、BtxSllNcB2、 BtxS12NcB或BtxS12NcB2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 BL21 (DE3)，挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化菌落在IPTG條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)a Btx的表達(dá)。
[0011] 在步驟（3)誘導(dǎo)a Btx表達(dá)后，將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液離心，將離心后的菌體裂解后 再離心，得到粗包涵體；將粗包涵體溶解后過(guò)Q Sepharose FF柱，以Bradford法確定aBtx 峰所在組分，合并含有a Btx的組分用于復(fù)性，最后將復(fù)性后的a Btx純化。
[0012] 上述方法中，構(gòu)建重組a-銀環(huán)蛇毒素 aBtx的表達(dá)載體所用引物為SEQ ID NO. 17-23所示的引物。
[0013] 本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述方法中重組a-銀環(huán)蛇毒素 aBtx的表達(dá)載體的試劑 盒，所述試劑盒中包括SEQ ID N0. 17 - 23所示的引物。
[0014] 下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0015] 本發(fā)明將基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)將a Btx的基因編碼序列按照 大腸桿菌偏愛(ài)密碼子重新優(yōu)化合成，并通過(guò)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，進(jìn)一步對(duì)編碼序列進(jìn)行 優(yōu)化突變，最終得到非融合表達(dá)方式的重組a-銀環(huán)蛇毒素 aBtx。然后，利用蛋白質(zhì)復(fù)性 技術(shù)，制備有天然活性的重組a Btx蛋白。
[0016] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明按照重組a-銀環(huán)蛇毒素 a Btx成熟肽的氨基酸序列，然后按 照大腸桿菌偏愛(ài)密碼子合成編碼此氨基酸序列的DNA序列BtxV31 (SEQ ID N0. 15)，然后 按常規(guī)方法將該序列與市售的克隆載體（如PUC57等）構(gòu)建成含有該序列的載體（如 BtxV31-pUC57)，然后以 Btxl6bNcoI(SEQ ID N0. 17)與 Btxl6bBamHI2(SEQ ID N0. 19)為引 物構(gòu)建表達(dá)載體BtxNdB和BtxNdB2，以Btxl6bNcoI(SEQIDN(λl7)與Btxl6bBamHI(SEQID NO. 18)為引物構(gòu)建表達(dá)載體BtxNcB和BtxNcB2 ;這四個(gè)表達(dá)載體區(qū)別是，BtxNcB2編碼的 是核心序列，其余的三個(gè)序列分別在其N(xiāo)末端，C末端加入了融合標(biāo)簽，用于提高表達(dá)產(chǎn)量， BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB和 BtxNcB2 的序列依次如 SEQ ID NO. 1-4所示。再分別以 BtxNcB 和BtxNcB2為基礎(chǔ)，以Btxl6bl67Tu(SEQIDN(λ20)和Btxl6bl67Td(SEQIDN(λ21)為引物 構(gòu)建表達(dá)載體BtxT60NcB和BtxT60NcB2,進(jìn)而分別以前二者為模板，分別以Btxl6S5m(SEQ ID N0.22)，Btxl6S7m(SEQ ID N0.23)為上游引物，以 Btxl6bBamHI(SEQ ID N0.18)為下游 引物，構(gòu)建表達(dá)載體 BtxS5NcB、BtxS7NcB、BtxSllNcB 和 BtxS12NcB，以 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19)為下游引物則構(gòu)建表達(dá)載體 BtxS5NcB2、BtxS7NcB2、BtxSllNcB2 和 BtxS12NcB2 ; BtxT60NcB、BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、BtxS7NcB、BtxS7NcB2、BtxSllNcB、 BtxSllNcB2、BtxS12NcB和BtxS12NcB2的序列如SEQ ID NO. 5-14所示；這幾個(gè)序列都是編 碼能夠表達(dá)相同的aBtx的基因序列，每一個(gè)載體都能夠單獨(dú)起做用，區(qū)別是編碼序列稍 有不同。然后以以上表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、分離raBtx蛋白 質(zhì)，并對(duì)得到的包涵體純化、復(fù)性，純化活性蛋白，最終得到具有生物學(xué)活性的重組a-銀 環(huán)蛇毒素 （r a Btx)。
[0017] 所述的含有按照大腸桿菌偏愛(ài)密碼子優(yōu)化合成的編碼a Btx成熟肽的DNA序列 的表達(dá)載體BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB、BtxNcB2,是含有與上述a Btx編碼DNA 90%以上 的同源性的DNA序列的表達(dá)載體，當(dāng)然，構(gòu)建表達(dá)載體包括但不限于pET、pBV220、pGEX、 pQE等系列載體。對(duì)aBtx編碼序列對(duì)應(yīng)的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到的表達(dá)載體 BtxT60B、BtxT60B2、BtxS5NcB，BtxS5NcB2, BtxS7NcB，BtxS7NcB2, BtxSllNcB，BtxSllNcB2， BtxS12NcB，BtxS12NcB2,同樣是含有與上述aBtx編碼DNA 90%以上的同源性的DNA序列 的表達(dá)載體，當(dāng)然，同樣包括但不限于PET、pBV220、pGEX、pQE等系列載體。
[0018] 含有aBtx原核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，但不限于細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)以及哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。
[0019] 將a Btx表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建a Btx重組表達(dá)工程菌，培養(yǎng)這 些工程菌，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
[0020] r a Btx包涵體的提取中菌體的破碎，超聲前先用含有l(wèi)mg/ml溶菌酶，1 % Triton X-100,10mM 2-ME的緩沖液消化菌體15?30min，再使用超聲法，并在裂菌緩沖液和包涵體 洗滌液中均加入濃度為10mM的2-巰基乙醇。
[0021] r a Btx包涵體的分離純化，即將提取得到的包涵體以含有8M尿素，50mM Tris-HCl (pH8. 6)，10mM 2-巰基乙醇的溶液變性處理后，12000rpm離心取上清，用陰離子 交換層析吸附雜蛋白，所用的離子交換層析柱為Q Sepharose --(1.5\2〇11)，方法為，用含 有50mM Tris-HCl (pH 8. 6)，8M尿素的緩沖液平衡離子交換層析柱，將變性上清上樣，用平 衡緩沖液洗脫，收集穿透液和洗脫液，Bradford法確定蛋白峰。
[0022] r a Btx蛋白質(zhì)的復(fù)性，即以Q S印harose FF吸附后的變性包涵體溶液快速稀釋?zhuān)?使蛋白復(fù)性，包涵體溶液含有50mM Tris-HCI(pH 8·6)，8Μ尿素，將Q S印harose FF吸附后 的變性包涵體快速稀釋到冰冷的復(fù)性液中，使蛋白濃度降低至30?40 μ g/ml，4°C靜置24h 左右，復(fù)性液含有 75mM Tris-HCl (pH 8.8)，16mM 1-半胱氨酸，0.2M NaCl。
[0023] r aBtx蛋白質(zhì)的復(fù)性后的濃縮純化，將稀釋、靜置后的蛋白溶液以超濾膜（截 留分子量lkDa)超濾濃縮約500倍，13000rpm/10min離心，取上清進(jìn)一步分離r a Btx單 體，采用Pharmacia公司的AKTA FPLC系統(tǒng)，以lOOmM醋酸銨緩沖液（pH 4. 8)平衡130ml Superdex 75g PG(1.6X65cm，Pharmacia),然后將濃縮的復(fù)性蛋白樣品上柱，以0.8ml/ min的流速洗脫，收集洗脫液，根據(jù)A280吸收值確定蛋白峰，合并蛋白峰，凍干，再以1. 2ml 20mM醋酸鈉緩沖液（pH 4.8)溶解，將溶解的蛋白樣品加載于以緩沖液A(20mM醋酸鈉緩 沖液（pH 4. 8))平衡的mono S 5/5柱（Pharmacia),以緩沖液B(20mM醋酸鈉緩沖液（pH 4. 8)，1M NaCl)經(jīng)20倍柱體積至100% B，線性梯度洗脫結(jié)合在柱上的蛋白，根據(jù)A28Q吸收 值確定蛋白峰，收集蛋白峰。
[0024] 本發(fā)明通過(guò)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌表達(dá)的r aBtx，通過(guò)稀釋復(fù)性和簡(jiǎn)單的純 化方案，既可得到和天然a-銀環(huán)蛇毒素 aBtX(naBtX)相似的蛋白。由于其生產(chǎn)工藝更 簡(jiǎn)單，成本更低廉，有望取代天然a-銀環(huán)蛇毒素 n a Btx。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是本發(fā)明r a Btx (V31)制備流程圖；
[0026] 圖2是r a Btx(V31)重組表達(dá)載體及對(duì)應(yīng)的表達(dá)蛋白的名稱(chēng)以及蛋白結(jié)構(gòu)域示意 圖；
[0027] 圖3是r a Btx (V31)融合及非融合表達(dá)載體的構(gòu)建；
[0028] 圖 4 是 BtxT60NcB 和 BtxT60NcB2 的構(gòu)建；
[0029] 圖5是r a Btx (V31)編碼基因 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化表達(dá)載體的構(gòu)建；
[0030] 圖 6 是 MGBtxStrtag，MGBtx 和 η a Btx 的反向 HPLC 純度檢測(cè) A :n a Btx ;B :MGBtx ; C：MGBtxStrtag ；
[0031] 圖7是MGBtxStrtag，MGBtx和η a Btx的nAChR特異性結(jié)合活性比較。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1
[0033] -、技術(shù)路線：如圖1所示的r a Btx (V31)制備流程圖：
[0034] 1. a Btx(V31)成熟肽編碼基因的密碼子優(yōu)化合成；
[0035] 2. pET16b_r a Btx重組融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0036] 3. pET16b_r a Btx重組非融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0037] 4. r a Btx非融合表達(dá)編碼序列的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化；
[0038] 5. BL21 (DE3) -r a Btx 工程菌的構(gòu)建；
[0039] 6. r a Btx預(yù)表達(dá)及高表達(dá)克隆的篩選和r a Btx包涵體的分離純化；
[0040] 7. r a Btx蛋白質(zhì)的復(fù)性條件的優(yōu)化和大量復(fù)性制備。
[0041] 8. r a Btx單體蛋白的純化和分離和純度及活性檢測(cè)。
[0042] 二、步驟：
[0043] 1. r a Btx編碼基因的優(yōu)化合成及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0044] ⑴r a Btx編碼基因的優(yōu)化合。
[0045] 根據(jù)a Btx(V31)的氨基酸序列（SEQ ID N0. 16)(如圖2所示），由南京金斯瑞生 物公司按照大腸桿菌偏好密碼子優(yōu)化并在其3'端融合一段編碼（G4Si) 2連接的Strep-tag 的序列（如圖2所示），合成全序列BtxV31，序列如SEQ ID NO. 15所示。
[0046] (2) r a Btx重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0047] ①克隆基因片段的制備：
[0048] 在 1.5ml EP 管 內(nèi)，力口 入 2μ1 Nde I , 2 μ 1 BamH I , 4 μ 1 10XK, 10μ lBtxV31-pUC57, 22μ 1滅菌去離子水，37°C孵育4h，電泳證實(shí)酶切完全后，切膠 回收約300bp的片段，以30μ1無(wú)菌去離子水從柱上洗脫。以2μ1 BtxV31-pUC57質(zhì)粒 為模板，分別加入 2· 5μ 1 引物 Btxl6bNcoI(SEQ ID NO. 17) (25μΜ)與 Btxl6bBamHI2(SEQ ID Ν0·19)(25μΜ)，10μ1 5X PrimeSTAR* Buffer(Mg2+plus)，4yl dNTP Mixture (各 2. 5mM), PrimeSTAR? HS DNA 聚合酶(λ 5μ 1。反應(yīng)條件為 98°C /10s，68°C /lmin(30 循環(huán)）， 電泳，切膠回收約300bp的片段，以30 μ 1無(wú)菌去離子水從柱上洗脫。按前述方法用Ndel， BamHI雙酶切回收的PCR片段20 μ 1，反應(yīng)體系為40 μ 1。電泳，切膠回收約300bp的片段。
[0049] ②Ndel，BamHI雙切載體pET16b的制備：
[0050] 在 1. 5ml EP 管內(nèi)，加入 2μ 1 Ndel，2y 1 BamHI，4y 1 10XK，16μ 1 小提的質(zhì)粒 pET16b，37°C孵育4h，電泳證實(shí)酶切完全后，切膠回收純化線性化片段。以20 μ 1無(wú)菌去離 子水從柱上洗脫。
[0051] ③克隆基因片段與線性化載體pET16b的連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選：
[0052] 分別將第一步回收的兩個(gè)酶切后的300bp片段20. 5μ 1與1μ 1線性化載體 pET16b，2. 5μ1 10XT4連接酶反應(yīng)緩沖液及Ιμ? T4DNA連接酶混勻，16°C孵育16h， 5 μ 1連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化克隆宿主JM109。取200 μ 1轉(zhuǎn)化混合物均勻涂布于含100 μ g/ ml氨芐青霉素的90mm直徑瓊脂板上，37°C溫育過(guò)夜。分別挑取數(shù)個(gè)克隆快速提取質(zhì)粒， 進(jìn)行Ndel，BamHI雙切鑒定分析，確定連接位點(diǎn)正確，將構(gòu)建的載體分別命名為BtxNdB和 BtxNdB2。鑒定完成后，挑取含有正確重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌，大量提取質(zhì)粒，-20°C保存（如圖 3所示）。
[0053] 2. r a Btx非融合表達(dá)載體的構(gòu)建及編碼序列mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化突變。
[0054] ⑴r a Btx非融合表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0055] ①r a Btx編碼序列的PCR克隆及Ncol，BamHI雙酶切：
[0056] 以 2 μ 1 BtxV31-pUC57 質(zhì)粒為模板，分別加入 2. 5 μ 1 引物 Btxl6bNcoI (SEQ ID Ν0·17)(25μΜ)與 Btxl6bBamHI(SEQ ID Ν0·18)(25μΜ)，10μ1 5X PrimeSTAR* Buffer (Mg2+plus)，4 μ 1 dNTP Mixture (各 2. 5mM)，PrimeSTAR? HS DNA 聚合酶 0· 5 μ 1。 反應(yīng)條件為98°C /10s，68°C /lmin(30循環(huán)）。按照相似的方案以引物Btxl6bNcoI與 Btxl6bBamHI擴(kuò)增r a Btx的編碼基因序列，將上述的PCR產(chǎn)物電泳切膠回收，分別取10 μ 1 回收的 PCR 片段，加入 4μ1 10ΧΚ，4μ1 0. l%BSA，2yl NcoI，2yl BamHI，滅菌去離子水 18 μ 1，混勻后37°C孵育4h，電泳回收，以20 μ 1滅菌去離子水從柱上洗脫。
[0057] ②Ncol，BamHI雙切載體pET16b的制備：
[0058] 于 1. 5ml EP 管內(nèi)，加入 2μ 1 NcoI，2y 1 BamHI，16y 1 小提的質(zhì)粒 pET16b，4y 1 10ΧΚ，4μ 1 0. 1% BSA，37°C孵育4h，電泳證實(shí)酶切完全后，切膠回收純化線性化片段。以 20 μ 1無(wú)菌去離子水從柱上洗脫。
[0059] ③克隆基因片段與線性化載體pET16b的連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選：
[0060] 將回收的300bp片段20·5μ1與Ιμ?線性化載體pET16b，2.5yl 10XT4連接酶 反應(yīng)緩沖液及1 μ 1 T4DNA連接酶混勻，16°C孵育16h，5 μ 1連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化克隆宿主 JM109。取200 μ 1轉(zhuǎn)化混合物均勻涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的90mm直徑瓊脂板上， 37°C溫育過(guò)夜。分別挑取數(shù)個(gè)克隆以5ml 2X T T (含1〇〇μ g/ml氨芐青霉素）培養(yǎng)，快速 提取質(zhì)粒，進(jìn)行Ncol、BamHI雙切鑒定分析，確定連接位點(diǎn)正確。將構(gòu)建的載體分別命名為 BtxNcB和BtxNcB2。鑒定完成后，挑取含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌，大量提取質(zhì)粒，-20°C保存 (如圖3所示）。
[0061] ⑵PCR點(diǎn)突變對(duì)表達(dá)序列mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。
[0062] ①將r a Btx (V31)編碼序列第60位G突變?yōu)門(mén) :
[0063] 分別以 2 μ 1 BtxNcB 和 BtxNcB2 質(zhì)粒為模板，加入引物 Btxl6bl67Tu (SEQ ID Ν0· 20)和 Btxl6bl67Td(SEQ ID Ν0· 21) (20mM)各 2· 5μ 1，4μ 1 dNTP 混合物（2. 5mM) 擴(kuò)增，1〇μ1 5XPrimeStar 緩沖液，0. 5μ1 PrimeStar DNA 聚合酶，反應(yīng)條件為 98°C， 68°Clmin(25循環(huán)），反應(yīng)結(jié)束后，分別取Ιμ?擴(kuò)增產(chǎn)物，加入Ιμ? Dpnl，lyl lOXDpnl 緩沖液，9μ 1無(wú)菌去離子水，37°C消化2h后，取5μ 1反應(yīng)液轉(zhuǎn)化克隆宿主菌JM109。挑取 陽(yáng)性克隆測(cè)序。以此方案，將raBtx(V31)編碼序列的G60突變?yōu)棣?0,突變后的表達(dá)載體 命名為BtxT60NcB和BtxT60NcB2 (如圖4所示）。
[0064] ②將r a Btx編碼序列的5 '端進(jìn)行優(yōu)化突變：
[0065] 分別取 0· 1 μ 1 質(zhì)粒 BtxNcB，加入 2· 5μ 1 引物 Btxl6S5m(SEQ ID N0. 22)和引物 Btxl6bBamHI(SEQ ID Ν0·18)(20ηΜ)，4μ1 (1ΝΤΡ(250μΜ)，10μ1 5XPrimeStar 緩沖液， 0. 5μ1 PrimeStar DNA聚合酶，反應(yīng)條件為98°C 15s，68°C lmin(25循環(huán)），回收擴(kuò)增到的 序列，分別取 1〇μ1 回收的 PCR 片段，加入 4μ1 10ΧΚ，4μ1 0.1%BSA，2yl NcoI，2yl BamHI，滅菌去離子水18μ 1，混勻后37°C孵育4h，電泳回收，以30μ 1滅菌去離子水從柱上 洗脫。取20. 5μ1回收后的PCR片段，Ncol和BamHI雙切線性化的pET16b，2. 5μ1 10ΧΤ4 連接酶反應(yīng)緩沖液和1 μ 1 T4DNA連接酶，混勻，16°C孵育16h。以5 μ 1連接混合物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌JM109。取200 μ 1轉(zhuǎn)化混合物均勻涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的90mm直 徑瓊脂板上，37°C溫育過(guò)夜。分別挑取數(shù)個(gè)克隆以5ml 2X T T (含1〇〇μ g/ml氨芐青霉 素）培養(yǎng)，快速提取質(zhì)粒，進(jìn)行Nde、BamHI雙切鑒定分析，確定連接位點(diǎn)正確。鑒定完成后， 挑取含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌，大量提取質(zhì)粒，_20°C保存。將得到的表達(dá)載體分別命名為 BtxSllNcB (如圖5所示），按照類(lèi)似的方案，得到BtxS5NcB、BtxS7NcB和BtxS12NcB。若采 用 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19)為下游引物，則得到 BtxS5NcB2、BtxSllNcB2、BtxS7NcB2 和BtxS12NcB2。經(jīng)測(cè)序證明所構(gòu)建的載體的插入片段與預(yù)期一致，未引入額外突變。
[0066] 3. r a Btx工程菌的構(gòu)建及高表達(dá)克隆的篩選。
[0067] ⑴重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0068] ①感受態(tài)工程菌制備（以下步驟需在無(wú)菌條件下進(jìn)行）：
[0069] a.用接種環(huán)分別從含有工程菌BL21 (DE3)的2XYT瓊脂培養(yǎng)板上挑取單菌落， 接種于含有5ml 2XYT培養(yǎng)基的試管中，37°C /220rpm振蕩培養(yǎng)4?6h，然后分別吸取 0. 1,0. 5, lml上述培養(yǎng)物至100ml 2XYT培養(yǎng)基中，23°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0070] b.第二日測(cè)定培養(yǎng)物0D6(?，取值最為0. 55的一瓶，迅速放在冰浴中15min， 5000rpm/4°C /lOmin離心，收集菌體，盡量吸棄上清，加入30ml冰冷的Inoue轉(zhuǎn)化液（含 有 10mM PIPES，55mM MnCl2，15mM CaCl2, 250mM KC1)，然后 5000rpm/4°C /10min 離心。
[0071] c.小心仔細(xì)吸棄上清液。加入8ml冰冷的Inoue轉(zhuǎn)化液，輕輕吹吸重懸。200 μ 1/ 支分裝于1. 5ml預(yù)冷的ΕΡ管中，然后每管加入14μ 1 DMS0,輕彈混勻，于冰上放置約5min, 液氮速凍。于液氮中保存。
[0072] ②重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌：
[0073] a.取感受態(tài)菌200μ 1，握在手心中解凍，50μ 1/支分裝于預(yù)冷的EP管中，加入重 組質(zhì)粒（這里指的是BtxSllNcB2或BtxS12NcB2) 0. 5 μ 1，輕輕指彈，使之混勻，在冰浴上放 置 20min。
[0074] b. 42°C水浴靜置 90s。
[0075] c.每管加 37°C預(yù)熱的 2XYT 培養(yǎng)基 800 μ 1，140rpm/37°C震搖 40min。
[0076] d.取200 μ 1轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于含氨芐青霉素（100 μ g/ml) 2 XYT瓊脂板表面。37°C 倒置培養(yǎng)12h以上，待菌落形成后取出，4°C冰箱保存。
[0077] ③重組表達(dá)載體的預(yù)表達(dá)分析：
[0078] 挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落以5ml含100 μ g/ml的2XYT培養(yǎng)液小量培養(yǎng)至0D6(KI ~ 0. 8 時(shí)，
[0079] 加入IPTG至ImM，繼續(xù)培養(yǎng)4h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析，籍此挑選高表達(dá)克 隆。
[0080] 4. r a Btx蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化。
[0081] ⑴重組蛋白的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。
[0082] 挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)菌落克隆至5ml含氨芐青霉素（100 μ g/ml)的 2XYT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)4?6h左右，當(dāng)0D6(KI。0. 8時(shí)，取3ml接種于31含氨芐青霉素 (100μ g/ml)的 2XYT 培養(yǎng)基中，260rpm/37°C 震搖培養(yǎng)，0D6QQ ~ L 0 時(shí)加入 IPTG 至 ImM，繼 續(xù)震搖4h，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。然后離心（10000rpm/5min)，棄上清，將菌體凍存于-20°C備 用。
[0083] ⑵菌體破碎。
[0084] 解凍菌體，加入 30ml 含有 50mM PBS，10mM 2-ME, 1 % Triton X-100, lmg/ml 溶菌酶 的裂菌液，吹打菌體混勻，冰上放置15min消化裂解菌體，然后以50%波幅，按照占3s/空 12s/總5min的方案，于冰上超聲裂解菌體并切斷基因組DNA。10000rpm/4°C /lOmin離心 收集沉淀，重復(fù)以上步驟1遍，棄上清。然后加入30ml含50mM PBS，10mM 2-ME，1% Triton X-100的包涵體洗液，劇烈吹吸沉淀，10000rpm/4°C /5min離心，棄上清，重復(fù)上述步驟3遍， 即得到粗包涵體。
[0085] ⑶包涵體的粗提取和純化。
[0086] 以 30ml 含 50mM Tris-HCl (pH 8. 6)，8M 尿素，10mM 2-ME 的緩沖液溶解包涵體， 室溫下震蕩約2h，使包涵體溶解。15000g/10min離心，將上清加載于吸附緩沖液（50mM 1'1^8-!1(]1&!18.6)，81尿素）平衡后過(guò)的(>)36。1^1'〇86--柱（4\2.8〇11)，收集穿透液，再 以吸附緩沖液洗30ml，以Bradford法確定蛋白峰所在組分，合并含有蛋白的組分，用于復(fù) 性。
[0087] 5. r a Btx蛋白質(zhì)的復(fù)性條件的優(yōu)化。
[0088] ⑴透析復(fù)性r a Btx (MGBtxStrtag)條件的優(yōu)化。
[0089] 將Q Sepharose FF吸附后的MGBtxStrtag裝入透析袋（截留分子量3kDa),于4°C 下分別對(duì)冰冷的折疊緩沖液透析過(guò)夜。折疊緩沖液包括以下四種：①去離子水；②5mM2-巰 基乙醇；③0. 5M NaCl ;④0. 5M NaCl和1% Tween-20。然后對(duì)冰冷的去離子水透析4h，重 復(fù)一次。最后將透析后的蛋白溶液13000rpm/4°C /lOmin離心，將上清以超濾管（截留分子 量3kDa)濃縮。以非還原SDS-PAGE分析上清中的可溶性蛋白。
[0090] ⑵快速稀釋復(fù)性r a Btx (MGBtxStrtag)的條件優(yōu)化。
[0091] 配制以下緩沖液，分別含有①75mM Tris-HCl(pH?8. 8);②75mM Tris-HCl(pH? 8. 8)和 0· 2M NaCl (pH ?8. 8);③ 75mM Tris-HCl (pH ?8. 8)和 0· 5M NaCl ;④ 0· 5M NaCl。 在以上緩沖液中加入不同濃度的1-半胱氨酸，以此作為折疊液。分別取〇. 5ml上述的折疊 緩沖液，加入lOul Q Sepharose FF吸附后的MGBtxStrtag(蛋白濃度大約2mg/ml)，使蛋 白終濃度約為30?40μ g/ml。4°C靜置放置7d左右，13000rpm/4°C /lOmin離心，取50μ 1 折疊產(chǎn)物做nAChR125I_ a Btx結(jié)合抑制試驗(yàn)。
[0092] 6. r a Btx的大量制備及純化。
[0093] ⑴r a Btx包涵體的快速稀釋復(fù)性。
[0094] 將 Q Sepharose FF 吸附后的 r a Btx (MGBtxStrtag 或 MGBtx)溶液按照 1 :50 (v/ v)的比例快速稀釋于冰冷的復(fù)性液（含75mmol/l Tris-HCl(pH 8·8)，0·2Μ NaCl，16mM 半胱氨酸）中，4°C靜置24h以上，然后以超濾膜（截留分子量lkDa)超濾濃縮約500倍。 13000rpm/10min離心，取上清進(jìn)一步分離r a Btx單體。
[0095] ⑵復(fù)性后的r a Btx的純化。
[0096] 采用Pharmacia公司的AKTA FPLC系統(tǒng)，以lOOmM醋酸銨緩沖液（pH 4. 8)平衡 130ml Superdex 75g PG(1.6X70cm，Pharmacia),然后將濃縮的復(fù)性蛋白樣品上柱，以 0. 8ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，根據(jù)A28(l吸收值確定蛋白峰。合并蛋白峰III，凍干， 再以1. 2ml 20mM醋酸鈉緩沖液（pH 4. 8)溶解。將溶解的蛋白樣品加載于以緩沖液A(20mM 醋酸鈉緩沖液（pH 4. 8))平衡的mono S 5/5柱（Pharmacia)，以緩沖液B(20mM醋酸鈉緩沖 液（pH 4.8)，1M NaCl)經(jīng)20倍柱體積至100 % B，線性梯度洗脫結(jié)合在柱上的蛋白。根據(jù) A28(l吸收值確定蛋白峰，收集蛋白峰，以非還原SDS-PAGE分析每一步的可溶性蛋白。
[0097] 本發(fā)明的關(guān)鍵之一在于復(fù)性緩沖液的配方，S卩：75mM Tris-HCl(pH 9)，0. 2M NaCl, 16mM半胱氨酸，經(jīng)過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，證實(shí)此配方用于折疊 r a Btx效果最佳。
[0098] 7.純度測(cè)定。
[0099] 以 Waters 1525 高效液相色譜儀，采用反相柱（XTerra?RP185ym，4. 6X150mm) 分析mono S柱純化的到的MGBtxStrtag和MGBtx。試驗(yàn)方案為：流速lml/min，以緩沖液 98%A(0. 1%三氟乙酸），2%B(0. 1%TFA，99. 9%乙腈）平衡柱，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，上樣。然 后30min內(nèi)至62% B線性梯度洗脫，最后以90% B洗柱10min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm(如圖6所 示），結(jié)果顯示，ra Btx與na Btx的洗脫行為非常相似，純度達(dá)到95%以上。
[0100] 8.活性測(cè)定。
[0101] (l)125I#EnaBtx。
[0102] ①準(zhǔn)備工作：將裝有Na125I溶液的鉛罐置于冰上預(yù)冷約半小時(shí)，同時(shí)以 lml/ 管的量分裝 Triton 緩沖液（含 0· 5 % TritonX-100,10mM 疊氮鈉，10mMPBS(pH 7.5)，100mMNaCl) ;1.6mMChloramineT(氯氨 T)，分大約 10 管。以 25ml Triton buffer 平 衡ro-10脫鹽柱。取4. 5mg氯氨T溶解于10ml去離子水中，新鮮配制，避光。
[0103] ②標(biāo)記：取20 μ 1 Na125I溶液，打入預(yù)冷的EP管中，然后加入60 μ 1 0. 5M PBS (ρΗ7· 5)，混勻，然后加入100 μ 1 a Btx (3. 5mg/ml)，輕彈，混勻，再加入20 μ 1氯氨Τ，混 勻,放冰上，放置5min,然后移入4冰箱，放置20min,不時(shí)輕彈混勻。
[0104] ③脫鹽去除游離的125廠離子：加入100 μ 1 PBS，混勻。加載于預(yù)先平衡好的ro - 10柱上，棄穿透液。以Triton緩沖液洗脫，lml/tube收集穿透液。
[0105] ④計(jì)算特異性活度：分別取5 μ 1穿透液稀釋于1ml Triton緩沖液中，取10 μ 1稀 釋液測(cè)定cpm值。合并高值峰，然后以同樣的方法測(cè)定cpm值。若標(biāo)記的效率按100%算，蛋 白濃度為x(mg/ml)，體積為：v(ml)，蛋白的分子量為8000, cpm值為c。則標(biāo)記的125I- a Btx 的特異性活度為：SA = 1.6X10nXC/x。
[0106] ⑵去神經(jīng)支配大鼠骨骼肌nAChR提取物的制備。
[0107] ①準(zhǔn)備工作：配制一下溶液：肌肉裂解母液（含0· 1M NaCl，0. 01M PBS(pH 7. 5)， 0· 01NaN3, 0· 01M EDTA, 0· 01M EGTA)和 20% Triton X-100 溶液（含 0· 1% EDTA)，提前置 于4°C冰箱預(yù)冷。1M碘乙酰胺，200mM PMSF(溶解于異丙醇中），-20°C凍存。
[0108] ②大鼠雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)離斷：取800g左右的雄性SD大鼠，于戊巴比妥麻醉 下雙側(cè)離斷坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)，縫合好傷口，飼養(yǎng)l〇d后，處死，取雙下肢骨骼肌，液氮速凍 后保存于_45°C，備用。
[0109] ③骨骼肌nAChR提取物的制備：大鼠肌肉破碎前以肌肉裂解母液，1M碘乙酰胺和 lOOmM PMSF 溶液配制肌肉裂解液（含 O.IM NaCl，0.01M PBS(pH 7·5)，0·01Μ NaN3,0.01M EDTA，0. 01M EGTA，0. 01M碘乙酰胺，ImM PMSF。溶液配制好以后。稱(chēng)取150g凍存的去神經(jīng) 支配大鼠骨骼肌，加600ml肌肉裂解液，以高速攪拌機(jī)（Philip HR2094)的最高速打碎肌肉 組織，直至大塊肌肉組織消失，然后17, 000g/4°C /30min離心，棄上清，加入150ml肌肉裂解 液和 20ml 20% Triton X-100 溶液，于 4°C震蕩 1 - 4 小時(shí)。然后 17000g/4°C /30min 離 心，棄沉淀，進(jìn)一步取上清以l〇〇〇〇〇g/4°C /30min離心以去除脂質(zhì)。最后小心以注射器吸取 剩下的清亮溶液，加入溶液1/10總體積的甘油，混勻，以〇. 5ml/支凍存于-70°C冰箱中。
[0110] ⑶raBtx蛋白質(zhì)的活性測(cè)定。
[0111] 取大鼠骨骼肌nAChR提取物0.5ml，室溫下解凍后放置于冰上，然后加入 1 μ lmab35 (5. 3mg/ml)，1 μ 11251_ a Btx 及不同量的 r a Btx 或 n a Btx，混勻后 4°C孵育過(guò)夜， 然后加入兔抗大鼠 IgG 10μ 1，4°C孵育2h，13000rpm/5min離心收集沉淀，盡棄上清。然后 以 Triton 緩沖液（含 0· 5% TritonX-100,10mM 疊氮鈉，10mMPBS(pH 7. 5)，lOOmMNaCl)洗 滌沉淀兩遍。最后以Y計(jì)數(shù)儀測(cè)定沉淀的cpm值，據(jù)此判斷raBtx的活性。
[0112] 以含有1% Triton X-100的緩沖液提取去神經(jīng)支配大鼠肌肉的nAChR。以放免沉 淀法測(cè)定r a Btx和n a Btx與nAChR的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。可知MGBtx的nAChR結(jié)合活力等于甚 至高于n a Btx,而MGBtxStrtag的nAChR結(jié)合活力略低于n a Btx (如圖7所示）。
【權(quán)利要求】
1. 重組α-銀環(huán)蛇毒素 aBtx的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 優(yōu)化重組α -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的編碼序列,優(yōu)化后的編碼序列如SEQ ID NO. 15 所示； (2) 以SEQ ID NO. 15所示編碼序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組α-銀環(huán)蛇毒素 （ra Btx)的表達(dá) 載體； (3) 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建r a Btx重組表達(dá)工程菌，培養(yǎng)r a Btx重組表達(dá)工 程菌后，以IPTG誘導(dǎo)r a Btx表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)是構(gòu)建含有序列如SEQ ID NO. 1至4所示的表達(dá)載體；含SEQ ID NO. 1所示序列的表達(dá)載體命名BtxNdB，含SEQ ID NO. 2所示序列的表達(dá)載體命名為BtxNdB2,含SEQ ID NO. 3所示序列的表達(dá)載體命名為 BtxNcB，含SEQ ID NO. 4所示序列的表達(dá)載體命名為BtxNcB2 ;然后以BtxNcB和BtxNcB2為 基礎(chǔ)，構(gòu)建含序列SEQ ID NO. 5和6所示的表達(dá)載體，含SEQ ID NO. 5所示序列的表達(dá)載體 命名為BtxT60NcB，含SEQ ID NO. 6所示序列的表達(dá)載體命名為表達(dá)載體BtxT60NcB2;再以 BtxT60NcB和BtxT60NcB2為基礎(chǔ)，構(gòu)建含序列SEQ ID NO. 7至14所示的表達(dá)載體，含SEQ ID NO. 7所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS5NcB,含SEQ ID NO. 8所示序列的表達(dá)載體命名為 BtxS5NcB2,含SEQ ID NO. 9所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS7NcB，含SEQ ID NO. 10所示序 列的表達(dá)載體命名為BtxS7NcB2,含SEQ ID NO. 11所示序列的表達(dá)載體命名為BtxSllNcB， 含SEQ ID NO. 12所示序列的表達(dá)載體命名為BtxSllNcB2,含SEQ ID NO. 13所示序列的表 達(dá)載體命名為BtxS12NcB，含SEQ ID NO. 14所示序列的表達(dá)載體命名為BtxS12NcB2。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3)是將表達(dá)載體BtxNdB、BtxNdB2、 BtxNcB、BtxNcB2、BtxT60NcB、BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、BtxS7NcB、BtxS7NcB2、 BtxSllNcB、BtxSllNcB2、BtxS12NcB 或 BtxS12NcB2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 后的大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化菌落在IPTG條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)a Btx 的表達(dá)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟（3)誘導(dǎo)a Btx表達(dá)后，將誘導(dǎo) 培養(yǎng)后的菌液離心，將離心后的菌體裂解后再離心，得到粗包涵體；將粗包涵體溶解后過(guò) QSepharose FF柱，以Bradford法確定aBtx峰所在組分，合并含有aBtx的組分用于復(fù) 性，最后將復(fù)性后的a Btx純化。
5. 如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，構(gòu)建重組a -銀環(huán)蛇毒素 a Btx的 表達(dá)載體所用引物為SEQ ID NO. 17 - 23所示的引物。
6. -種構(gòu)建權(quán)利要求5所述方法中重組α-銀環(huán)蛇毒素 a Btx的表達(dá)載體的試劑盒， 其特征在于，所述試劑盒中包括SEQ ID NO. 17 - 23所示的引物。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104232653SQ201410481647
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】徐江, 陳永恒, 陳主初, 陳林, 李柱一, 徐志凱, 吳興安, 李佳, 李俊 申請(qǐng)人:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院